抑制肿瘤生长及血管生成的寡聚核酸组合物及其应用

摘要

本发明公开了一组抑制肿瘤生长及血管生成的寡聚核酸组合物及其应用。本发明提供的寡聚核酸组合的主要成分是一种双链RNA，其中：所述双链RNA的第一条链的核苷酸序列如序列表中序列1所示；第二条链的核苷酸序列与所述第一条链的反向互补链具有63.6％以上的同源性。本发明提供的寡聚核酸组合作为新型小核酸类的抗肿瘤药物，组合中所有的寡聚核酸成分均为化学合成并修饰的寡聚核酸，其特点是不易被降解，有较长的效应半衰期，能用于体外实验，更能用于体内治疗。部分寡聚核酸组合较单一成分有好的抗肿瘤效果。

说明书

技术领域

本发明涉及抑制肿瘤生长及血管生成的的寡聚核酸组合物及其应用。

背景技术

微小核酸(miRNA)是一类非编码小核酸，在体内广泛表达，调节机体重要的生理与病理过程。微小核酸与肿瘤的发生、发展和预后密切相关。近年来的研究发现，miRNA在肿瘤组织和与正常组织间的表达明显不同。miRNA既可以作为原癌基因促进肿瘤的发生发展，又能作为抑癌基因抑制肿瘤的发生发展，根据miRNA调节肿瘤发生发展的不同机理，将它们组成不同的配方或将它们与其它抗肿瘤的小干扰RNA(siRNA)组成不同的配方，将比单一的miRNA更能有效地治疗肿瘤性疾病。

发明内容

本发明的目的在于提供一种寡聚核酸。

本发明提供的寡聚核酸是一种双链RNA，其中：所述双链RNA的第一条链的核苷酸序列如序列表中序列1所示；第二条链的核苷酸序列与所述第一条链的反向互补链具有63.6％以上的同源性。序列1从左至右方向为5’-3’。

上述第二条链的核苷酸序列可以如序列表中序列2或3所示。序列2和3从左至右方向为3’-5’。

上述寡聚核酸经过如1)或2)修饰得到的寡聚核酸：

1)对所述寡聚核酸的连接核苷酸的磷酸二酯键进行修饰，优选将所述磷酸二酯键的氧用硫取代；

2)对所述寡聚核酸的核糖的2’-OH的修饰，优选将所述2’-OH用甲氧基或氟取代或者对所述2’-OH进行脱氧修饰。

表达出上述的寡聚核酸的DNA也属于本发明的保护范围之内。

本发明的另一目的在于提供一种抑制肿瘤生长的药物组合物。

本发明提供的抑制肿瘤生长的药物组合物的活性成分是寡聚核酸组合物，可以是如下a)或b)或c)：

a)由VEGF-siRNA或其修饰体与上述的寡聚核酸组成；

b)由PTN-siRNA或其修饰体与上述的寡聚核酸组成；

c)由VEGF-siRNA或其修饰体、PTN-siRNA或其修饰体与上述的寡聚核酸组成；

所述VEGF-siRNA是双链核苷酸，所述VEGF-siRNA的第一条链的核苷酸序列如序列表中序列4所示，所述VEGF-siRNA的第二条链的核苷酸序列如序列表中序列5所示；序列4从左至右方向为5’-3’，序列5从左至右方向为3’-5’。

所述PTN-siRNA是双链核苷酸，所述PTN-siRNA的第一条链的核苷酸序列如序列表中序列6所示，所述PTN-siRNA的第二条链的核苷酸序列如序列表中序列7所示；序列6从左至右方向为5’-3’，序列7从左至右方向为3’-5’。

所述VEGF-siRNA的修饰体是经过如下1)或2)修饰得到的物质：

1)对所述VEGF-siRNA的连接核苷酸的磷酸二酯键进行修饰，优选将所述磷酸二酯键的氧用硫取代；

2)对所述VEGF-siRNA的核糖的2’-OH的修饰，优选将所述2’-OH用甲氧基或氟取代或者对所述2’-OH进行脱氧修饰；

所述PTN-siRNA的修饰体是经过如下1)或2)修饰得到的物质：

1)对所述PTN-siRNA的连接核苷酸的磷酸二酯键进行修饰，优选将所述磷酸二酯键的氧用硫取代；

2)对所述PTN-siRNA的核糖的2’-OH的修饰，优选将所述2’-OH用甲氧基或氟取代或者对所述2’-OH进行脱氧修饰。

其中，活性成分a)中，权利要求1-3中任一所述的寡聚核酸与所述VEGF-siRNA或其修饰体的质量比是(0.5-2)∶(0.5-2)，优选是1∶1；

活性成分b)中，权利要求1-3中任一所述的寡聚核酸与所述PTN-siRNA或其修饰体的质量比是(0.5-2)∶(0.5-2)，优选是1∶1；

活性成分c)中，权利要求1-3中任一所述的寡聚核酸与所述VEGF-s iRNA或其修饰体、PTN-siRNA或其修饰体的质量比是(0.5-2)∶(0.5-2)∶(0.5-2)，优选是1∶1∶1。

上述药物组合物包含上述寡聚核酸分子中的至少一种以及至少一种药学上可接受的载体。本文所用的“药学上可接受的载体”应当与本发明药物组合物中的双链RNA分子相容。在一个优选实施例中，所述“药学上可接受的载体”是指体内转染试剂，如聚乙烯亚胺(PEI)，jetPEI(线性聚乙烯亚胺)，脂质体，转铁蛋白，叶酸等。

上述的寡聚核酸在制备抑制肿瘤生长的试剂或在制备抑制肿瘤细胞周期蛋白D1表达的试剂中的应用也属于本发明的保护范围之内。

进一步讲，上述试剂可以是上述抑制肿瘤生长的药物组合物。

具体地讲，上述肿瘤是肠癌、鼻咽癌、宫颈癌、肝癌、乳腺癌或肺癌。

所述寡聚核酸为化学合成，可以进行2′氟代(2′-F)、2′甲氧基(2′-OMe)、硫代(PS)和2′脱氧(2′-deoxy)化学修饰。

用化学合成并修饰的上述寡聚核酸分子转染鼻咽癌细胞株CNE、肠癌细胞株HCT116、乳腺癌细胞株MCF7、宫颈癌细胞株Hela、肝癌细胞株HepG2等肿瘤细胞的实验结果表明所述寡聚核酸miR-210能有效抑制上述肿瘤细胞的增殖。siPTN也能抑制上述肿瘤细胞的增殖。siVEGF和siPTN均能抑制肿瘤血管生成。

所述寡聚核酸miR-210抑制CCND1的表达；siVEGF抑制VEGF的表达，而siPTN抑制PTN的表达。通过上述三种不同的寡聚核酸分子的组合，实现抑制肿瘤的生长和血管生成的效果。

将肿瘤细胞接种于裸鼠，形成肿瘤后用所述寡聚核酸治疗的实验证明所述寡聚核酸组合能在体内有效抑制肿瘤的生长。

作为新型小核酸类的抗肿瘤药物，化学合成并修饰的所述寡聚核酸不易被降解，有较长的效应半衰期，能用于体外实验，更能用于体内治疗。

附图说明

图1A为MTT法检测2′-OMe-miR-210抑制鼻咽癌CNE细胞增殖的柱形图，图1B为MTT法检测2′-OMe-siPTN抑制Hela细胞增殖的柱形图。

图2为RT-PCR检测2′-OMe-miR-210**抑制肿瘤细胞CCND1的表达。

图3为RT-PCR检测2′-OMe-siVEGF抑制肿瘤细胞VEGF的表达。

图4为RT-PCR检测2′-OMe-siPTN抑制肿瘤细胞的PTN表达，泳道1-4分别为未转染的细胞，转染随机序列的阴性对照(NC)，转染2′-OMe-siPTN24小时，转染2′-OMe-siPTN 48小时。

图5为2′-OMe寡聚核酸组合治疗鼻咽癌移植瘤5次以后的瘤体积折线图。

图6为2′-OMe寡聚核酸组合加治疗鼻咽癌移植瘤6次以后的瘤重柱形图。

图7为2′-OMe寡聚核酸组合治疗鼻咽癌移植瘤6次以后肿瘤效果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1、寡聚核酸的制备

本发明中所述寡聚核酸序列正义链为：5’-CUGUGCGUGUGACAGCGGCUGA-3’(SEQID No.1)；反义链为3’-UUGACACGCACACUGUCGCCGA-5’序列(SEQ ID No.2)或3’-CACACGCCACCCGUCCCCGACG-5’(SEQ ID No.3)。本发明中VEGF-siRNA正义链为5’-GGAGUACCCUGAUGAGAUCTT-3’(SEQ ID No.4)；反义链为3’-TTCCUCAUGGGACUACUCUAG-5’(SEQ ID No.5)；PTN-siRNA正义链为5’-GCCCAAACCUCAAGCAGAATT-3’(SEQ  ID No.6)；反义链为3’-TTCGGGUUUGGAGUUCGUCUU-5’(SEQ ID No.7)；本发明中所述随机序列作为阴性对照(NC)，NC的正义链序列为：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’(SEQ ID No.8)，反义链序列为：3’-TTAAGAGGCUUGCACAGUGCA-5’(SEQ ID No.9)。所述寡聚核酸和NC序列中的A、G、C、U表示腺嘌呤核糖核苷酸、鸟嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸和尿嘧啶核糖核苷酸，T表示胸腺嘧啶脱氧核苷酸。

所述寡聚核酸和NC委托上海吉玛(GenePharma)制药技术有限公司合成并进行如下任意一种化学修饰：2′甲氧基(2′-OMe)、2′氟代(2′-F)、硫代和2′-脱氧(2’-deoxy)，然后经冻干处理得到寡聚核酸粉末，用于实施例2-4中的实验。

实施例1中的5种寡聚核酸，分别是：序列1和序列2配对成的寡聚核酸(命名为miR-210)、序列1和序列3配对成的寡聚核酸(命名为miR-210**)、序列4和序列5配对成的寡聚核酸(命名为VEGF-siRNA)、序列6和序列7配对成的寡聚核酸(命名为PTN-siRNA)、序列8和序列9配对成的寡聚核酸阴性对照(命名为NC)。

其中：miR-210经2′甲氧基修饰后命名为2′-OMe-miR-210；miR-210**经上述2′甲氧基修饰后命名为2′-OMe-miR-210**；VEGF-siRNA经2′甲氧基修饰后命名为2′-OMe-siVEGF、PTN-siRNA经2′甲氧基修饰后命名为2′-OMe-siPTN。NC经2′甲氧基修饰后命名为2′-OMe-NC。

上述合成方法源自一篇1995年公开的文献：Wincott F，DiRenzo A，Shaffer C，GrimmS，Tracz D，Workman C，Sweedler D，Gonzalez C，Scaringe S and Usman N.Synthesis，deprotection，analysis and purification of RNA and ribozymes.Nucleic Acids Res.1995，23：2677-84。整个化学合成可大致分成四个的过程(1)寡聚核糖核酸的合成；(2)脱保护；(3)纯化分离；(4)脱盐退火无菌消毒。

(1)寡聚核糖核苷酸的合成

在自动DNA/RNA合成仪(例如，Applied Biosystems EXPEDITE8909)上设定合成1毫摩尔的RNA，同时设定每个循环的偶联时间为10-15分钟，起始物为固相连接的5’-O-对二甲氧基-胸苷支持物，第一个循环在固相支持物上连接一个碱基，然后在第n次(19≥n≥2)循环中，在第n-1次循环所连接的碱基上连接一个碱基，重复此循环直至完成全部核酸序列的合成。

(2)脱保护

将连接有RNA的固相支持物加入到试管中，并在此试管中加入1毫升的乙醇/乙胺(体积比为1∶3)，然后密封，置于55-70℃温箱中，孵育2-30小时，取出连接有siRNA的固相支持物并用双蒸水淋洗2次(每次1毫升)，收集洗脱液，并在室温下干燥30分钟。然后，加入1毫升四丁基氟化铵的四氢呋喃溶液(1M)，室温放置4-12小时，再加入2毫升乙醇，收集沉淀即得到小RNA的粗产物。

(3)纯化分离

将得到的RNA的粗产物溶解于2毫升浓度为1摩尔/毫升的乙酸铵水溶液中，然后通过C18高压液相色谱进行分离，得到纯化的RNA产物。

(4)脱盐退火

用浓度为75重量％的乙醇水溶液洗涤纯化的RNA产物2-4次(每次2毫升)，以除去盐份，并室温下干燥。然后将正义链和反义链的寡聚核糖核酸混合溶解在1-2毫升的缓冲液中(10mM Tris，pH＝7.5-8.0，50mM NaCl)，将此溶液加热至95℃，然后缓缓将此溶液冷却至室温，并维持室温16-22小时，得到含有双链微小RNA的溶液。

实施例2、寡聚核酸miR-210和PTN-siRNA对肿瘤细胞增殖的影响

实验步骤为：将实施例1得到的2′-OMe-miR-210(图中简称miR-210)和2′-OMe-siPTN(图中简称siPTN)和阴性对照2′-OMe-NC(图中简称NC)粉末分别溶解于无RNA酶的无菌水中，配成3种终浓度为20pmol/L的寡聚核酸溶液。收集对数期鼻咽癌CNE细胞(购自上海细胞库，供2′-OMe-miR-210和2′-OMe-NC转染)或Hela细胞(购自上海细胞库，供2′-OMe-siPTN和2′-OMe-NC转染)，调整细胞悬液浓度，分种于96孔板，每孔150μl共5000个细胞；置于37℃，含5％CO₂的孵箱中使细胞贴壁，培养6-24小时。转染时，分别将0.40μl寡聚核酸溶液(上述2′-F寡聚核酸或2′-F寡聚核酸阴性对照)和0.20μl的lipofectamine 2000(Invitrogen)分别稀释于20μl无血清培养培养液(Opti-MEM)中，并在室温下孵育5分钟，然后将上述寡聚核酸溶液与lipofectamine 2000溶液混合，复合物于室温静置20分钟后，把60ul的10％FBS-DMEM加入40μl的寡聚核酸-脂质体复合物中，再加到细胞培养板中(细胞生长融合率为50-70％)转染6-8小时。为使细胞同步，在转染后将细胞血清饥饿12小时，之后用再换为2.5％FBS-DMEM培养基继续培养72小时；小心吸去上清120ul，使孔中生育培养液为80μl，再加入20μlMTT(5mg/ml)，即0.5％的MTT继续培养4小时；吸去上清加入100μl的二甲基亚砜DMSO，在酶联免疫检测仪492nm处测量各孔的吸光值；同时设置调0孔(培养基，MTT，二甲基亚砜)，每组设置3个复孔；结果如图1所示，图1A表明与转染2′-OMe-NC比较，转染2′-OMe-miR-210(图1A)或2′-OMe-siPTN(图1B)的细胞OD值明显降低，说明2′-OMe-miR-210或2′-OMe-siPTN能明显抑制肿瘤细胞的增殖。

本实施例中，miR-210经2′氟代(2′-F)、硫代(PS)和2′脱氧修饰后对肿瘤细胞增殖的影响与经2′甲氧基(2′-OMe)修饰后的作用无显著性差异。

实施例3、寡聚核酸抑制其靶基因表达的RT-PCR检测

使用Invi trogen的l ipofectamine^TM2000脂质体进行转染，所有操作均按Invitrogen提供的操作规程。将CNE或Hela细胞接种到6孔板中(5X10⁵个细胞/孔)，用含10％胎牛血清的DMEM养液(购自GIBCO)培养16-24小时后，将细胞培养液换成含无抗生素的DMEM培养液。将寡聚核酸粉末(2′-OMe-miR-210**、2′-OMe-siPTN、2′-OMe-siVEGF和2′-OMe-NC)分别溶解于无RNA酶的无菌水中，配成终浓度为20pmol/L的寡聚核酸溶液。

其中，2′-OMe-miR-210**和2′-OMe-NC转染CNE细胞；2′-OMe-siPTN和2′-OMe-NC转染Hela细胞；2′-OMe-siVEGF和2′-OMe-NC转染CNE细胞。

转染时，分别取10μl的上述寡核苷酸溶液和5μl的lipofectamine 2000分别稀释于250μl无血清培养培养液(Opti-MEM)中，并在室温下孵育5分钟，然后将上述寡聚核酸溶液与lipofectamine 2000溶液混合，复合物于室温静置20分钟后，把500μl的寡聚核酸-脂质体复合物与1.5ml无血清DMEM培养液混合后，加到细胞培养板中，6小时后换为10％FBS-DMEM培养基，分别于24、48收集细胞进行RT-PCR检测。

RT-PCR检测的步骤为：用1ml TRIzol(invitrogen)裂解转染所述寡聚核酸或寡聚核酸阴性对照的CNE或Hela细胞，并按TRIzol产品说明的操作规程提取总RNA。由于RNA干扰的效果可能被潜在的少量的基因组DNA影响，实验采用DNase I(RNase-free)(TaKaRa)来进一步消化降解总RNA中残留的DNA。在用DNase I 37℃消化30分钟后，按照DNase I产品说明重新提纯总RNA并对RNA进行定量和质量鉴定。逆转录反应是使用TaKaRa公司的M-MLV逆转录酶体系，将1ug的总RNA与0.5ug的Oligo dT混合，加热5分钟，迅速冷却至0℃。按产品说明加入缓冲液，42℃孵育1小时。逆转录反应后的cDNA，作为PCR反应的模板检测靶基因，转染2′-OMe-miR-210**的样本检测CCND1的表达，上游引物为5’-GCTGGAGCCCGTGAAAAAGA-3’，下游引物为5’-CTCCGCCTCTGGCATTTTG-3’。转染2′-OMe-siVEGF的样本检测VEGF表达上游引物为5′-GAGGGCAGAATCATCACGAA-3′；下游引物为5′-GGGAACGCTCCAGGACTTAT-3′。转染2′-OMe-siPTN的样本检测PTN表达，上游引物为5’-CACGGGAGGGCACTCGGACT-3’，下游引物为5’-GTCTTCTGGCATTCGGCATTG-3’。PCR反应体系为，94度5分钟，94度1分钟，54度30秒，72度20秒，共28个循环。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。

结果如图2-4所示，与转染寡聚核酸的阴性对照组(2′-OMe-NC，图中简称NC)比较，转染2′-OMe-miR-210**(图中简称miR-210**)明显抑制肿瘤细胞的CCND1表达(图2)，转染2′-OMe-siVEGF(图中简称siVEGF)明显抑制肿瘤细胞VEGF的表达(图3)，而转染2′-OMe-siPTN明显抑制肿瘤细胞的PTN表达(图4)。图2和图3中，上图为电泳图，下图为凝胶图像分析软件将电泳带转化成相对表达量的直方图。

本实施例中，miR-210**经2′氟代(2′-F)、硫代(PS)和2′脱氧修饰后对肿瘤细胞表达CCND1的半衰期测试结果的影响与经2′甲氧基(2′-OMe)修饰后的影响无显著性差异。

实施例4、2′-OMe寡聚核酸对肿瘤生长的抑制作用

用含10％胎牛血清的DMEM培养液培养鼻咽癌CNE细胞株，取对数生长期的细胞，制成单细胞悬液，调节细胞浓度5×10⁷个细胞/ml。在5周龄的雄性BALB/C裸鼠的背侧翼部皮下注射0.1ml肿瘤细胞悬液，使其形成移植瘤。将裸鼠分为八组，分别为2′-OMe-NC(简称NC组)，2′-OMe-miR-210(简称miR-210组)，2′-OMe-miR-210加2′-OMe-siVEGFA(简称miR-210+siVEGF组)，2′-OMe-siVEGF(简称siVEGF组)，2′-OMe-siVEGF+2′-OMe-siPTN(简称siVEGF+siPTN组)，2′-OMe-miR-210+2′-OMe-siPTR(简称miR-210+siPTN组)，2′-OMe-miR-210+2′-OMe-siVEGF+2′-OMe-siPTN(简称miR-210+siVEGF+siPTN组)，5氟-脲嘧啶(简称5′FU组)。接种肿瘤细胞以后的第一天和第三天，分别进行1次尾静脉注射。到肿瘤体积达50mm³后改为瘤内注射。

各组的尾静脉注射用的寡聚核酸制剂的配制方法是：单寡聚核酸组(NC组、miR-210组和siVEGF组)是用不含RNA酶的无菌水165μl分别溶解100μg每组相应的寡聚核酸；双寡聚核酸组(miR-210+siVEGF组、siVEGF+siPTN组和miR-210+siPTN组)是用两份不含RNA酶的无菌水87.5μl分别溶解每组内的两种50μg寡聚核酸后混合(总容积165ul)；三寡聚核酸组(miR-210+siVEGF+siPTN组)是用三份不含RNA酶的无菌水55μl分别溶解三种33.3333μg的寡聚核酸后混合(总容积165ul)。

然后各组再加转染剂jetPEI 10μl(购自Polyplus公司)，室温孵育15分钟后，与等体积10％葡萄糖溶液混合起来，总体积350ul，在室温孵育15分钟后进行尾静脉注射。一次注射的寡核苷酸用量为100μg/只。5氟-脲嘧啶用法是：25ng/kg/次，腹腔注射。

瘤内注射用的寡聚核酸制剂的配制方法是用不含RNA酶的无菌水11.3μl溶解20μg的2′-OMe-寡聚核酸。单寡聚核酸组取11.3μl不含RNA酶的无菌水溶解20μg的寡聚核酸，双寡聚核酸组用两份不含RNA酶的无菌水5.65μl分别溶解每组内的两种10μg寡聚核酸后混合(总容积11.3ul)，三寡聚核酸组用三份不含RNA酶的无菌水3.77μl分别溶解三种6.667μg寡聚核酸后混合(总容积11.3μl)。转染试剂的用量为1.2μl，加入等体积10％葡萄糖溶液混合起来，总体积25ul瘤内注射。一次注射的寡核苷酸用量为20μg/点。每隔2天注射一次，瘤内注射共5次。5氟-脲嘧啶用法是：25ng/kg/次，腹腔注射。接种后3天每隔两天用游标卡尺测量肿瘤最长径(L)和横径(S)，计算肿瘤的近似体积。计算公式为：V(mm³)＝0.5×L×S²。瘤内注射5次后结束实验，处死裸鼠，取出肿瘤称重。

图5所示为治疗后不同寡聚核酸组合的治疗组和对照组的肿瘤体积对比的折线图，治疗组肿瘤体积的增加明显比对照组小，对照组肿瘤体积呈明显上升趋势。寡聚核酸组合miR-210+s iVEGF的抑瘤效果最好。

图6表明治疗以后在鼻咽移植肿瘤裸鼠模型上，治疗组裸鼠的瘤重明显比对照NC组小，寡聚核酸组合miR-210+siVEGF的抑瘤率达到62.41％。

图7为肿瘤治疗以后，处理组和对照组的肿瘤治疗效果图。

本实施例中，miR-210经2′氟代(2′-F)、硫代(PS)和2′脱氧修饰后对对肿瘤生长的抑制作用与经2′甲氧基(2′-OMe)修饰后的影响无显著性差异。

表1为实验结束以后小鼠血清AST检测数据。检测裸鼠天门冬氨酸氨基转移酶(AST)按照天门冬氨酸氨基转移酶试剂盒(购自中生北控生物股份有限公司)说明书操作。将试剂盒中的10ml/瓶R2(液体)加入到R1(粉末)瓶中，溶解后即为工作液，置于室温静置。取新鲜裸鼠无溶血血清20ul/孔，加入到96孔板中，将配制好的工作液200ul/孔也加入到96孔板中，混合均匀。同时设定4个空白对照孔。在反应温度保温1分钟，在340nm波长下读取初始吸光度，同时开始计时，在精确1，2，3分钟时，分别读取吸光度，确定每分钟平均吸光度变化，按照说明书提供的公式进行计算，得到AST的数值。结果显示与不用药的PBS组比较治疗组的ALT数值无显著性升高，说明所述寡聚核酸治疗无明显的肝脏毒性。

表1向清AST检测数据表

  组别 例数(N)  AST(U/L)  标准误  P值  PBS  6  38.5  3.2  ＞0.05  NC  6  32.6  7.2  ＞0.05  5′Fu  6  38.2  5.5  ＞0.05  miR-210+siPTN+siVEGF  6  32.7  4.7  ＞0.05  si PTN+siVEGF  6  39.3  2.7  ＞0.05  miR-210+siPTN  6  38.9  9.3  ＞0.05  siVEGF  6  34.2  4.9  ＞0.05  miR-210  6  31.0  7.3  ＞0.05  miR-210+siVEGF  6  42.4  4.6  ＞0.05