一种获得芸薹属A基因组蔬菜新种质的方法及应用方法

摘要

本发明公开了一种获得芸薹属 A 基因组蔬菜新种质及应用方法，通过对芸薹属 A 基因组“大白菜亚种×小白菜亚种”或“小白菜亚种内变种×变种”蔬菜间杂交种进行游离小孢子培养获得再生植株从而创造新种质并应用于育种的方法，主要步骤包括：“大白菜亚种×小白菜亚种”、“小白菜亚种内变种×变种”蔬菜杂交过程，游离小孢子培养胚状体诱导过程，胚状体萌发获得再生植株过程，对小孢子培养获得的再生植株倍性鉴定过程，对双单倍体、高倍体留种过程，种植再生植株的后代进行形态鉴定、营养指标鉴定过程，配制杂交组合过程。该方法具有周期短、效率高的优点，为白菜类蔬菜高效育种提供了材料，具有广阔的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术与单倍体育种技术领域，具体说，涉及一种通过游离小孢子培养方法快速获得芸薹属A基因组蔬菜新种质并应用于育种的方法。

背景技术

芸薹属A基因组(2n＝2x＝20)蔬菜，分为小白菜亚种和大白菜亚种，小白菜亚种包括奶白菜、乌塌菜、菜心、小菘菜、油菜、矮脚黄、蕾用菜等，此亚种的特点为叶片开张、株型矮小、具明显的叶柄，多数叶片光滑无毛，无明显叶翼，不形成明显叶球。大白菜亚种分化为散叶变种半结球变种、花心变种、结球变种，特点为株型较大，有明显的叶柄和叶翼，叶面多不光滑、除散叶变种外，均可形成叶球。亚种之间和亚种内变种之间蔬菜性状差异很大，由于染色体条数一样，亚种之间和亚种内变种之间杂交不存在障碍，易获得种子。通过有性杂交可以将不同亚种、变种蔬菜的优点综合起来，杂交后代在基因型上是高度杂和的，而优势杂交育种中需要的高度纯和的亲本，用常规方法自交、分离选择再连续自交好几个世代，费工、费时。随着人们生活水平的提高，传统方法用变种内、品种间杂交，难以满足市场需要的高产、优质、形状新奇的蔬菜的要求，而对亚种之间和亚种内变种之间杂种进行游离小孢子培养则可以快速获得双单倍体纯系，且纯系之间差异很大，提供了更大的选择范围，解决这一问题，满足育种工作的需要。

截止目前，在几乎所有芸薹属作物上均有小孢子培养成功的报道，1989年，日本学者Sato等在进行大白菜游离小孢子培养时获得了再生植株，1992年，曹鸣庆等首次报道小白菜游离小孢子培养获得成功，1996年，李光涛获得了紫菜薹再生植株，此外，乌塌菜等也有培养成功的报道。基于芸薹属A基因组作物亚种之间和亚种内变种蔬菜间杂交不存在障碍和在小孢子培养方面取得的进展，本发明以芸薹属‘大白菜亚种×小白菜亚种’、‘小白菜亚种内变种×变种’杂交种作为小孢子培养的供体植株，对小孢子培养体系进行大量的试验，获得了很多再生植株，配制了杂交组合。

发明内容

本发明的目的是提供一种获得芸薹属A基因组蔬菜新种质的方法及应用方法，是将传统的有性杂交技术和细胞培养技术结合起来，进行亚种之间和亚种内变种之间蔬菜杂交，通过游离小孢子培养方法对F₁或经筛选的符合育种目标的F₂培养，从而获得再生植株，并应用于育种。

本发明提供的获得芸薹属A基因组蔬菜新种质的方法如下：

A、对芸薹属‘大白菜亚种×小白菜亚种’或‘小白菜亚种内变种×变种’蔬菜进行杂交获得F₁种子，种植F₁并自交获得F₂；

B、在温室中培养F₁和F₂，F₁和F₂的种子经过2～4℃低温处理20～25天，在开花期对F₁和F₂代中筛选出的符合育种目标的植株进行游离小孢子培养，接种小孢子后需33℃暗培养1天，再转至25℃培养箱静置暗培养10～15天，肉眼可见胚状体后，将培养皿转移到转数为40～60转/分钟摇床上继续暗培养，培养温度为25℃；

C、将子叶期胚状体转接到MS培养基以获得再生植株；

D、将再生植株接种到MS培养基上进行人工诱导生根，待再生植株生根后，移栽到温室，温室温度白天应为20～25℃，夜间温度应为于5～10℃；

E、经50～70天后，再生植株开始开花，鉴定再生植株倍性，单倍体植株用秋水仙碱处理，使其加倍，双单倍体植株、高倍体植株保留；

F、对双单倍体植株、高倍体植株自交授粉，获得种子，同时测定亲和指数；

G、种植双单倍体、高倍体自交种子，根据育种目标，鉴定植株株高、叶长、叶色等外观性状，钙、镁、维生素C诸营养指标，抗病、抗逆性。

在B步骤中，对F₁和F₂植株进行游离小孢子培养，选取花瓣长度与花药长度比值为0.5～0.75的未开放花蕾，在超净工作台内表面灭菌后，用蒸流水冲洗3遍，倒入蔗糖浓度为130g/L的B5培养基，挤碎花蕾，使小孢子游离出来，含小孢子的悬浮液用400目孔径的尼龙网过滤，收集滤液于10mL离心管中，1000rpm离心3min；弃去上清液，重复2次；用NLN培养基稀释小孢子，接种细胞密度1×10⁵～2×10⁵个·mL^-1，以每皿5mL小孢子悬浮液分装入60mm×15mm的无菌玻璃培养皿内，每皿添加100μL高温湿热灭菌后的琼脂糖0.5g·L^-1、活性炭10g·L^-1混合液；NLN培养基为含130g/L蔗糖，无任何激素的NLN培养基，或在NLN培养基添加0.05mg/L～0.2mg/L的6-BA，或在NLN培养基添加0.05mg/L～0.2mg/L的6-BA与NAA。

在C步骤中，诱导再生植株的MS培养基为含蔗糖30g/L，琼脂6.5g/L～7.5g/L，pH值为5.8～6.0，无任何激素的MS培养基；D步骤中，生根培养基为MS培养基，含蔗糖30g/L，琼脂5.0g/L，NAA0.1～0.2mg/L，pH值为5.8～6.0。

本发明提供的芸薹属A基因组蔬菜新种质的应用方法：将双单倍体品系直接作为品种应用，或作为亲本与雄性不育系配制杂交组合，或者选两个自交不亲和系配制杂交组合。

本发明的有益效果是：1、与常规方法品种内杂交相比，采用芸薹属‘大白菜亚种×小白菜亚种’或‘小白菜亚种内变种×变种’杂交，可以获得更多有利用价值的蔬菜新类型。2、与常规连续多代自交的方法获得纯系比较，游离小孢子培养的方法培育纯系周期短，效率高，一代就可以获得双单倍体纯系。3、游离小孢子方法获得的纯系间差异较大，提高了获得符合育种目标纯系的机率。4、本发明获得的纯系，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是亲本乌塌菜形态照片示意图。

图2是亲本大白菜形态照片示意图。

图3是‘大白菜与乌塌菜’的杂交种F₁(小孢子培养供体材料)形态照片示意图。

图4是‘大白菜与乌塌菜’的杂交种F₁小孢子培养获得的再生植株之一形态照片示意图。

图5是‘大白菜与乌塌菜’的杂交种F₁小孢子培养获得的再生植株之二的形态照片示意图。

图6是‘大白菜与乌塌菜’的杂交种F₁小孢子培养获得的再生植株之三形态照片示意图。

具体实施方式

本发明提供的获得芸薹属A基因组蔬菜新种质并应用于育种的方法包括：‘大白菜亚种×小白菜亚种’、‘小白菜亚种内变种×变种’杂交过程，游离小孢子培养过程，对小孢子培养获得的再生植株倍性鉴定，对双单倍体、高倍体留种过程，种植再生植株的后代进行形态鉴定、营养指标鉴定过程，配制杂交组合过程。

具体方法步骤如下：

A、芸薹属‘大白菜亚种×小白菜亚种’或‘小白菜亚种内变种×变种’杂交过程：根据育种目标，确定亲本，开花期杂交，获得F₁种子，种植F₁，自交获得F₂；亲本选定为：大白菜(见图2照片)、乌塌菜(见图1照片)、蕾用菜、矮脚黄。

游离小孢子培养材料分别是‘大白菜×乌塌菜’(见图3照片)、‘乌塌菜×蕾用菜’以及‘乌塌菜×矮脚黄’，F₁代以及F₂代植株。

B、游离小孢子培养过程：

从2009年9月初开始，每隔一个月分批对F₁和F₂种子催芽，萌动后进行2～4℃低温处理20～25天，然后将萌动种子播于穴盘，5～6片叶时栽植于花盆在温室中培育。在开花期进行游离小孢子培养，小孢子分离方法选取花瓣长度与花药长度比值为0.5～0.75的未开放花蕾，以30个为一组，流水冲洗30min，经70％乙醇溶液表面消毒30s后，用0.1％HgCl₂溶液消毒8min，用蒸馏水冲洗3次，每次5min。消毒后的花蕾放入灭过菌的小烧杯内，加少量蔗糖含量为130g/L的B₅培养基，用无菌研棒碾压花蕾，挤出小孢子。含小孢子的悬浮液用40μm孔径的尼龙网过滤，除出大组织块，收集滤液于10mL离心管中，1000rpm下离心3min。弃去上清液，沉淀物加5mLB₅洗涤培养基，摇匀，1000rpm下离心3min。弃去上清液，重复2次，所得沉淀物即为纯净小孢子。小孢子培养：将纯化后的小孢子用NLN培养基稀释，保持细胞密度1×10⁵～2×10⁵个·mL^-1，以每皿5mL小孢子悬浮液分装入为60mm×15mm的无菌玻璃培养皿内，每皿添加100μL高温湿热灭菌后的琼脂糖0.5g/L、活性炭10g/L混合液；用石蜡膜封口，先在33℃恒温箱中暗培养1天，，再转至25℃下静置暗培养。10～15天后，肉眼可见胚状体出现，转移到40～60转/分钟摇床上继续暗培养，培养温度为25℃。NLN培养基为含130g/L蔗糖，无任何激素的NLN培养基，或在NLN培养基添加0.05mg/L～0.2mg/L的6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)，或在NLN培养基添加0.05mg/L～0.2mg/L的6-BA与NAA(α-萘乙酸)。

C、植株再生过程

将子叶期胚状体接种到MS培养基上。于25℃，16h/8h光周期下培养。MS培养基为含蔗糖30g/L，琼脂6.5g/L～7.5g/L，pH值为5.8～6.0，无任何激素的MS培养基，获得再生植株。

D、再生植株的生根及移栽

小孢子胚状体形成的再生植株，自然生根的根系较弱，不易成活，需要进行人工诱导生根，将其接种到MS培养基上，MS培养基含蔗糖30g/L，琼脂5.0g/L，NAA0.1～0.2mg/L，pH值为5.8～6.0。

根系发育较好的植株移栽到温室。此时，温室内温度白天应为20～25℃，晚间温度应为5～10℃；

E、倍性鉴定过程

经50～70天后，再生植株开始开花，鉴定再生植株倍性，单倍体植株用秋水仙碱处理，使其加倍，双单倍体植株、高倍体植株保留；采用植株外部形态观察和花粉育性鉴定的方法判断再生植株的倍性。花粉活力及花粉粒大小鉴定时，取即将开花的花蕾，剥取花药置于洁净的载玻片上，加1～2滴TTC(2，3，5-氯化三苯基四氮唑)染液，用镊子挤出花粉，去除杂质，搅匀后盖上盖玻片，置于35℃恒温箱中，10～15min后镜检，每片随机取3个视野，统计各视野中花粉粒总数与染红花粉粒数，计算花粉的染色率。经TTC染液染色变红的花粉生活力强，为可育花粉；淡黄色及无色的活力较弱或没有活力，为不育花粉。

F、对双单倍体植株、高倍体植株自交授粉，获得种子，同时测定亲和指数；

G、种植双单倍体、高倍体自交种子，根据育种目标，鉴定植株株高、叶长、叶色等外观性状，钙、镁、维生素C等营养指标，抗病、抗逆性；

应用方法：根据市场的需要将双单倍体品系直接作为品种应用，或作为亲本与雄性不育系配制杂交组合，或者选两个自交不亲和系配制杂交组合。

试验结果：

1、同基因型杂交组合小孢子培养胚诱导结果

基因型是影响小孢子胚发生的重要因素，在培养基都是NLN时，供试材料均获得了胚状体，但不同亲本杂交所得的F₁代小孢子胚的诱导率差异很大(表1)，F₂代由于各单株间胚状体诱导率不同，未做统计分析。

表1不同供体材料对小孢子胚状体诱导率的影响

注：表中数据为3次重复平均值，邓肯新复极差测验，不同小写字母为差异达极显著(α＝0.05)

2、植物生长调节剂对胚状体发生的影响

添加6-BA或6-BA与NAA配比有利于胚状体产生，最适的浓度为‘0.1mg/L6-BA+0.05mg/L NAA’(表2)。

表2植物生长调节剂对‘乌塌菜×蕾用菜’胚状体发生的影响

注：表中数据为3次重复平均值邓肯新复极差测验，不同小写字母为差异达极显著(α＝0.05)

3、胚状体萌发，再生植株的获得

为了获得大量的双单倍体，进行了多次试验，共得到胚状体664个，转到MS培养基中，胚状体继续发育，形成再生植株375株。

4、植物生长调节剂NAA对试管苗生根的影响

直到外界温度适宜时对试管苗进行生根、移栽到温室。在MS的培养基上，添加NAA0.1mg/L～0.15mg/L，培养12d就有根出现，且根系强壮，数量多。无根的再生植株随着继代次数的增加会自然生根，但这样的根一般非常细弱，移栽不易成活，需要添加激素诱导生根。通过对再生植株生根率比较表明，以NAA 0.1mg/L的生根培养效果最好(表3)。琼脂含量的多少影响小孢子植株移栽，琼脂含量少，培养基则较软，移栽时洗根比较容易，琼脂含量多，培养基硬，洗根时易将须根弄断。经试验，确定“MS+NAA 0.1mg/L+30g/L蔗糖+5.0g/L琼脂”是小孢子植株生根的适宜培养基。

表3NAA对试管苗生根的影响

5、再生植株倍性鉴定

采用植株外部形态观察和花粉育性鉴定的方法判断再生植株的倍性。单倍体植株长势弱，花蕾瘦弱，花药干瘪，花粉极少。双单倍体植株健壮，花蕾发育良好，花粉较多。高倍体植株花蕾硕大，易出现裂蕾现象，花粉比双单倍体大且形状不规则。

单倍体植株产生的花粉高度败育；双单倍体植株产生的花粉活力高，发育正常；多倍体植株产生的花粉会发生一定程度的败育，且花粉粒明显大于二倍体花粉。对双单倍体和高倍体植株授粉并测定亲和指数。

6、双单倍体、高倍体田间形态学性状调查

2010年8月5日将获得的双单倍体和高倍体种子播于田间，获得部分再生植株形态如图4，图5，图6所示。

7、应用

这些植株具有叶片亮绿，形态新奇的优点，可以直接作为品种应用，或根据亲和指数测定结果，利用自交不亲和系之间配制杂交组合，与雄性不育系配制杂交组合。