伤寒、副伤寒沙门菌多重荧光PCR检测方法及检测试剂盒

摘要

本发明公开了一种伤寒、副伤寒沙门菌多重荧光PCR检测方法和检测试剂盒，所述检测方法和试剂盒包括：分别特异性扩增伤寒沙门菌和丙型、甲型、乙型副伤寒沙门菌ViaB基因序列、fliC-a基因序列、fliC-b基因序列和ssaR基因序列的加尾引物，其碱基序列如SEQ IDNO：1、2、4、5、7、8、10和11所示；用于检测伤寒沙门菌和丙型、甲型、乙型副伤寒沙门菌ViaB基因、fliC-a基因、fliC-b基因和ssaR基因的分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO：3、6、9和12所示。本申请提供的检测方法和试剂盒在检测灵敏度指标方面已达到金标准培养法灵敏度水平，与传统的培养法相比具有快速灵敏、操作简便、结果客观准确等优点。

说明书

技术领域

本发明涉及伤寒沙门菌检测领域，尤其涉及一种伤寒、副伤寒沙门菌多重荧光PCR检测方法及检测试剂盒。

背景技术

伤寒和副伤寒是我国法定乙类传染病，伤寒是由伤寒沙门菌引起的，副伤寒是由甲、乙、丙型副伤寒沙门菌引起的。伤寒引起的急性肠道传染病，目前仍是世界性的主要公共卫生问题之一，尤其在发展中国家。全世界每年约有1700万伤寒热病例，60万人死亡。1990年以后，我国平均发病率在4.08-10.45/10万之间，每年报告5.1-12万人患病，病死33-374人。

目前伤寒、副伤寒现有诊断方法以细菌分离培养、生化鉴定和血清学鉴定为主，需6-7天时间，特别是伤寒、副伤寒的传统血培养分离方法不仅时间长，而且阳性率低，不利于疾病的早期诊断和治疗，易漏诊。近几年来，随着PCR技术和荧光PCR技术的发展，基于核酸水平的检测方法逐渐开发。目前国内只有采用普通PCR同时检测伤寒和甲型副伤寒的报道，国外有利用多重PCR检测伤寒、甲型和乙型副伤寒的报道，以及利用TaqMan探针的荧光PCR技术检测伤寒沙门菌的报道，近期有用TaqMan荧光PCR检测丙型副伤寒和猪霍乱的报道。

但目前报道的荧光PCR技术一般都是单管检测1种伤寒沙门菌，未见利用改良分子信标荧光探针结合HAND系统的多重荧光PCR技术1管同时检测伤寒、甲型、乙型和丙型副伤寒的文献报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种伤寒、副伤寒沙门菌多重荧光PCR检 测试剂盒，该试剂盒可应用于一般标本的伤寒、副伤寒沙门菌初筛检测，其操作简便、结果客观准确。

本发明的第二个目的在于提供一种伤寒、副伤寒沙门菌多重荧光PCR检测方法。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种伤寒、副伤寒沙门菌多重荧光PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括：

特异性扩增伤寒沙门菌和丙型副伤寒沙门菌ViaB基因序列的加尾引物，其碱基序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；

用于检测伤寒沙门菌和丙型副伤寒沙门菌ViaB基因的分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO：3所示；

特异性扩增甲型副伤寒沙门菌fliC-a基因序列的加尾引物，其碱基序列如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示；

用于检测甲型副伤寒沙门菌fliC-a基因的分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO：6所示；

特异性扩增乙型副伤寒沙门菌fliC-b基因序列的加尾引物，其碱基序列如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示；

用于检测乙型副伤寒沙门菌fliC-b基因的分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO：9所示；

特异性扩增沙门菌ssaR基因序列的加尾引物，其碱基序列如SEQID NO：10和SEQ ID NO：11所示；

用于检测沙门菌ssaR基因的分子信标探针，其碱基序列如SEQ IDNO：12所示。

所述用于检测伤寒沙门菌和丙型副伤寒沙门菌ViaB基因、甲型副伤寒沙门菌fliC-a基因、乙型副伤寒沙门菌fliC-b基因的分子信标探针，其5’端标记荧光基团FAM，其3’端标记淬灭荧光基团DABCYL。

所述用于检测沙门菌ssaR基因的分子信标探针，其5’端标记荧光基团HEX，其3’端标记淬灭荧光基团DABCYL。

一种利用多重荧光PCR检测伤寒、副伤寒沙门菌的方法，包括以 下步骤：

1)提取样本DNA；

2)以步骤1)提取的DNA为模板，利用特异性扩增伤寒沙门菌和丙型副伤寒沙门菌ViaB基因序列的加尾引物PCR扩增ViaB基因，加尾引物碱基序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；利用特异性扩增甲型副伤寒沙门菌fliC-a基因序列的加尾引物PCR扩增fliC-a基因，加尾引物碱基序列如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示；利用特异性扩增乙型副伤寒沙门菌fliC-b基因序列的加尾引物PCR扩增fliC-b基因，加尾引物碱基序列如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示；利用特异性扩增沙门菌ssaR基因序列的加尾引物PCR扩增沙门菌ssaR基因，加尾引物碱基序列如SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示；

3)用以下分子信标探针与步骤2)所述PCR扩增产物杂交，以达到设定的阈值时所需的循环次数Ct值作为结果判断的标准，

Ct≤32：阳性，

32＜Ct≤35：可疑，取样本重新进行DNA提取和PCR检测，如重测结果Ct≤35，则判定为阳性；如重测结果Ct＞35或无Ct值，则判定为阴性；

Ct＞35或为0：阴性，

用于检测伤寒沙门菌和丙型副伤寒沙门菌ViaB基因的分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO：3所示；

用于检测甲型副伤寒沙门菌fliC-a基因的分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO：6所示；

用于检测乙型副伤寒沙门菌fliC-b基因的分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO：9所示；

用于检测沙门菌ssaR基因的分子信标探针，其碱基序列如SEQ IDNO：12所示。

所述PCR扩增的反应体系为：25μl反应体系含1×buffer(10mMTris-HCL，50mM KCl)，3.5mM MgCl2，2.4uM通用引物，0.04uM-0.06 uM加尾引物，0.05uM-0.2uM各分子信标探针，0.3mM dNTP，1.0U Taq酶，5μlDNA模板。

所述PCR扩增的反应条件为：95℃ 3min；95℃ 10s，58℃ 20s，72℃ 15s，共5个循环；95℃ 10s，55℃ 32s，72℃ 15s，共40个循环。

所述用于检测伤寒沙门菌和丙型副伤寒沙门菌ViaB基因、甲型副伤寒沙门菌fliC-a基因、乙型副伤寒沙门菌fliC-b基因的分子信标探针，其5’端标记荧光基团FAM，其3’端标记淬灭荧光基团DABCYL；用于检测沙门菌ssaR基因的分子信标探针，其5’端标记荧光基团HEX，其3’端标记淬灭荧光基团DABCYL。

PCR扩增时使用Mx 3005P荧光PCR仪在第二个循环周期的55℃退火阶段采集FAM和HEX通道的荧光数据。

本发明设计了4对PCR引物分别特异性扩增伤寒沙门菌和丙型副伤寒沙门菌ViaB基因序列、甲型副伤寒沙门菌fliC-a基因、乙型副伤寒沙门菌fliC-b基因序列、沙门菌ssaR基因，4对PCR引物可在同一PCR反应管里同时进行扩增，实现四重检测。

本发明涉及4个靶基因的多重荧光PCR检测，为了避免引物二聚体，采用HAND系统(相同标签辅助-无引物二聚体)设计同源加尾引物；为了保证4对引物和4个探针之间无互补配对或交叉扩增的情况出现，设计改良分子信标。同时本发明所选用的两个荧光基团的荧光波长相差较大，而且两者的荧光信号强度相近，以保证两种荧光信号之间无相互干扰。

本申请提供的“伤寒、副伤寒沙门菌多重荧光PCR检测试剂盒”在检测灵敏度指标方面已达到金标准培养法灵敏度水平，与传统的培养法相比具有快速灵敏、操作简便、结果客观准确等优点，可应用于一般标本的伤寒、副伤寒沙门菌初筛检测。

附图说明

图1是甲型副伤寒沙门菌引物和探针特异性验证结果图。

图2是乙型副伤寒沙门菌引物和探针特异性验证结果图。

图3是伤寒沙门菌与丙型副伤寒沙门菌ViaB基因的引物和探针特异性验证结果图。

图4是标准品验证实验结果图，4A：甲型副伤寒沙门菌标准品，4B：乙型副伤寒沙门菌标准品；4C：丙型副伤寒沙门菌标准品；4D：伤寒沙门菌标准品；4E：甲型副伤寒沙门菌精密度；4F：伤寒沙门菌精密度；4G：甲型副伤寒沙门菌、伤寒沙门菌最低检出限；4H：8株阴性参考品。

具体实施方式

实施例1

一种伤寒、副伤寒沙门菌多重荧光PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括：

特异性扩增伤寒沙门菌和丙型副伤寒沙门菌ViaB基因序列的加尾引物，其碱基序列如SEQ ID NO：1(ViaB-TF)和SEQ ID NO：2(ViaB-TR)所示；

用于检测伤寒沙门菌和丙型副伤寒沙门菌ViaB基因的分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO：3(ViaB-P)所示；

特异性扩增甲型副伤寒沙门菌fliC-a基因序列的加尾引物，其碱基序列如SEQ ID NO：4(fliC-a-TF)和SEQ ID NO：5(fliC-a-TR)所示；

用于检测甲型副伤寒沙门菌fliC-a基因的分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO：6(fliC-a-P)所示；

特异性扩增乙型副伤寒沙门菌fliC-b基因序列的加尾引物，其碱基序列如SEQ ID NO：7(fliC-b-TF)和SEQ ID NO：8(fliC-b-TR)所示；

用于检测乙型副伤寒沙门菌fliC-b基因的分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO：9(fflC-b-P)所示；

特异性扩增沙门菌ssaR基因序列的加尾引物，其碱基序列如SEQ ID NO：10(ssaR-TF)和SEQ ID NO：11(ssaR-TR)所示；

用于检测沙门菌ssaR基因的分子信标探针，其碱基序列如SEQ IDNO：12(ssaR-P)所示。

所述用于检测伤寒沙门菌和丙型副伤寒沙门菌ViaB基因、甲型副伤寒沙门菌fliC-a基因、乙型副伤寒沙门菌fliC-b基因的分子信标探针，其5’端标记荧光基团FAM，其3’端标记淬灭荧光基团DABCYL。

所述用于检测沙门菌ssaR基因的分子信标探针，其5’端标记荧光基团HEX，其3’端标记淬灭荧光基团DABCYL。

加尾引物(tagged primer)是由5′端20bp无关序列连接3′端特异序列形成的。加尾引物的特异序列部分与通常使用的特异引物无异，它们是根据伤寒沙门菌、副伤寒沙门菌的特异基因或序列设计的。

传统分子信标探针的茎部是由无关的碱基(5bp-7bp)组成，而本申请分子信标探针让茎部的部分碱基也和靶序列互补，使得杂交效率更高。

表1加尾引物与探针列表

  名称   序列(5’-3’)^a序列号   ViaB-TF   GCAAGCCCTCACGTAGCGAAAGTTAAGGTTTAACCCCAAAGGTGSEQ ID NO：1   ViaB-TR   GCAAGCCCTCACGTAGCGAAGCTAAATTGTTTGGATAGGGCGTSEQ ID NO：2   ViaB-P   FAM-CCTGGCTTAGCATTTTTTATGGTCGCCAGG-DABCYLSEQ ID NO：3   fliC-a-TF   GCAAGCCCTCACGTAGCGAACATTAAGCACTACTGCACTTGATSEQ ID NO：4   fliC-a-TR   GCAAGCCCTCACGTAGCGAATCCGCCTTTGTTGGTTTGATSEQ ID NO：5   fliC-a-P   FAM-CGGTCGAAGTAGAATTTACCGATGCGACCG-DABCYLSEQ ID NO：6   fliC-b-TF   GCAAGCCCTCACGTAGCGAAGGAYGCCTATACGCCAAAAGSEQ ID NO：7   fliC-b-TR   GCAAGCCCTCACGTAGCGAACACAGCCGCWGTACCCSEQ ID NO：8   fliC-b-P   FAM-CCGGTGCTGTAAGAGTAGTACCACCGG-DABCYLSEQ ID NO：9   ssaR-TF   GCAAGCCCTCACGTAGCGAAGAACCTGGCCTGAAGACATAAASEQ ID NO：10   ssaR-TR   GCAAGCCCTCACGTAGCGAAAGTAATCCAATCCGAAATGCCTSEQ ID NO：11   ssaR-P   HEX-CCGGCTAACTGACTCACCGTAAATGCCGG-DABCYLSEQ ID NO：12

注：下划线部分碱基形成分子信标的茎部。

实施例2用实施例1所述试剂盒对血培养样品进行检测

1.方法

1.1血培养样品的DNA模板制备

1.1.1从血培养样品中提取DNA模板：采用低速离心，高速富集水煮法，取1ml菌液，按不同的低速离心力和离心时间处理后，取700μl上清12000rpm离心5min，弃上清。加入50μl双蒸水悬浮沉淀，100℃煮沸5min，12000rpm离心2min，取上清5μl作为PCR模板。

1.1.2模拟血培养样品培养时间

置于BacT/ALERT 3D全自动微生物培养系统内培养的伤寒、副伤寒模拟样品，每隔8-12h进行一次无菌注射器抽样，对抽出血培养物进行PCR和平板检测。

1.2多重荧光PCR检测体系和PCR程序

25μl反应体系含1×buffer(10mM Tris-HCL，50mM KCl)，3.5mMMgCl2，2.4uM通用引物，0.04uM-0.06uM加尾引物，0.05uM-0.2uM各探针，0.3mM dNTP，1.0U Taq酶，5μlDNA模板。

通用引物是用来扩增加尾引物的尾巴(Tag)部分的。可以解决多重PCR的引物间形成二聚体的问题。

表2PCR反应体系所用试剂具体如下：

  反应液组分   用量   原料来源用量   灭菌超纯水   10.07μl   自制   10×buffer(不含镁离子)   2.5μl   Takara   MgCl₂(25mM)  3.5μl   Takara   dNTPs   2.5μl   Takara   fa-f引物(50uM)   0.06μl   Takara   fa-r引物(50uM)   0.06μl   Takara   fb-f引物(50uM)   0.07μl   Takara   fb-r引物(50uM)   0.07μl   Takara   Vi-f引物(50uM)   0.08μl   Takara   Vi-r引物(50uM)   0.08μl   Takara   ssaR-f引物(50uM)   0.04μl   Takara   ssaR-r引物(50uM)   0.04μl   Takara   Homo-tag引物(100uM)   0.3μl   Takara   fa-fam探针(50uM)   0.1μl   Takara   fb-fam探针(50uM)   0.08μl   Takara   Vi-fam探针(50uM)   0.05μl   Takara   ssaR-hex探针(50uM)   0.2μl   Takara

  Taq酶(5U/μl)   0.2μl   Takara   DNA模板   5.0μl    合计：   25μl  

PCR的程序如下：95℃ 3min；95℃ 10s，58℃ 20s，72℃ 15s(共5个循环)；95℃ 10s，55℃ 32s，72℃ 15s(共40个循环)。使用Mx3005P荧光PCR仪在第二个循环周期的55℃退火阶段采集FAM和HEX通道的荧光数据。

设无菌水作为阴性对照。

1.3结果判定标准

阳性：标本检测结果Ct≤32，有明显指数增长期。

可疑：标本检测结果32＜Ct≤35，有明显指数增长期。取标本重新进行DNA提取和PCR检测，如重测结果Ct≤35，则判定为阳性；如重测结果Ct＞35或无Ct值，则判定为阴性。

阴性：标本检测结果Ct＞35或无Ct值。

2.结果

2.1甲型副伤寒沙门菌引物和探针特异性验证

选取60株菌株进行特异性验证，其中7株甲型副伤寒沙门菌产生阳性信号(见图1)。结果表明：甲型副伤寒沙门菌引物和探针具有良好的特异性，只有当目标菌才产生阳性荧光信号，其余无关菌株不产生阳性信号，无假阳性或假阴性结果。

2.2乙型副伤寒沙门菌引物和探针特异性验证

选取60株菌株进行特异性验证，其中仅3株乙型副伤寒沙门菌产生阳性信号(见图2)。结果表明：乙型副伤寒沙门菌引物和探针具有良好的特异性，只有当目标菌才产生阳性荧光信号，其余无关菌株不产生阳性信号，无假阳性或假阴性结果。

2.3伤寒沙门菌与丙型副伤寒沙门菌ViaB基因的引物和探针特异性验证

选取60株菌株进行特异性验证，其中仅31株乙型副伤寒沙门菌产生阳性信号(见图3)。结果表明：伤寒沙门菌与丙型副伤寒沙门菌ViaB 基因的引物和探针具有良好的特异性，只有当目标菌才产生阳性荧光信号，其余无关菌株不产生阳性信号，无假阳性或假阴性结果。

2.4模拟血培养标本的制备和研究

研究结果显示，1ml菌液，先低速1500rpm离心5min后，再取上清700μl进行DNA提取的实验结果最佳。短暂培养8个小时后，PCR方法即可100％的检出阳性样品，勿需临床样品培养至仪器报警后再进行检测。同时具体的实验结果，见表3。

表3模拟的伤寒副伤寒样品研究

注：A0-A6为甲型副伤寒沙门菌的不同菌液稀释度

S0-S6为伤寒沙门菌的不同菌液稀释度

2.5血培养样品检测结果

荧光PCR检测血培养标本3份，均为阳性，与传统方法结果相符。

实施例3对实施例1所述试剂盒进行方法学评价

1.方法

将从中检所购买的8个阳性参考品和8株阴性参考品(详见表4)，按要求进行梯度稀释，然后按照菌液水煮法制备DNA(取1ml菌液，12000rpm离心5min，弃上清。加入50μl双蒸水悬浮沉淀，100℃煮沸5min，12000rpm离心2min取上清作为模板)，进行荧光PCR体系的 特异性、灵敏度、精密度及检出限的实验。其中，精密度实验需要将精密度参考品同批次做10个样品处理，计算试验中的Ct值CV％。

所用的PCR体系的配方和PCR程序，见多重荧光PCR检测体系和PCR程序。

表4中检所标准品验证实验用菌株

2.结果

中检所购买的8个阳性参考品和8株阴性参考品，进行荧光PCR体系的特异性、灵敏度、精密度及检出限的实验(参见图4)。结果显示，建立的多重双色荧光PCR体系对8株阳性参考品均产生正确的阳性信号，8株阴性参考品均未产生阳性信号，灵敏度和特异性均为100％。 检测体系的精密度良好，甲型副伤寒沙门菌的CV％为2.3％，伤寒沙门菌CV％为3.1％。检测体系的对伤寒副伤寒的最低检出限为10⁴CFU/ml。

实施例4实施例1所述试剂盒临床考核比对实验

用本申请所述伤寒、副伤寒沙门菌多重PCR检测试剂盒和金标准培养法针对血液样本进行盲法检测。标本阴阳性检测结果以培养法为标准，并以此衡量本发明的灵敏度、特异度等检测性能指标。

共检测3家省级实验室的临床试验样本538例，使用培养法检出212例阳性，326例阴性；使用本发明试剂盒检出218例阳性，320例阴性。对比培养法，本发明试剂盒检测伤寒、副伤寒沙门菌的灵敏度为100％，特异度为98.2％，见表5。

表5培养法与本发明试剂盒检测结果比较

通过试验设计统计方法计算得出，本发明试剂盒检测伤寒、副伤寒沙门菌的灵敏度(真阳性率)为100％，特异度(真阴性率)为98.2％。计算方法如下：

灵敏度(真阳性率)＝A/(A+C)×100％＝212/212×100％＝100％

特异度(真阴性率)＝D/(B+D)×100％＝320/326×100％＝98.2％

本发明在分子信标探针技术和HAND系统技术的基础上，针对伤寒、副伤寒沙门菌建立了多重实时PCR方法。通过对临床考核数据统计，得出以下结论：

(1)本发明试剂盒灵敏度为100％

在本次临床考核研究过程中，使用培养法共检测出212例阳性， 使用本发明试剂盒检出的阳性标本完全覆盖上述培养法阳性标本，本发明试剂盒灵敏度为100％。

(2)本发明试剂盒特异度高

在本次考核过程中，使用培养法检测出的326例阴性中，使用本发明试剂盒则另检出6份阳性标本，本发明试剂盒特异度达到98.2％。

(3)多色实时荧光PCR法方法客观

因本发明试剂盒配合实时荧光PCR仪使用。检测结果阴阳性可通过对扩增曲线形态及Ct值进行判定，结果分析直观明了。而培养法在进行平皿分离培养时采用目测观察并挑选可疑菌落进行生化及血清学鉴定的方法，则具有较强的主观性，并受人员经验限制。

(4)多色实时荧光PCR法方法检测快速

在本次临床考核中，使用本发明试剂盒检测血液临床标本，每批仅需2小时即可完成，且每次上机可同时检测96份。相对的培养法检测周期则为7-14天，采用实时荧光PCR方法进行标本检测，可满足常见沙门菌快速排查、快速诊断的要求。

本次临床试验表明，本申请提供的“伤寒、副伤寒沙门菌多重荧光PCR检测试剂盒”在检测灵敏度指标方面已达到金标准培养法灵敏度水平，与传统的培养法相比具有快速灵敏、操作简便、结果客观准确等优点，可应用于一般标本的伤寒、副伤寒沙门菌初筛检测。