生物标记用于评估β7整联蛋白拮抗剂治疗胃肠道炎性病症的用途

摘要

本发明涉及使用生物标记评估β7拮抗剂治疗胃肠道炎性病症的方法。更具体地，本发明涉及使用外周血中肠归巢淋巴细胞水平、药物在肠归巢淋巴细胞上占据的水平，和/或β7整联蛋白受体在肠归巢淋巴细胞上的水平作为治疗剂如β7整联蛋白拮抗剂治疗胃肠道炎性病症的效果、功效、安全性、预后和/或给药的指示物(或生物标记)。

说明书

发明领域

本发明涉及评估治疗剂(或药物)如整联蛋白β7拮抗剂用于治疗胃肠道炎性病症的效果、功效、安全性和/或给药的方法。具体地，本发明涉及使用患者外周血中的肠归巢(gut-homing)淋巴细胞水平、药物在肠归巢淋巴细胞上占据(occupancy)的水平，和/或β7整联蛋白受体在肠归巢淋巴细胞上的水平作为治疗剂如β7整联蛋白拮抗剂治疗胃肠道炎性病症的效果、功效、安全性和/或给药的指示物(“生物标记”)。此类方法包括例如，使用这些生物标记的一种或多种评估患者对整联蛋白β7拮抗剂治疗胃肠道病症的应答性。此外，本发明提供了使用此类生物标记设计药物治疗和/或给药方案或者用于预后的方法。

发明背景

为了保护身体抵抗外来物质，免疫系统的细胞经由外周血在身体中循环并归巢到淋巴结和浓缩抗原的组织。通常，有两种不同的归巢系统，外周归巢和粘膜归巢，其提供了对系统性或粘膜抗原的免疫性。最初在胃肠道位点中被激活的细胞将优先归巢到粘膜的组织和节结。相反，在外周淋巴结中活化的细胞优先返回到外周位点(Butcher et al.，Adv Immunol(1999))。循环中的细胞通过经毛细血管后微静脉(HEV)外渗进入肠淋巴结和组织。这通过淋巴细胞表面上的粘附分子和HEV上的受体(地址素)之间的相互作用发生(Butcher et al.，Adv Immunol(1999))。

整联蛋白是α/β异二聚体细胞表面受体，其涉及从细胞粘附到基因调节的多种细胞过程(Hynes，R.O.，Cell，1992，69：11-25；和Hemler，M.E.，Annu.Rev.Immunol.，1990，8：365-368)。在免疫系统中，整联蛋白涉及炎症过程中的淋巴细胞运输、粘附和渗入(Nakajima，H.et al.，J.Exp.Med.，1994，179：1145-1154)。整联蛋白的差别表达调节细胞的粘附性质并且不同的整联蛋白涉及不同的炎症反应(Butcher，E.C.et al.，Science，1996，272：60-66)。含有β7的整联蛋白(如α4β7和αEβ7)主要在单核细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和巨噬细胞上表达但是不在嗜中性粒细胞上表达(Elices，M.J.et al.，Cell，1990，60：577-584)。α4β7整联蛋白的主要配体是内皮表面蛋白粘膜地址素细胞粘附分子(MAdCAM-1)和血管细胞粘附分子(VCAM-1)(Makarem，R.et al.，J.Biol.Chem.，1994，269：4005-4011)。据报导在炎症位点α4β7整联蛋白与毛细血管后微静脉(HEVs)上表达的MAdCAM-1和/或VCAM-1的结合导致白细胞和内皮的坚固粘附；该坚固粘附步骤后是细胞外渗入发炎的组织(Chuluyan，H.E.et al.，Springer Semin.Immunopathol.，1995，16：391404)。αEβ7整联蛋白(其在上皮内淋巴细胞(IEL)上表达)的主要配体是E-钙黏着蛋白，据报导E-钙黏着蛋白促进带有αEβ7的细胞粘附到上皮细胞。尽管据报导E-钙黏着蛋白在向肠的归巢中不起作用，但是认为E-钙黏着蛋白和αEβ7之间的相互作用在淋巴细胞向肠上皮的拴系中起作用。

IBD是大肠、并且在一些情况中是小肠的一组炎性、自身免疫病症。IBD的主要形式是局限性回肠炎(CD)和溃疡性结肠炎(UC)。作为自身免疫疾病，IBD的特征是白细胞向胃肠道的增加的渗入，导致肠的增厚和细胞破坏。通过阻断白细胞的归巢抑制该渗入可以下调与该疾病相关的炎症和细胞破坏。据报导循环的粘膜归巢淋巴细胞在具有结肠炎症的患者中发生改变(Meenan et al.Gut 1997；40：241-246)。据报导针对α4β7、MAdCAM-1或VCAM-1的单克隆抗体在慢性炎性疾病如结肠炎(Viney et al.，J.Immunol.，1996，157：2488-2497)和炎性肠病(IBD；Podalski，D.K.，N.Eng.J.Med.，1991，325：928-937；Powrie，F.et al.，Ther.Immunol.，1995，2：115-123)的动物模型中是有效调节剂。

据报导施用针对αEβ7的单克隆抗体在IL-2^-/-小鼠中预防并减轻了免疫诱导的结肠炎，提示炎性肠病的发作和保持取决于表达αEβ7的粘膜固有层(lamina propria)CD4⁺淋巴细胞的结肠定位(Ludviksson et al.，J Immunol.1999，162(8)：4975-82)。据报导抗-α4抗体(那他珠单抗)在CD患者治疗中有效(Sandborn et al.，N Engl J Med 2005；353：1912-25)并且据报导抗α4β7抗体(MLN-02)在UC患者中有效(Feagan et al.，N Engl J Med2005；352：2499-507)。这些发现证实了α4β7作为治疗靶标并且支持α4β7和MAdCAM-1之间的相互作用介导IBD的发病机制这一观点。从而，β7整联蛋白的拮抗剂作为治疗IBD中的治疗剂具有巨大潜力。

为了设计具有希望的效果、安全性和/或功效的疗法，重要的是评估患者对治疗剂如β7整联蛋白拮抗剂治疗的应答性和预后。因此，希望开发可以准确预测和/或追踪患者对治疗剂治疗的应答性的生物标记。此类预测对于设计在临床试验研究和疾病治疗中人类患者的有效治疗方案是必需的。

发明概述

本发明涉及评估治疗剂(或药物)如整联蛋白β7拮抗剂用于治疗胃肠道炎性病症患者的效果、功效、安全性、预后和/或给药的方法。具体地，本发明涉及使用患者外周血中的肠归巢淋巴细胞水平、药物在肠归巢淋巴细胞上占据的水平，和/或β7整联蛋白受体在肠归巢淋巴细胞上的水平作为治疗剂如β7整联蛋白拮抗剂治疗胃肠道炎性病症的效果、功效、安全性、预后和/或给药的指示物(或生物标记)。此类方法包括例如，使用这些生物标记的一种或多种评估患者对整联蛋白β7拮抗剂治疗胃肠道病症的应答性。此外，本发明提供了使用此类生物标记设计药物治疗和/或给药方案或者用于预后的方法。

在一些方面，将用治疗剂治疗患者前的生物标记水平与患者治疗期间和/或之后该相同生物标记的水平比较，并且患者中该生物标记水平的改变(例如，升高或降低)是该治疗剂如β7整联蛋白拮抗剂在治疗患者中胃肠道炎性病症中的效果、功效、安全性和/或预后的指示。此外，本发明的此类方法可以用于设计用于治疗患者中胃肠道炎性病症的药物治疗或给药方案。

一方面，本发明涉及确定整联蛋白β7拮抗剂在治疗患者中胃肠道炎性病症的功效的方法，该方法包括比较用整联蛋白β7拮抗剂治疗之后或期间从患者得到的样品中生物标记的量和治疗前从患者得到的样品中该生物标记的量，其中治疗之后或期间与治疗前相比该生物标记的量的改变是该拮抗剂在治疗患者中胃肠道病症中的功效的指示。

另一方面，本发明涉及预测胃肠道炎性病症患者对整联蛋白β7拮抗剂治疗的应答性的方法，该方法包括比较用整联蛋白β7拮抗剂治疗之后或期间从患者得到的样品中生物标记的量和治疗前从患者得到的样品中该生物标记的量，其中治疗之后或期间与治疗前相比该生物标记的量的改变是所述患者对所述拮抗剂治疗的应答性的指示。

在再一方面，本发明涉及确定整联蛋白β7拮抗剂用于治疗患者中胃肠道炎性病症的给药的方法，该方法包括基于用整联蛋白β7拮抗剂的剂量治疗之后或期间从患者得到的样品中生物标记的量与治疗前从患者得到的样品中该生物标记的量的比较来调节整联蛋白β7拮抗剂的剂量，其中治疗之后或期间与治疗前相比该生物标记的量的改变是对用于治疗患者中胃肠道疾病的整联蛋白β7拮抗剂的剂量的功效或应答性的指示。

另一方面，本发明涉及确定整联蛋白β7拮抗剂用于治疗患者中胃肠道炎性病症的给药方案的方法，该方法包括基于用整联蛋白β7拮抗剂的给药方案治疗之后或期间从患者得到的样品中生物标记的量与治疗前从患者得到的样品中该生物标记的量的比较来调节整联蛋白β7拮抗剂的给药方案，其中治疗之后或期间与治疗前相比该生物标记的量的改变是对用于治疗患者中胃肠道疾病的整联蛋白β7拮抗剂的给药方案的功效或应答性的指示。

在一个实施方案中，生物标记的量的改变是增加。

在另一实施方案中，生物标记的量的改变是减少。

在再一个实施方案中，样品是患者的外周血样品。

在一个实施方案中，在接受第一次剂量的整联蛋白β7拮抗剂后的100天内测量接受整联蛋白β7拮抗剂的所述患者血样中生物标记的量。

在另一实施方案中，在施用整联蛋白β7拮抗剂约50天内测量接受整联蛋白β7拮抗剂后所述患者血样中生物标记的量。

在再一个实施方案中，在施用整联蛋白β7拮抗剂约24小时内测量接受整联蛋白β7拮抗剂后所述患者血样中生物标记的量。

在一个实施方案中，胃肠道炎性病症是炎性肠病。

在进一步的实施方案中，所述炎性肠病是局限性回肠炎(CD)或溃疡性结肠炎(UC)。

在另一实施方案中，整联蛋白β7拮抗剂是抗β7整联蛋白抗体。

在另一实施方案中，所述患者是人。

在一个实施方案中，所述改变的量是所述生物标记的量的至少约30％、约50％、约一倍、或约三倍增加。

在一个实施方案中，以约1mg/kg到100mg/kg的量施用抗β7整联蛋白抗体。

在另一个实施方案中，所述量为5mg/kg-50mg//kg。

在一个实施方案中，治疗还包括施用有效量的一种或多种其他药物。

在进一步的实施方案中，所述其他药物是免疫抑制剂、疼痛控制剂、止泻药、抗生素或者一种或多种所述药物的组合。

在更进一步的实施方案中，所述免疫抑制剂是柳氮磺吡啶(sulfasalazine)、5-氨基水杨酸(5-ASA)、Metroidazole、环丙沙星(ciprofloxacin)、硫唑嘌呤(Azathioprine)或6-巯基嘌呤。

在另一实施方案中，所述其他药物是另一种抗β7整联蛋白抗体。

在一个实施方案中，所述抗β7整联蛋白抗体肠胃外施用于所述患者。

在进一步的实施方案中，抗β7整联蛋白抗体静脉内和/或皮下施用于所述患者。

在一个实施方案中，所述抗β7整联蛋白抗体以每1，2，3，4，5，6，8或12周至少一次的频率施用。

在进一步的实施方案中，所述抗β7整联蛋白抗体每周施用。

在另一实施方案中，所述抗β7抗体施用至少1，2，4，6，8，12，24，36，或52周。

在一个实施方案中，抗体是单克隆的。

在另一实施方案中，所述抗体是嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。

在另一实施方案中，所述抗体是抗体片段。

在一个实施方案中，所述抗体抑制人β7整联蛋白亚基与第二种整联蛋白亚基和/或整联蛋白配体的相互作用。

在一个实施方案中，所述第二种整联蛋白亚基是α4整联蛋白亚基，并且其中所述配体是MAdCAM，VCAM或纤连蛋白。

在一个实施方案中，α4整联蛋白亚基来自人。

在一个实施方案中，所述第二种整联蛋白亚基是αE整联蛋白亚基，并且其中所述配体是E-钙黏着蛋白。

在一个实施方案中，所述配体来自人。

在一个实施方案中，αE整联蛋白亚基来自人。

在另一实施方案中，抗β7整联蛋白抗体包含三个重链高变区(HVR-H1-H3)序列和三个轻链高变区(HVR-L1-L3)序列，其中1、2、3、4、5或6个高变区(HVR)选自由下列组成的组：

(i)HVR-L1，包含序列A1-A11，其中A1-A11是RASESVDRYLH(SEQ ID NO：1)；

(ii)HVR-L2，包含序列B1-B8，其中B1-B8是KYASQSIS(SEQ IDNO：2)；

(iii)HVR-L3，包含序列C1-C10，其中C1-C10是QQGNSLLPNT(SEQ ID NO：3)；

(iv)HVR-H1，包含序列D1-D10，其中D1-D10是GFFITNNYWG(SEQ ID NO：4)；

(v)HVR-H2，包含序列E1-E17，其中E1-E17是GYISYSGSTSYNPSLKS(SEQ ID NO：5)；和

(vi)HVR-H3，包含序列F1-F11，其中F1-F11是MTGSSGYFDF(SEQ ID NO：6)。

在再一个实施方案中，所述抗体包含选自由HVR-L1，HVR-L2，HVR-L3，HVR-H1，HVR-H2，和HVR-H3的六个高变区(HVRs)组成的组，其中：

(i)HVR-L1包含氨基酸序列A1-A11，其中A1-A11是RASESVDTYLH(SEQ ID NO：1)；RASESVDSLLH(SEQ ID NO：7)，RASESVDTLLH(SEQ ID NO：8)，或RASESVDDLLH(SEQ ID NO：9)或SEQ ID NOs：1，7，8或9的变体，其中氨基酸A2选自由A，G，S，T和V组成的组和/或氨基酸A3选自由S，G，I，K，N，P，Q，R和T组成的组，和/或A4选自由E，V，Q，A，D，G，H，I，K，L，N和R组成的组，和/或氨基酸A5选自由S，Y，A，D，G，H，I，K，N，P，R，T和V组成的组，和/或氨基酸A6选自由V，R，I，A，G，K，L，M和Q组成的组，和/或氨基酸A7选自由D，V，S，A，E，G，H，I，K，L，N，P，S和T组成的组，和/或氨基酸A8选自由D，G，N，E，T，P和S组成的组，和/或氨基酸A9选自由L，Y，I和M组成的组，和/或氨基酸A10选自由L，A，I，M和V组成的组和/或氨基酸A11选自由H，Y，F和S组成的组；

(ii)HVR-L2包含氨基酸序列B1-B8，其中B1-B8是KYASQSIS(SEQ ID NO：2)，RYASQSIS(SEQ ID NO：67)，或XaaYASQSIS(SEQ IDNO：68)，其中Xaa代表任意氨基酸，或SEQ ID NOs：2，67或68的变体，其中氨基酸B1选自由K，R，N，V，A，F，Q，H，P，I，L，Y和Xaa(其中Xaa代表任意氨基酸)组成的组，和/或氨基酸B4选自由S和D组成的组，和/或氨基酸B5选自由Q和S组成的组，和/或氨基酸B6选自由S，D，L和R组成的组，和/或氨基酸B7选自由I，V，E和K组成的组；

(iii)HVR-L3包含氨基酸序列C1-C9，其中C1-C9是QQGNSLPNT(SEQ ID NO：3)或SEQ ID NO：3的变体其中氨基酸C8选自由N，V，W，Y，R，S，T，A，F，H，I L，M和Y组成的组；

(iv)HVR-H1包含氨基酸序列D1-D10其中D1-D10是GFFITNNYWG(SEQ ID NO：4)；

(v)HVR-H2包含氨基酸序列E1-E17其中E1-E17是GYISYSGSTSYNPSLKS(SEQ ID NO：5)，或SEQ ID NO：5的变体其中氨基酸E2选自由Y，F，V和D组成的组，和/或氨基酸E6选自由S和G组成的组，和/或氨基酸E10选自由S和Y组成的组，和/或氨基酸E12选自由N，T，A和D组成的组，和/或氨基酸E13选自由P，H，D和A组成的组，和/或氨基酸E15选自由L和V组成的组，和/或氨基酸E17选自由S和G组成的组；和

(vi)HVR-H3包含氨基酸序列F2-F11其中F2-F11是MTGSSGYFDF(SEQ ID NO：6)或RTGSSGYFDF(SEQ ID NO：66)；或包含氨基酸序列F1-F11，其中F1-F11是AMTGSSGYFDF(SEQ ID NO：63)，ARTGSSGYFDF(SEQ ID NO：64)，或AQTGSSGYFDF(SEQ ID NO：65)，或SEQ ID NOs：6，63，64，65或66的变体，其中氨基酸F2是R，M，A，E，G，Q，S，和/或氨基酸F11选自由F和Y组成的组。

在另一实施方案中，所述抗体还包含构架，其中构架位置71处的氨基酸是R或A，并且构架位置73处的氨基酸是N或T，并且构架位置78处的氨基酸是F或A或L。

在另一实施方案中，所述抗体还包含重链人亚组III重链共有构架序列，其包含位置71，73和/或78处的取代。

在一个实施方案中，取代是R71A，N73T，，L78A或L78F。

在另一实施方案中，序列HVR-H2位置E1-E1和HVR-H3位置F1-F11之间的构架序列是HFR3-1-HFR3-31，并且其中HFR3-6是A或R，HFR3-8是N或T，HFR3-13是L或A或F。

在再一个实施方案中，重链构架位置71包含氨基酸R或A，和/或重链构架位置73包含T或N，和/或重链构架位置78包含F或A或L。序列包含重链构架位置71。

在示例性实施方案中，抗体包含三个重链高变区(HVR-H1-H3)序列和三个轻链高变区(HVR-L1-L3)序列，其中：

(i)HVR-L1包含SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9；

(ii)HVR-L2包含SEQ ID NO：2；

(iii)HVR-L3包含SEQ ID NO：3；

(iv)HVR-H1包含SEQ ID NO：4；

(v)HVR-H2包含SEQ ID NO：5；和

(vi)HVR-H3包含SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：63或SEQ IDNO：64或SEQ ID NO：66。

在再一个示例性实施方案中，所述人源化抗体包含SEQ ID NO：25的轻链可变区序列，和SEQ ID NO：26的重链可变区序列。

在一个实施方案中，所述抗体结合到包含SEQ ID NO：10和SEQ IDNO：11，或SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13的轻链和重链可变区序列的抗体的相同表位。

一方面，本发明涉及设计用候选试剂治疗诊断为胃肠道炎性病症的人类患者的方法，包括基于响应所述候选试剂的治疗有效增加非人受试者的外周血中生物标记的量的剂量确定人类患者的有效剂量。

在一个实施方案中，所述非人受试者是猴子。

在另一方面，本发明涉及预测患者的炎性肠病的预后的方法，包括比较所述患者血样中肠归巢淋巴细胞的量和外周归巢淋巴细胞的量的比率与健康个体血样中肠归巢淋巴细胞的量和外周归巢淋巴细胞的量的比率，其中所述患者的比率与健康个体的比率相比降低指示该疾病的预后。

在另一方面，本发明涉及鉴定包含表达αEβ7整联蛋白的淋巴细胞和表达α4β7整联蛋白的淋巴细胞的淋巴细胞群体的方法，包括将所述淋巴细胞与分离的抗体结合，所述分离的抗体与包含SEQ ID NO：25的轻链可变区序列和SEQ ID NO：26的重链可变区序列的抗体结合相同的表位。

在一个实施方案中，所述淋巴细胞在诊断为炎性肠病的患者的外周血中。

在另一实施方案中，所述淋巴细胞在诊断为炎性肠病的患者肠的淋巴结和组织中。

附图简述

图1显示了猕猴外周血中CD4⁺淋巴细胞亚型。

图2显示了对猕猴给予12次静脉内剂量的5，15，或50mg/kg rhuMAbBeta7或者12次静脉内和皮下剂量的载体后，外周血中组平均(±SD)CD45RA^-β7^高CD4⁺淋巴细胞。

图3显示了对猕猴给予12次皮下剂量的15或50mg/kg rhuMAb Beta7或者12次静脉内和皮下剂量的载体后，外周血中组平均(±SD)CD45RA^-β7^高CD4⁺淋巴细胞(绝对计数，％BL)。

图4显示了对猕猴给予12次静脉内剂量的5，15，或50mg/kgrhuMAb Beta7或者12次静脉内和皮下剂量的载体后，外周血中组平均(±SD)CD45RA^-β7^低CD4+淋巴细胞(绝对计数，％BL)。

图5显示了对猕猴给予12次皮下剂量的15或50mg/kg rhuMAb Beta7或者12次静脉内和皮下剂量的载体后，外周血中组平均(±SD)CD45RA^-β7^低CD4+淋巴细胞(绝对计数，％BL)。

图6显示了对猕猴给予12次静脉内剂量的5，15，或50mg/kgrhuMAb Beta7或者12次静脉内和皮下剂量的载体后，外周血中组平均(±SD)CD45RA⁺β7^中CD4+淋巴细胞(绝对计数，％BL)。

图7显示了对猕猴给予12次皮下剂量的15或50mg/kg rhuMAb Beta7或者12次静脉内和皮下剂量的载体后，外周血中组平均(±SD)CD45RA⁺β7^中CD4+淋巴细胞(绝对计数，％BL)。

图8显示了施用rhuMAb Beta7四次每周静脉内剂量的25mg/kgrhuMAb Beta7或载体后外周血中记忆/效应“肠归巢”CD45RA-β7^高CD4+淋巴细胞计数的暂时增加(绝对计数，％BL)。

图9(A-D)显示了血清rhuMAb Beta7浓度(微克/微升)和在CD45RA-β7^高记忆/效应CD45RA-CD4+外周血淋巴细胞上β7受体的占据。

图10(A-D)显示了外周血中‘肠归巢’CD45RA-β7^高记忆/效应CD4+淋巴细胞的暂时增加与CD45RA-β7^高记忆/效应CD4+淋巴细胞上β7受体的占据相关。

图11显示了rhuMAb Beta7抑制淋巴细胞体内归巢到CD45RBhigh-重构的SCID小鼠的发炎的结肠而不是脾脏。

图12A和12B显示了如下的可变轻链和重链序列的比对：

轻链人亚组κI共有序列(图12A，SEQ ID NO：23)，重链人亚组III共有序列(FIG.12B，SEQ ID NO：24)，大鼠抗小鼠β7抗体(Fib504)可变轻链(图12A，SEQ ID NO：10)，大鼠抗小鼠β7抗体(Fib504)可变重链(图12B，SEQID NO：11)，和人源化抗体变体：人源化hu504K移植可变轻链(图12A，SEQID NO：25)，人源化hu504K移植可变重链(图12B，SEQ ID NO：26)，变体hu504.5(对于变体hu504.5，hu504.16，和hu504.32，从人源化hu504K移植物(graft)的氨基酸变异在图12A(轻链)和图12B重链)中指出。

图13显示了12次皮下或静脉内剂量的载体后猕猴中CD45RA-Beta7^高记忆/效应CD4+淋巴细胞(绝对计数，％BL)。

图14显示了12次静脉内剂量的5mg/kg rhuMAb Beta7后猕猴中CD45RA-Beta7^高记忆/效应CD4+淋巴细胞(绝对计数，％BL)。

图15显示了12次静脉内剂量的15mg/kg rhuMAb Beta7后猕猴中CD45RA-Beta7^高记忆/效应CD4+淋巴细胞(绝对计数，％BL)。

图16显示了12次静脉内剂量的50mg/kg rhuMAb Beta7后猕猴中CD45RA-Beta7^高记忆/效应CD4+淋巴细胞(绝对计数，％BL)。

图17显示了12次皮下剂量的15mg/kg rhuMAb Beta7后猕猴中CD45RA-Beta7^高记忆/效应CD4+淋巴细胞(绝对计数，％BL)。

图18显示了12次皮下剂量的50mg/kg rhuMAb Beta7后猕猴中CD45RA-Beta7^高记忆/效应CD4+淋巴细胞(绝对计数，％BL)。

图19显示了12次静脉内剂量的5，15，或50mg/kg rhuMAb Beta7或12次静脉内和皮下剂量的载体后猕猴中CD45RA^-β7^高CD4⁺淋巴细胞(MOEF[％基线]，组平均±SD)；MOEF＝等量荧光的分子。

图20显示了12次皮下剂量的15或50mg/kg rhuMAb Beta7或12次静脉内和皮下剂量的载体后猕猴中CD45RA^-β7^高CD4⁺淋巴细胞(MOEF[％基线]，组平均±SD)MOEF＝等量荧光的分子。

图21显示了12次静脉内剂量的5，15，或50mg/kg rhuMAb Beta7或12次静脉内和皮下剂量的载体后猕猴中CD45RA⁺β7^中CD4⁺淋巴细胞(MOEF[％基线]，组平均±SD)；MOEF＝等量荧光的分子。

图22显示了12次皮下剂量的15或50mg/kg rhuMAb Beta7或12次静脉内和皮下剂量的载体后CD45RA⁺β7^中CD4⁺淋巴细胞(MOEF[％基线]，组平均±SD)；MOEF＝等量荧光的分子。

图23显示了对猕猴四次每周静脉内推注剂量的5或25mg/kgrhuMAbβ7后rhuMAbβ7的平均(±SD)血清浓度。

图24显示了对猕猴四次每周静脉内推注剂量的25mg/kg rhuMAbβ7后来自4只痊愈动物的实际平均(±SD)血清浓度和rhuMAbβ7的模型预测的血清浓度。

图25显示了猕猴外周血中CD4 T-细胞亚型。

图26显示了对猕猴四次每周静脉内推注剂量的载体或5或25mg/kgrhuMAbβ7后平均(±SD)绝对外周血CD45RA^-β7^高CD4⁺T-细胞计数(表示为预剂量(predose)基线的百分数)。

图27显示了对猕猴四次每周静脉内推注剂量的载体或5或25mg/kgrhuMAbβ7后平均(±SD)绝对外周血CD45RA⁺β7^中CD4⁺T-细胞计数(表示为预剂量基线的百分数)。

图28显示了对猕猴四次每周静脉内推注剂量的载体或25mg/kgrhuMAbβ7后个体绝对外周血CD45RA^-β7^高CD4⁺T-细胞计数(表示为预剂量基线的百分数)。

图29显示了对猕猴四次每周静脉内推注剂量的载体，5或25mg/kgrhuMAbβ7后平均(±SD)绝对外周血淋巴细胞计数(表示为预剂量基线的百分数)。

图30显示了对每组猕猴四次每周静脉内推注剂量的5或25mg/kgrhuMAbβ7后平均(±SD)绝对外周血CD3⁺T细胞计数(表示为预剂量基线的百分数)。

图31显示了对每组猕猴四次每周静脉内推注剂量的5或25mg/kgrhuMAbβ7后平均(±SD)绝对外周血CD20⁺B细胞计数(表示为预剂量基线的百分数)。

图32A显示了四次每周施用静脉内推注剂量的25mg/kg rhuMAbβ7后个体猕猴中随时间rhuMAbβ7的血清浓度和未占据的外周血CD4⁺β7^高CD45RA^-T细胞之间的关系(动物23)。

图32B显示了四次每周施用静脉内推注剂量的25mg/kg rhuMAbβ7后个体猕猴中随时间rhuMAbβ7的血清浓度和未占据的外周血CD4⁺β7^高CD45RA^-T细胞之间的关系(动物24)。

图32C显示了四次每周施用静脉内推注剂量的25mg/kg rhuMAbβ7后个体猕猴中随时间rhuMAbβ7的血清浓度和未占据的外周血CD4⁺β7^高CD45RA^-T细胞之间的关系(动物25)。

图32D显示了四次每周施用静脉内推注剂量的25mg/kg rhuMAbβ7后个体猕猴中随时间rhuMAbβ7的血清浓度和未占据的外周血CD4⁺β7^高CD45RA^-T细胞之间的关系(动物26)。

图33显示了四次每周施用静脉内推注剂量的25mg/kg rhuMAbβ7后个体猕猴中随时间rhuMAbβ7的血清浓度和未占据的外周血CD4⁺β7^高CD45RA^-T细胞之间的关系。

图34A显示了四次每周静脉内推注剂量的25mg/kg rhuMAbβ7后个体猕猴中随时间绝对β7^高-表达记忆/效应(CD45RA^-)CD4⁺T-细胞和未占据的外周血CD4⁺β7^高CD45RA^-T细胞之间的关系(动物23)。

图34B显示了四次每周静脉内推注剂量的25mg/kg rhuMAbβ7后个体猕猴中随时间绝对β7^高-表达记忆/效应(CD45RA^-)CD4⁺T-细胞和未占据的外周血CD4⁺β7^高CD45RA^-T细胞之间的关系(动物24)。

图34C显示了四次每周静脉内推注剂量的25mg/kg rhuMAbβ7后个体猕猴中随时间绝对β7^高-表达记忆/效应(CD45RA^-)CD4⁺T-细胞和未占据的外周血CD4⁺β7^高CD45RA^-T细胞之间的关系(动物25)。

图34D显示了四次每周静脉内推注剂量的25mg/kg rhuMAbβ7后个体猕猴中随时间绝对β7^高-表达记忆/效应(CD45RA^-)CD4⁺T-细胞和未占据的外周血CD4⁺β7^高CD45RA^-T细胞之间的关系(动物26)。

图35显示了平均绝对外周血CD4⁺β7^高CD45RA^-T细胞计数。

图36显示了平均绝对外周血CD8⁺β7^高CD45RA^-T细胞计数。

图37显示了平均绝对外周血CD4⁺β7^中CD45RA^-T细胞计数。

图38显示了平均绝对外周血CD8⁺β7^中CD45RA^-T细胞计数。

图39显示了rhuMabβ7的血清浓度和可用的β7-表达外周血CD4⁺β7^高CD45RA^-T细胞之间的关系。

图40显示了rhuMabβ7的血清浓度和可用的β7-表达外周血CD8⁺β7^高CD45RA^-T细胞之间的关系。

优选实施方案详述

I.定义

如本文所用，关于患者应答或者患者应答性，术语“预测”在本文中用于指患者将有利地或不利地应答一种药物或一组药物的可能性。在一个实施方案中，预测涉及那些应答的程度。在一个实施方案中，预测涉及在治疗，例如用特定治疗剂，如抗β7-整联蛋白抗体治疗后患者将是否存活或改善和/或将存活或改善，并且在一定时间内无疾病复发的概率。例如，本发明的预测方法可临床上用于通过为任何具体患者选择最合适的治疗方式用于做出治疗决定。本发明的预测方法是有价值的工具，用于预测患者是否可能有利地应答治疗方案，包括例如，施用给定的治疗剂或组合、手术介入、类固醇治疗等等，或者治疗方案后患者的长期存活是否可能。

“治疗”指临床介入，其试图改变被治疗的个体或细胞的自然过程，并且可以为了预防或者在临床病理的过程中进行。希望的治疗效果包括预防疾病的发生或复发、减轻症状、减少疾病的任何直接或间接病理学结果，减低疾病发展速率，减轻或缓和疾病状态，和缓和或者改善的预后。

“治疗方案”指剂量、施用频率或治疗持续时间、加入或不加入第二种药物的组合。

“有效治疗方案”指将对接受该治疗的患者提供有益应答的治疗方案。

“改变治疗”指改变治疗方案，包括改变剂量、施用频率或治疗持续时间，和/或加入第二种药物。

“患者应答”或“患者应答性”可以用任何表明对患者的益处的终点评估，所述益处包括但不限于，(1)在一定程度上抑制疾病发展，包括减慢和完全阻止；(2)疾病发作次数的减少和/或症状减轻；(3)损伤大小的减小；(4)疾病细胞向临近外周器官和/或组织的渗入的抑制(即减少、减慢或完全停止)；(5)疾病扩散的抑制(即减少、减慢或完全停止)；(6)自身免疫应答的减少，其可以但不是必须导致疾病损伤的退化或消融；(7)在一定程度上减轻与该病症相关的一种或多种症状；(8)增加治疗后无疾病表象的长度；和/或(9)减少治疗后给定时间点的死亡率。术语“应答性”指可测量的应答，包括完全应答(CR)和部分应答(PR)。

“完全应答”或“CR”意指应答治疗，炎症的所有病征消失或者缓和。这不总是指疾病已经被治愈。

“部分应答”或者“PR”指应答治疗，炎症的严重性降低至少50％。

患者对整联蛋白β7拮抗剂治疗的“有益应答”和类似措辞指由于用拮抗剂如抗β7整联蛋白抗体的治疗，赋予有危险患有或者患有胃肠道炎性病症的患者临床的或者治疗益处。此类益处包括细胞或生物学应答、完全应答、部分应答、稳定的疾病(没有发展或复发)，或者由于拮抗剂治疗，患者具有较晚复发的应答。

当患者的应答性在治疗期间不随时间降低时，“患者保持对治疗的应答性”。

术语“诊断”在本文中指分子或病理学状态、疾病或状况的鉴定或分类。例如，“诊断”可以指通过组织/器官涉及(例如，炎性肠病)，或通过其他特征(例如，特征为对治疗，如对整联蛋白β7拮抗剂的治疗的应答性的患者亚群)对特定类型的胃肠道炎性病症鉴定，更具体地，特定亚型的胃肠道炎性病症的分类。

术语“预后”在本文中用于指预测疾病症状的可能性，如胃肠道炎性病症的复发、加剧和药物抗性。

本文所用的术语“样品”指得自或来自目的受试者的组合物，其含有待例如基于物理、生化、化学和/或生理学特征表征和/或鉴定的细胞和/或其他分子实体。例如，短语“疾病样品”和其变体指从目的受试者得到的任何样品，将预期或已知其含有待表征的细胞和/或分子实体。样品可以得自目的受试者的组织或者受试者的外周血。

“β7整联蛋白拮抗剂”或者“β7拮抗剂”指抑制β7整联蛋白的一种或多种生物活性或阻断其与一种或多种其相关分子结合的任何分子。本发明的拮抗剂可以用于调节β7相关的效果的一个或多个方面，包括但不限于与α4整联蛋白亚基的结合、与αE整联蛋白亚基的结合、α4β7整联蛋白与MAdCAM，VCAM-1或纤连蛋白的结合，和αEβ7整联蛋白与E-钙黏着蛋白的结合。这些效果可以通过任何生物学相关的机理调节，包括破坏配体与β7亚基或者与α4β7或αEβ二聚体整联蛋白的结合，和/或通过破坏α和β整联蛋白亚基之间的结合，使得二聚体整联蛋白的形成被抑制。在本发明的一个实施方案中，β7拮抗剂是抗β7整联蛋白抗体(或抗β7抗体)。在一个实施方案中，抗β7整联蛋白抗体是人源化抗-β7整联蛋白抗体，更具体地，重组人源化单克隆抗-β7抗体(或rhuMAb β7)。在一些实施方案中，本发明的抗-β7抗体是抗-整联蛋白β7拮抗抗体，其抑制或阻断β7亚基与α4整联蛋白亚基的结合，与αE整联蛋白亚基的结合，α4β7整联蛋白与MAdCAM，VCAM-1或纤连蛋白的结合，和αEβ7整联蛋白与E-钙黏着蛋白的结合。

″β7亚基″或″.β.7亚基″指人.β.7整联蛋白亚基(Erle et al.，(1991)J.Biol.Chem.266：11009-11016)。β7亚基与α4整联蛋白亚基，如人.α.4亚基(Kilger and Holzmann(1995)J.Mol.Biol.73：347-354)结合。据报导α4β7整联蛋白在多数成熟淋巴细胞，以及少数群体的胸腺细胞、骨髓细胞和肥大细胞上表达(Kilshaw and Murant(1991)Eur.J.Immunol.21：2591-2597；Gurish et al.，(1992)149：1964-1972；和Shaw，S.K.and Brenner，M.B.(1995)Semin.Immunol.7：335)。β7亚基也与αE亚基，如人αE整联蛋白亚基结合(Cepek，K.L，et al.(1993)J.Immunol.150：3459)。αEβ7整联蛋白在肠内上皮淋巴细胞(iIELs)上表达(Cepek，K.L.(1993)同上)。

″αE亚基″或″αE整联蛋白亚基″或″.α.E亚基″或″.α.E整联蛋白亚基″或″CD103″指发现与上皮内淋巴细胞上的β7整联蛋白结合的整联蛋白亚基，所述αEβ7整联蛋白介导iELs与表达E-钙黏着蛋白的肠上皮的结合(Cepek，K.L.et al.(1993)J.Immunol.150：3459；Shaw，S.K.and Brenner，M.B.(1995)Semin.Immunol.7：335)。

″MAdCAM″或″MAdCAM-1″在本发明上下文中可互换使用并且指蛋白质粘膜地址素细胞粘附分子-1，其是单链多肽，包含短胞质尾区、跨膜区和由三个免疫球蛋白样结构域组成的细胞外序列。已经克隆了小鼠、人和猕猴MAdCAM-1的cDNA(Briskin，et al.，(1993)Nature，363：461-464；Shyjan et al.，(1996)J.Immunol.156：2851-2857)。

″VCAM-1″或″血管细胞粘附分子-1″″CD106″指α4β7和α4β1的配体，在活化的内皮上表达并且在内皮-白细胞相互作用，如炎症期间白细胞的结合和移行中是重要的。

“CD45”指蛋白质酪氨酸磷酸酶(PTP)家族的蛋白质。已知PTP是信号分子，其调节多种细胞过程，包括细胞生长、分化、有丝分裂周期，和致癌性转化。该PTP含有细胞外结构域、单跨膜区段和两个串联胞质内催化结构域，从而属于受体型PTP。该基因在造血细胞中特异表达。已经表明该PTP是T和B细胞抗原受体信号转导的基本调节子。它通过与抗原受体复合体的组分直接相互作用，或者通过活化抗原受体信号转导所需的多种Src家族激酶发挥功能。该PTP也抑制JAK激酶，从而作为细胞因子受体信号转导的调节子发挥功能。已经报导了该基因的四种选择性剪接转录物变体，其编码不同的同种型(Tchilian EZ，Beverley PC(2002).″CD45in memory and disease.″Arch.Immunol.Ther.Exp.(Warsz.)50(2)：85-93.Ishikawa H，Tsuyama N，Abroun S，et al.(2004).″Interleukin-6，CD45 andthe src-kinases in myeloma cell proliferation.″Leuk.Lymphoma 44(9)：1477-81)。

存在CD45的多种同种型：CD45RA，CD45RB，CD45RC，CD45RAB，CD45RAC，CD45RBC，CD45RO，CD45R(ABC)。CD45也是高度糖基化的。CD45R是最长的蛋白质并且当从T细胞分离时迁移到200kDa。B细胞也表达具有较高糖基化的CD45R，使得分子量达到220kDa，所以名为B220；为220kDa的B细胞同种型。B220表达不局限于B细胞，并且也可以在活化的T细胞上、在树突细胞的亚群(subset)和其他抗原呈递细胞上表达。Stanton T，Boxall S，Bennett A，et al.(2004).″CD45 variant alleles：possiblyincreased frequency of a novel exon 4 CD45 polymorphism in HIVseropositive Ugandans.″Immunogenetics 56(2)：107-10。

“肠归巢淋巴细胞”指淋巴细胞的亚群(subgroup)，其具有选择性归巢到肠淋巴结和组织但是不归巢到外周淋巴结和组织的特征。该亚群的淋巴细胞的特征是多种细胞表面分子组合的独特表达模式，包括但不限于，CD4，CD45RA和Beta7的组合。典型地，至少两个亚群的外周血CD4⁺淋巴细胞可以基于CD45RA和Beta7，CD45RA^-，和CD45RA^-CD4⁺细胞的标记细分。CD45RA^-CD4⁺细胞优先归巢到肠淋巴结和组织，而CD45RA^-CD4⁺细胞优先归巢到外周淋巴结和组织(Rott etal.1996；Rott et al.1997；Williams et al.1998；Roséet al.1998；Williams andButcher 1997；Butcher et al.1999)。肠归巢淋巴细胞因此是在流式细胞术测定法中被鉴定为CD45RA^-CD4⁺的不同的亚群淋巴细胞。鉴定该组淋巴细胞的方法是本领域公知的并且也详细公开在本申请的实施例中。

如本文关于细胞表面标记所用的，符号“+”指出细胞表面标记的阳性表达。例如，CD4⁺淋巴细胞是在它们的细胞表面上表达CD4的一组淋巴细胞。

如本文关于细胞表面标记所用的，符号“-”指出细胞表面标记的阴性表达。例如，CD45RA^-淋巴细胞是在它们的细胞表面上不表达CD45RA的一组淋巴细胞。

如本文关于细胞表面标记的表达所用的，符号“低”指出在淋巴细胞上细胞表面标记的相对低水平的表达，而“高”指出在淋巴细胞上细胞表面标记的相对高水平的表达。在流式细胞术中，的强度高于至少约10或100倍。从而，如示例性实施方案中提供的，CD45RA^-CD4⁺和CD45RA^-CD4⁺淋巴细胞定位于流式细胞术分析的点图或者直方图的不同部分，其中X轴是CD45AR表达的强度，Y轴是B7表达的强度。

“外周归巢淋巴细胞”指淋巴细胞亚群，其具有归巢到外周淋巴结和组织并且不归巢到肠淋巴结和组织的特征。在示例性实施方案中，如上面解释，外周归巢淋巴细胞是在流式细胞术测定中被鉴定为CD45RA^-CD4⁺细胞的特征性的一组淋巴细胞。鉴定该组淋巴细胞的方法是本领域公知的并且在本申请中详细公开。

使用本领域已知的方法可以确定生物标记的“量”或“水平”。例如，在示例性实施方案中，与患者对整联蛋白β7拮抗剂的治疗的应答性相关的肠归巢淋巴细胞的“量”或“水平”是在生物样品，优选在外周血样中可检测的水平。肠归巢淋巴细胞的量可通过本领域技术人员已知的和本发明中公开的方法，如流式细胞术分析定量。

在一些实施方案中，将生物标记的“升高”或“增加”量或水平与生物标记的参考/比较量进行比较。作为参考或比较量的值的函数，增加优选大于约10％、优选大于约30％、优选大于约50％、优选大于约100％、优选大于约300％。例如，参考或比较量可以是治疗前生物标记的量，更具体地，可以是基线或者预剂量的量。

例如，在一个实施方案中，肠归巢淋巴细胞的“量”或“水平”表示淋巴细胞的数目足够增加使得本领域技术人员将认为在所述值测量的生物学特征的上下文内，增加是统计学显著的。作为淋巴细胞的参考/比较量的值的函数，增加优选大于约10％、优选大于约30％、优选大于约50％、优选大于约100％、优选大于约300％。

在一些实施方案中，生物标记的“降低的”量或水平是与生物标记的参考/比较量比较的。作为参考或比较量的值的函数，降低优选小于约10％、优选小于约30％、优选小于约50％、优选小于约100％、优选小于约300％。例如，参考或比较量可以是治疗前生物标记的量，尤其可以是基线或者预剂量的量。

例如，“有效增加肠归巢淋巴细胞的量的治疗”指足够增加淋巴细胞数目的治疗，使得本领域技术人员将认为所述增加在所述值度量的生物学特征的背景中是统计学显著的。作为治疗前淋巴细胞的参考或比较量的值的函数，增加优选大于约10％、优选大于约30％、优选大于约50％、优选大于约100％、优选大于约300％。

如本文所用的短语“不实质性改变”指轻微程度的改变，使得本领域技术人员将不认为所述改变在所述值(如淋巴细胞的量)度量的生物学特征的背景中是统计学显著的。改变优选小于约10％、优选小于约5％、优选小于约1％。

″胃肠道炎性病症″是一组慢性病征，其引起粘膜中的炎症和/或溃疡。这些病症包括例如，炎性肠病(例如，局限性回肠炎、溃疡性结肠炎、不定结肠炎和传染性结肠炎)、粘膜炎(mucositis)(如口腔粘膜炎(oralmucositis)，胃肠道粘膜炎，鼻粘膜炎和直肠炎)，坏死性小肠结肠炎(necrotizing enterocolitis)和食管炎(esophagitis)。在优选实施方案中，胃肠道炎性病症是炎性肠病。

“炎性肠病”或“IBD”在本文中可互换使用，指肠的疾病，其引起炎症和/或溃疡并且包括但不限于局限性回肠炎和溃疡性结肠炎。

“局限性回肠炎(CD)”或“溃疡性结肠炎(UC)”是未知病因的慢性炎性肠病。不像溃疡性结肠炎，局限性回肠炎可以影响肠的任何部分。局限性回肠炎的最显著特征是肠壁的粒状、淡红-紫色edmatous增厚。随着炎症的发展，这些肉芽肿通常丧失其被限制的边界并且与周围组织整合。腹泻和肠的阻塞是显著的临床特征。随着溃疡性结肠炎，局限性回肠炎的过程可以是连续的或复发的，轻微的或严重的，但是不像溃疡性结肠炎，局限性回肠炎不能通过肠的有关节段的切除治愈。多数局限性回肠炎患者需要在某个点手术，但是随后的复发是常见的并且通常需要连续的药物治疗。

局限性回肠炎可涉及从嘴到肛门的消化道的任何部分，尽管通常其出现在回肠结肠、小肠或结肠-肛门直肠区域。组织病理学上，该疾病表现为不连续的granulomatomas、隐窝脓肿、龟裂和口疮溃疡。炎症性浸润物是混合的，由淋巴细胞(T和B细胞)、浆细胞、巨噬细胞和嗜中性粒细胞组成。在分泌IgM-和IgG的浆细胞、巨噬细胞和嗜中性粒细胞中有不成比例的增加。

抗炎症药物柳氮磺吡啶和5-氨基水杨酸(5-ASA)可用于治疗轻度活性的结肠局限性回肠炎并且通常被建议保持该疾病的缓和。Metroidazole和环丙沙星的功效与柳氮磺吡啶相似并且似乎尤其可用于治疗肛周疾病。在更严重的病例中，皮质类固醇可有效治疗活性恶化并且可以甚至保持缓和。硫唑嘌呤(azathioprine)和6-巯基嘌呤已经在需要长期施用皮质类固醇的患者中显示出成功。还可能的是这些药物在长期预防中起作用。不幸的是，在一些患者中发挥作用前，存在非常长的延迟(长达六个月)。抗腹泻药物也可以在一些患者中提供症状减轻。营养疗法或要素膳食可以改进患者的营养状态并且诱导急性疾病的症状改善，但是它不诱导持续的临床缓和。抗生素用于治疗继发性小肠细菌过度生长和治疗化脓性并发症。

“溃疡性结肠炎(UC)”折磨大肠。该疾病的过程可以是持续的或复发的、轻微的或严重的。最早的损伤是炎性浸润，在肠腺(crypts of Lieberkuhn)基部形成脓肿。这些膨胀的和破裂的隐窝的合并倾向于分离覆盖的粘膜与其血液供应，导致溃疡形成。该疾病的症状包括腹部绞痛、下腹痛、直肠出血，和经常的稀的排泄物，其主要由血液、脓和粘液与极少的粪便颗粒组成。急性、严重或慢性的持续性溃疡性结肠炎可能需要全结肠切除术。

UC的临床特征是高度可变的，并且发作可以是隐伏的或突然的，并且可以包括腹泻、里急后重和复发性直肠出血。可能发生整个结肠的爆发性累及、中毒性巨结肠、危及生命的紧急状况。肠外表现包括关节炎、pyoderma gangrenoum、葡萄膜炎和结节性红斑.

UC的治疗包括用于轻微病例的柳氮磺吡啶和相关含水杨酸的药物，在严重病例中使用皮质类固醇药物。水杨酸类药或者皮质类固醇的局部使用在有时是有效的，尤其当疾病局限于末端肠时，并且与全身性使用相比与降低的副作用有关。有时表示需要支持性措施，如施用铁和抗腹泻剂。硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤和甲氨蝶呤有时也被建议用于顽固性皮质类固醇依赖性病例。

“有效剂量”指在必要的剂量和时间内，有效实现希望的治疗或预防结果的量。

本文使用的术语“患者”指想得到治疗的任何单个动物，更优选哺乳动物(包括此类非人动物，如狗、猫、马、兔、动物园动物、奶牛、猪、绵羊和非人灵长类)。最优选地，本文的患者是人。

术语“非人受试者”指任何单个非人动物，更优选哺乳动物(包括此类非人动物，如狗、猫、马、兔、动物园动物、奶牛、猪、绵羊和非人灵长类)。

术语“抗体”和“免疫球蛋白”以在最宽的意义上可互换使用，并且包括单克隆抗体(例如，全长或完整的单克隆抗体)、多克隆抗体、多价抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体，只要它们显示出希望的生物学活性)，并且也可以包括某些抗体片段(如本文更详细描述)。抗体可以是人、人源化的和/或亲和力成熟的。

“抗体片段”包括完整抗体的仅仅一部分，其中该部分优选保留与该部分存在于完整抗体中时通常相关功能的至少一种，优选多数或全部。在一个实施方案中，抗体片段包含完整抗体的抗原结合部位从而保持结合抗原的能力。在另一实施方案中，抗体片段，如包含Fc区的抗体片段保留通常与该Fc区存在于完整抗体时相关的生物学功能的至少一种，如FcRn结合、抗体半寿期调节、ADCC功能和补体结合。在一个实施方案中，抗体片段是单价抗体，其具有基本上类似于完整抗体的体内半寿期。例如，此类抗体片段可以包含与能够赋予该片段的体内稳定性的Fc序列连接的抗原结合臂。

本文使用的术语“单克隆抗体”指从基本上同质性抗体群体得到的抗体，所述同质性抗体即包含除了以少量存在的可能的天然发生突变之外相同群体的各抗体。单克隆抗体是高度特异的，针对单一抗原。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相比，每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。

本文的单克隆抗体特别包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与来自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中对应序列相同或同源，链的剩余部分与来自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中对应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们显示出希望的生物活性(美国专利号4,816,567；和Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81：6851-6855(1984))。

非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式是含有来自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。通常，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的高变区的残基被来自非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物的高变区的残基替换，所述抗体具有希望的特异性、亲和力和能力。在一些情况下，人免疫球蛋白的构架区(FR)残基被对应的非人残基替换。此外，人源化抗体可以包含在受体抗体或供体抗体中没有发现的残基。进行这些修饰以进一步改良抗体性能。通常，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个、通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的那些高变环，并且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的那些FR。人源化抗体任选将也包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，典型地为人免疫球蛋白的恒定区。关于进一步的细节，见Jones et al.，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature332：323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。也参见下面的综述文章和其中引用的参考文献：Vaswani and Hamilton，Ann.Allergy，Asthma & Immunol.1：105-115(1998)；Harris，Biochem.Soc.Transactions 23：1035-1038(1995)；Hurle and Gross，Curr.Op.Biotech.5：428-433(1994)。

“人抗体”是这样的抗体，其包含对应于人产生的抗体的氨基酸序列或者使用本文公开的任一种制备人抗体的技术制备。此类技术包括筛选人来源的组合文库，如噬菌体展示文库(见，例如，Marks et al.，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)和Hoogenboom et al.，Nucl.Acids Res.，19：4133-4137(1991))；使用人骨髓瘤和小鼠-人杂骨髓瘤细胞系产生人单克隆抗体(见，例如，Kozbor J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur et al.，Monoclonalantibody Production Techniques and Applications，pp.55-93(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987)；和Boerner et al.，J.Immunol.，147：86(1991))；和在转基因动物(例如，小鼠)中产生单克隆抗体，所述转基因动物能够在不存在内源免疫球蛋白产生的情况下产生人抗体的全部组成成分(见，例如，Jakobovits et al.，Proc.Natl.Acad.Sci USA，90：2551(1993)；Jakobovitset al.，Nature，362：255(1993)；Bruggermann et al.，Year in Immunol.，7：33(1993))。该人抗体的定义特别排除包含来自非人动物的抗原结合残基的人源化抗体。

“分离的”抗体是已经被鉴定并分离和/或从其天然环境的组分回收的抗体。它的天然环境的污染性组分是将干扰该抗体的诊断或治疗用途的物质，并且可以包括酶、激素和其他蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选实施方案中，抗体将被纯化到(1)如通过lowry方法测定，按抗体的重量计大于95％，并且最优选按重量计大于99％，(2)通过使用旋转杯序列分析仪测定，足够得到N-末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或(3)通过SDS-PAGE在还原或非还原条件下使用考马斯蓝或者优选使用银染测定为同质性。分离的抗体包括在重组细胞中的原位抗体，因为抗体的天然环境的至少一种组分将不存在。然而，通常，将通过至少一个纯化步骤制备分离的抗体。

术语“高变区”、″HVR，″或″HV，″当用于本文时，指抗体可变结构域的在序列上高变和/或形成结构上确定的环的区域。通常，抗体包含六个高变区；三个在VH(H1，H2，H3)中，三个在VL(L1，L2，L3)中。许多高变区描述在使用中并且被包括在本文中。Kabat互补决定区(CDR)是基于序列变异性并且是最常用的(Kabat et al.，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991))。而Chothia涉及结构环的位置(Chothia and Lesk J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。AbM高变区代表Kabat CDRs和Chothia结构环之间的折衷，并且被Oxford Molecular的AbM抗体建模软件使用。“接触”高变区是基于可用的复杂晶体结构的分析。在下面指出了来自这些HVR的每一个的残基。

环  Kabat         AbM         Chothia     接触

                                              

L1    L24-L34     L24-L34     L26-L32     L30-L36

L2    L50-L56     L50-L56     L50-L52     L46-L55

L3    L89-L97     L89-L97     L91-L96     L89-L96

H1    H31-H35B    H26-H35B    H26-H32     H30-H35B(Kabat编号)

H1    H31-H35     H26-H35     H26-H32     H30-H35(Chothia编号)

H2    H50-H65     H50-H58     H53-H55     H47-H58

H3    H95-H102    H95-H102    H96-H101    H93-H101

高变区可以包含如下的“延伸的高变区”：

VL中的24-36或24-34(L1)，46-56或49-56或50-56或52-56(L2)和89-97(L3)和VH中的26-35(H1)，50-65或49-65(H2)和93-102，94-102或95-102(H3)。对于这些定义的每一个，可变结构域残基根据Kabat等(上文)编号。

“构架”或“FR”残基是除了如本文定义的高变区残基之外的那些可变结构域残基。

“人共有构架”是代表在一组(a selection of)人免疫球蛋白VL或VH构架序列中最通常发生的氨基酸残基的构架。通常，该组人免疫球蛋白VL或VH序列来自可变结构域序列的亚型。通常，该序列亚型是如Kabat等中的亚型。在一个实施方案中，对于VL，该亚型是如Kabat等中的亚型kappa I。在一个实施方案中，对于VH，该亚型是如Kabat等中的亚型III。

“亲和力成熟的”抗体是在其一个或多个CDR中具有一个或多个改变的抗体，与不具有那些改变的亲本抗体相比，所述改变导致抗体对抗原的亲和力的提高。优选的亲和力成熟的抗体将对靶抗原具有纳摩尔或甚至皮摩尔的亲和力。通过本领域已知的方法产生亲和力成熟的抗体。Marks et al.Bio/Technology 10：779-783(1992)描述了通过VH和VL结构域改组进行亲和力成熟。Barbas et al.Proc Nat.Acad.Sci，USA 91：3809-3813(1994)；Schier et al.Gene 169：147-155(1995)；Yelton et al.J.Immunol.155：1994-2004(1995)；Jackson et al.，J.Immunol.154(7)：3310-9(1995)；和Hawkins et al.J.Mol.Biol.226：889-896(1992)描述了CDR和/或构架残基的随机诱变。

如本文使用的短语“基本上相似的”或“基本上相同的”表示两个数值之间足够高度的相似性(通常一个与本发明的抗体有关，另一个与参考/比较抗体有关)，使得本领域技术人员将认为在所述值测量的生物学特征背景中，所述两个值之间的差异有很小的或者没有生物学和/或统计学显著性(例如，Kd值)。作为参考/比较抗体的值的函数，所述两个值之间的差异优选小于约50％、优选小于约40％、优选小于约30％、优选小于约20％、优选小于约10％。

“结合亲和力”一般指分子(例如抗体)的单个结合位点和其结合配偶体(例如，抗原)之间非共价相互作用的总和的强度。除非指出相反，本文所用的“结合亲和力”指内在的结合亲和力，其反映了结合对(例如抗体和抗原)的成员之间的1∶1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力一般可通过解离常数(Kd)代表。亲和力可以通过本领域公知的方法，包括本文描述的那些方法测量。低亲和力抗体一般缓慢结合抗原并且倾向于容易解离，而高亲和力抗体一般更快地结合抗原并且倾向于保持更长久的结合。多种测量结合亲和力的方法是本领域已知的，其任一种可用于本发明的目的。

术语“可变的”指如下事实：在多种抗体之间，可变结构域的某些部分的序列差别很大，并且用于每种具体抗体对其具体抗原的结合和特异性。然而，可变性不是均匀分布在抗体的可变结构域各处。它聚集在轻链和重链可变结构域中称作高变区的三个区段中。可变结构域的更高度保守的部分称作构架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR，大部分采取β片层构型，通过三个高变区连接，它们形成环连接，在一些情况下，形成β片层结构的一部分。每条链中的高变区通过FR紧密维持在一起，并且与来自其他链的高变区一起，促进了形成抗体的抗原结合位点(见Kabat et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是显示出多种效应功能，如抗体参与抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。

抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称作“Fab”片段，每个具有单个抗原结合位点，和残留的“Fc”片段，其名称反映了其能够容易地结晶。胃蛋白酶处理产生了F(ab′)₂片段，其具有两个抗原结合位点并且仍然能够交联抗原。

“Fv”是含有完整的抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。该区域由一条重链和一条轻链可变结构域紧密的非共价结合形成的二聚体组成。在该构型中，每个可变结构域的三个高变区相互作用以在V_H-V_L二聚体的表面上确定抗原结合位点。这六个高变区共同赋予抗体的抗原结合特异性。然而，即使单个可变结构域(或者包含仅仅对抗原特异的三个高变区的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，尽管结合亲和力低于完整的结合位点。

Fab片段也含有轻链的恒定结构域和重链的第一个恒定结构域(CH1)。Fab＝片段与Fab片段的不同之处是在重链CH1结构域的羧基末端加了一些残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab′-SH是本文中对Fab′的名称，其中恒定结构域的半胱氨酸残基带有至少一个游离巯基。F(ab′)₂抗体片段最初作为一对Fab′片段产生，所述Fab′片段在它们之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。

来自任何脊椎动物物种的抗体的“轻链”可以基于它们恒定结构域的氨基酸序列归属于两个明显不同类型(称作κ和λ)之一。

取决于它们的重链恒定结构域的氨基酸序列，抗体(免疫球蛋白)可以归属于不同类别。有五种主要类别的免疫球蛋白：IgA，IgD，IgE，IgG，和IgM，这些类别的一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如，IgG₁，IgG₂，IgG₃，IgG₄，IgA₁，和IgA₂。对应于免疫球蛋白的不同类别的重链恒定结构域分别称作α，δ，ε，γ和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是公知的并且一般描述于例如Abbas et al.Cellular and Mol.Immunology，4th ed.(W.B.Saunders，Co.，2000)。抗体可以是更大的融合分子的一部分，所述融合分子通过该抗体与一种或多种其他蛋白质或肽的共价或非共价结合形成。

术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本文中可互换使用，表示其基本上完整形式的抗体，不是下面定义的抗体片段。这些术语尤其指具有含Fc区的重链的抗体。

对于本文的目的，“裸抗体”是不缀合到细胞毒性部分或者放射性标记的抗体。

本文使用的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C-末端区，包括天然序列Fc区和可变Fc区。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界可变，但是人IgG重链Fc区通常被定义为从Cys226或从Pro230位的氨基酸残基延伸到其羧基末端。Fc区的C-末端赖氨酸(根据EU编号系统的残基447)可以例如在抗体的生产或纯化期间去除，或者通过重组改造编码抗体的重链的核酸去除。因此，完整抗体的组成可以包含去除了所有K447残基的抗体群体、没有去除K447残基的抗体群体，和具有携带和没有携带K447残基的抗体的混合物的抗体群体。

除非指出相反，本文中免疫球蛋白重链中残基的编号是如Kabat et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)(明确引入本文作为参考)中的EU索引编号。“如Kabat中的EU索引”指人IgG1 EU抗体的残基编号。

“功能Fc区”具有天然序列Fc区的“效应功能”。示例性“效应功能”包括C1q结合、补体依赖性细胞毒性、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、吞噬作用、细胞表面受体(例如，B细胞受体、BCR)的下调，等等。此类效应功能一般需要Fc区与结合结构域(例如，抗体可变结构域)组合并且可以例如使用如本文公开的多种测定法评估。

“天然序列Fc区”包含与自然中发现的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人Fc区包括天然序列人IgG1Fc区(非A和A同种异型)；天然序列人IgG2Fc区；天然序列人IgG3Fc区；和天然序列人IgG4Fc区以及其天然存在的变体。

“可变Fc区”包含由于至少一个氨基酸修饰，优选一个或多个氨基酸取代而不同于天然序列Fc区的氨基酸序列。优选地，可变Fc区与天然序列Fc区或者与亲本多肽的Fc区相比具有至少一个氨基酸取代，例如，在天然序列Fc区或者亲本多肽的Fc区中约1到约10个氨基酸取代，优选约1到约5个氨基酸取代。本文的变体Fc区将优选具有与天然序列Fc区和/或者与亲本多肽的Fc区至少约80％同源性，最优选地，与其至少约90％同源性，更优选与其至少约95％同源性。

取决于它们重链恒定结构域的氨基酸序列，完整抗体可以归属于不同的“类别”。有五种主要类别的完整抗体：IgA，IgD，IgE，IgG，和IgM，这些类别的一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA，和IgA2。对应于抗体的不同类别的重链恒定结构域分别称作α，δ，ε，γ和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是公知的。

“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”指细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcRs)的非特异性细胞毒性细胞(例如，自然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上结合的抗体并随后引起靶细胞的裂解。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI，FcγRII和FcγRIII。造血细胞上FcR表达在Ravetch andKinet，Annu.Rev.Immunol 9：457-92(1991)的第464页上表3中概述。为了评估目的分子的ADCC活性，可以进行体外ADCC测定法，如美国专利号5,500,362或5,821,337中所述。此类测定法的有用的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。备选地或额外地，可以在体内，例如如Clynes et al.PNAS(USA)95：652-656(1998)中公开的动物模型中评估目的分子的ADCC活性。

“人效应细胞”是表达一种或多种FcRs并且执行效应功能的白细胞。优选地，所述细胞表达至少FcγRIII并且执行ADCC效应功能。介导ADCC的人白细胞的实例包括外周血单核细胞(PBMC)、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞；PBMCs和NK是优选的。效应细胞可以从其天然来源分离，如从血液或本文所述的PBMC分离。

术语“Fc受体”或“FcR”用于描述结合到抗体的Fc区的受体。优选的FcR是天然序列人FcR。此外，优选的FcR是结合IgG抗体(一种γ受体)的FcR并且包括FcγRI，FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括等位变体和这些受体的选择性剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(″活化受体″)和FcγRIIB(″抑制受体″)，其具有相似氨基酸序列，主要在其胞质结构域中不同。活化受体FcγRIIA在其胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)(见M.inAnnu.Rev.Immunol.15：203-234(1997)中的综述)。FcRs在Ravetch and Kinet，Annu.Rev.Immunol 9：457-92(1991)；Capel et al.，Immunomethods 4：25-34(1994)；和de Haas et al.，J.Lab.Clin.Med.126：330-41(1995)中综述。本文的术语“FcR”包括其他FcRs，包括在将来鉴定的那些FcRs。该术语还包括新生儿受体FcRn，其负责将母亲IgG转移到胎儿(Guyer et al.，J.Immunol.117：587(1976)和Kim et al.，J.Immunol.24：249(1994))，并调节免疫球蛋白的内稳态。在WO00/42072(Presta，L.)和US2005/0014934A1(Hinton et al.)中描述了对新生儿Fc受体(FcRn)具有改进的结合和延长的半寿期的抗体。这些抗体包含其中具有一个或多个取代的Fc区，所述取代改善了Fc区与FcRn的结合。例如，Fc区可以在238，250，256，265，272，286，303，305，307，311，312，314，317，340，356，360，362，376，378，380，382，413，424，428或434的一个或多个位置(残基的Eu编号)上具有取代。优选的具有改善的FcRn结合的包含Fc区的抗体变体在其Fc区的位置307，380和434的一个、两个或三个位置上包含氨基酸取代(残基的Eu编号)。

“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的V_H和V_L结构域，其中这些结构域存在于单条多肽链中。优选地，Fv多肽还包含V_H和V_L结构域之间的多肽接头，其使得scFv能够形成抗原结合所需的结构。scFv的综述见Plückthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg和Moore编著，Springer-Verlag，New York，pp.269-315(1994)。HER2抗体scFv片段描述于WO93/16185；美国专利号5,571,894；和美国专利号5,587,458。

术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，所述片段包含连接到相同多肽链中的可变轻结构域(V_L)的可变重结构域(V_H)(V_H-V_L)。通过使用太短而允许两个结构域在相同链上配对的接头，迫使结构域与另一链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。双抗体更完全描述于例如EP 404,097；WO 93/11161；和Hollinger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993)。

“亲和力成熟的”抗体是在其一个或多个高变区中具有一个或多个改变的抗体，所述改变导致与不具有那些改变的亲本抗体相比，抗体对抗原的亲和力提高。优选的亲和力成熟的抗体将对靶抗原具有纳摩尔甚至皮摩尔亲和力。通过本领域已知的方法产生亲和力成熟的抗体。Marks et al.Bio/Technology 10：779-783(1992)描述了通过VH和VL结构域改组进行亲和力成熟。Barbas et al.Proc Nat.Acad.Sci，USA 91：3809-3813(1994)；Schier et al.Gene 169：147-155(1995)；Yelton et al.J.Immunol.155：1994-2004(1995)；Jackson et al.，J.Immunol.154(7)：3310-9(1995)；和Hawkins et al，J.Mol.Biol.226：889-896(1992)描述了CDR和/或构架残基的随机诱变。

本文的“氨基酸序列变体”抗体是具有不同于主要种类抗体的氨基酸序列的抗体。通常，氨基酸序列变体将与主要种类抗体有至少约70％同源性，优选地，它们将与主要种类抗体有至少约80％，更优选至少约90％同源性。氨基酸序列变体在主要种类抗体的氨基酸序列内部或相邻的某些位置上具有取代、缺失和/或添加。本文的氨基酸序列变体的实例包括酸性变体(如脱酰胺化抗体变体)、碱性变体、在其一条或两条轻链上具有氨基末端前导序列延伸(例如VHS-)的抗体、在其一条或两条重链上具有C-末端赖氨酸残基的抗体，等等，并且包括重链和/或轻链的氨基酸序列变异的组合。本文的尤其重要的抗体变体是这样的抗体，其相对于主要种类抗体在其一条或两条轻链上包含氨基末端前导序列延伸，任选还包含其他氨基酸序列和/或糖基化差异。

本文的“糖基化变体”抗体是具有连接到该抗体的一个或多个糖类部分的抗体，所述糖类部分不同于连接到主要种类抗体的一个或多个糖类部分。本文的糖基化变体的实例包括具有连接到其Fc区的G1或G2寡糖结构而不是G0寡糖结构的抗体、具有连接到其一条或两条轻链的一个或两个糖类部分的抗体、没有连接到该抗体的一条或两条重链的糖类的抗体，等等，和糖基化改变的组合。当抗体具有Fc区时，寡糖结构可以连接到该抗体的一条或两条重链，例如连接在残基299(298，残基的Eu编号)。

本文使用的术语“细胞毒性剂”指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语意在包括放射性同位素(例如，At²¹¹，I¹³¹，I¹²⁵，y⁹⁰，Re¹⁸⁶，Re¹⁸⁸，Sm¹⁵³，Bi²¹²，P³²和Lu的放射性同位素)、化学治疗剂，和毒素，如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，包括其片段和/或变体。

术语“细胞因子”是一种细胞群体释放的蛋白质的总称，其作为细胞间介体作用于另一细胞。此类细胞因子的实例是淋巴因子、单核因子和常规的多肽激素。细胞因子包括生长激素，如人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素、和牛生长激素；甲状旁腺素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素，如滤泡刺激激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)，和促黄体激素(LH)；肝脏生长因子；成纤维细胞生长因子；促乳素；胎盘催乳激素；肿瘤坏死因子-α和-β；副中肾管抑制物质；小鼠性腺促素关连肽；抑制素；激活蛋白；血管内皮生长因子；整联蛋白；血小板生成素(TPO)；神经生长因子，如NGF-β；血小板生长因子；转化生长因子(TGFs)，如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和-II；红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子；干扰素，如干扰素-α，-β，和-γ；集落刺激因子(CSFs)，如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；和粒细胞-CSF(G-CSF)；白介素(ILs)如IL-1，IL-1α，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12；肿瘤坏死因子，如TNF-α或TNF-β；和其他多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。如本文所用，术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质和天然序列细胞因子的生物活性等同物。

本文对于辅助疗法所用的术语“免疫抑制剂”指抑制或者掩蔽在本文被治疗的受试者的免疫系统的物质。这将包括抑制细胞因子产生、下调或抑制自身抗原表达，或者掩蔽MHC抗原的物质。此类物质的实例包括2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶类(见美国专利号4,665,077)；非类固醇抗炎药物(NSAIDs)；更昔洛韦(ganciclovir)；他克莫司(tacrolimus)；糖皮质激素(glucocorticoids)，如皮质醇(cortisol)或醛固酮(aldosterone)；抗炎物质，如环加氧酶抑制剂；5-脂加氧酶抑制剂；或白三烯受体拮抗剂；嘌呤拮抗剂，如硫唑嘌呤或麦考酚酸酯(MMF)；烷化剂，如环磷酰胺；溴隐亭(bromocryptine)；达那唑(danazol)；氨苯砜(dapsone)；戊二醛(其掩蔽MHC抗原，如美国专利号4,120,649中所述)；MHC抗原和MHC片段的抗独特型抗体；环孢菌素(cyclosporine)；6-巯基嘌呤；类固醇(steroids)，如皮质类固醇(corticosteroids)或者糖皮质激素(glucocorticosteroids)或糖皮质激素类似物，例如，泼尼松(prednisone)、甲泼尼龙(methylprednisolone)，包括SOLU-MEDROL.RTM、琥珀酸钠甲基强的松龙(methylprednisolonesodium succinate)，和地塞米松(dexamethasone)；二氢叶酸还原酶抑制剂，如甲氨蝶呤(methotrexate)(口服或皮下)；抗疟疾剂，如氯喹(chloroquine)和羟氯喹(hydroxychloroquine)；柳氮磺吡啶；来氟米特(leflunomide)；细胞因子或细胞因子受体抗体或拮抗剂，包括抗干扰素-α，-β，或-γ抗体，抗肿瘤坏死因子(TNF)-α抗体(英夫利昔单抗(REMICADE.RTM.)或阿达木单抗)，抗-TNF-α免疫粘附素(依那西普)、抗-TNF-β抗体、抗白介素-2(IL-2)抗体和抗-IL-2受体抗体，和抗白介素-6(IL-6)受体抗体和拮抗剂；抗-LFA-1抗体，包括抗-CD11a和抗-CD18抗体；抗-L3T4抗体；异源抗淋巴细胞球蛋白；泛-T抗体，优选抗-CD3或抗-CD4/CD4a抗体；含有LFA-3结合结构域的可溶性肽(WO 90/08187，1990年7月26日公开)；链激酶；转化生长因子-β(TGF-β)；streptodomase；来自宿主的RNA或DNA；FK506；RS-61443；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；脱氧精胍菌素(deoxyspergualin)；雷帕霉素(rapamycin)；T-细胞受体(Cohen et al.，美国专利号5,114,721)；T细胞受体片段(Offner et al.，Science，251：430-432(1991)；WO 90/11294；Ianeway，Nature，341：482(1989)；和WO 91/01133)；BAFF拮抗剂如BAFF或BR3抗体或免疫粘附素和zTNF4拮抗剂(综述见Mackay and Mackay，TrendsImmunol.，23：113-5(2002)，也参见下文的定义)；干扰T细胞辅助信号的生物制剂，如抗-CD40受体或抗-CD40配体(CD154)，包括CD40-CD40配体的封闭抗体(例如，Durie et al.，Science，261：1328-30(1993)；Mohan et al.，J.Immunol.，154：1470-80(1995))和CTLA4-Ig(Finck et al.，Science，265：1225-7(1994))；和T-细胞受体抗体(EP 340,109)如T10B9。

II.详述

A.Beta7整联蛋白拮抗剂

本发明涉及预测患者对β7整联蛋白拮抗剂治疗的应答性的方法。潜在拮抗剂的实例包括结合免疫球蛋白与β7整联蛋白的融合物的寡核苷酸，和尤其抗体，包括但不限于，多克隆和单克隆抗体和抗体片段，单链抗体、抗独特型抗体和此类抗体的嵌合或人源化形式或片段，以及人抗体和抗体片段。备选地，潜在拮抗剂可以是密切相关的蛋白质，例如，β7整联蛋白的突变形式，其识别该配体但是不赋予效应，从而竞争性抑制β7整联蛋白的作用。

另一潜在β7整联蛋白拮抗剂是使用反义技术制备的反义RNA或DNA构建体，其中例如反义RNA或DNA分子通过与被靶定的mRNA杂交而发挥作用以直接阻断mRNA的翻译并阻止蛋白质翻译。反义技术可以用于通过三螺旋形成或反义DNA或RNA控制基因表达，这两种方法都是基于多核苷酸与DNA或RNA的结合。例如，编码本文的β7整联蛋白的多核苷酸序列的5’编码部分用于设计长为约10到40个碱基对的反义RNA寡核苷酸。DNA寡核苷酸被设计与涉及转录的基因的区域互补(三螺旋——见Lee et al.，Nucl.Acids Res.，6：3073(1979)；Cooney et al.，Science，241：456(1988)；Dervan et al.，Science，251：1360(1991))，从而阻止转录和β7整联蛋白的产生。反义RNA寡核苷酸与mRNA在体内杂交并阻断mRNA分子翻译成β7整联蛋白蛋白质(反义--Okano，Neurochem.，56：560(1991)；Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression(CRC Press：Boca Raton，Fla.，1988)。上述寡核苷酸也可以被递送到细胞，从而可以在体内表达反义RNA或DNA来抑制PRO多肽的产生。当使用反义DNA时，来自翻译起始位点，例如靶基因核苷酸序列的约-10到+10位置的寡脱氧核糖核苷酸是优选的。

其他潜在拮抗剂包括结合活性位点、配体或结合分子结合位点的小分子，从而阻断β7整联蛋白的正常生物学活性。小分子的实例包括但不限于，小肽或肽样分子，优选可溶性肽，和合成的非肽酰有机或无机化合物。

核酶是能够催化RNA的特异性切割的酶促RNA分子。核酶通过与互补靶标RNA的序列特异性杂交，接着发生内切核苷酸水解切割而发挥作用。通过已知的技术可以鉴定潜在RNA靶标内特定的核酶切割位点。细节见例如，Rossi，Current Biolozy，4：469-471(1994)，和PCT公开号WO97/33551(1997年9月18日公开)。

用于抑制转录的三螺旋形成中的核酸分子应该是单链的并且由脱氧核苷酸组成。这些寡核苷酸的碱基组成被设计成使得它通过Hoogsteen碱基配对原则促进三螺旋形成，其一般需要在双螺旋的一条链上相当大的嘌呤或嘧啶序列。进一步细节见，例如，PCT公开号WO 97/33551。这些小分子可以通过上面讨论的任何一种或多种筛选测定法和/或通过本领域技术人员公知的任何其他筛选技术鉴定。

设计拮抗剂的筛选测定法来鉴定与本文鉴定的基因编码的β7整联蛋白结合或复合的化合物，或者干扰所编码的多肽与其他细胞蛋白质相互作用的化合物。此类筛选测定法将包括能进行高通量筛选化学文库的测定法，使得它们尤其适合鉴定小分子药物候选物。

测定法可以以多种形式进行，包括蛋白质-蛋白质测定法、生物化学筛选测定法、免疫测定法，和基于细胞的测定法，它们是本领域中充分表征的。

B.抗-Beta7整联蛋白抗体

在一个实施方案中，本发明的β7整联蛋白拮抗剂是抗-β7抗体。示例性抗体包括多克隆的、单克隆的、人源化的、人的、双特异性抗体和异缀合物抗体，等等，如下述。

1.多克隆抗体

优选通过相关抗原和佐剂的多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射在动物中产生多克隆抗体。它可以用于将相关抗原缀合到在待免疫的物种中免疫原性的蛋白质，例如，钥孔血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或者大豆胰蛋白酶抑制剂，所述缀合使用双功能或者衍生试剂，例如，马来酰亚胺苯甲酰基磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基缀合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酐、SOCl₂，或R¹N＝C＝NR，其中R和R¹是不同的烷基。

通过组合例如100μg或5μg蛋白质或缀合物(分别用于兔或小鼠)与3体积的弗氏完全佐剂并在多个部位皮内注射该溶液，将动物对抗原、免疫缀合物或衍生物免疫。一个月后，动物用弗氏完全佐剂中的1/5到1/10最初量的肽或缀合物通过在多个部位皮下注射进行加强。7到14天后，对动物取血并测定血清的抗体效价。加强免疫动物直到效价达到平台。优选地，动物用相同抗原但是缀合到不同的蛋白质和/或通过不同的交联试剂得到的缀合物加强。也可以在重组细胞培养物中作为蛋白质融合物制备缀合物。而且，聚集试剂如明矾适合用于增强免疫应答。

2.单克隆抗体

单克隆抗体可以使用Kohler et al.，Nature，256：495(1975)首次描述的杂交瘤方法制备或者可以通过重组DNA方法(美国专利号4,816,567)制备。

在杂交瘤方法中，如上述免疫小鼠或其他合适的宿主动物，如仓鼠，以激发淋巴细胞，其产生或能够产生将特异结合用于免疫的蛋白质的抗体。备选地，可以在体外免疫淋巴细胞。免疫后，分离淋巴细胞并使用合适的融合试剂，如聚乙二醇与骨髓瘤细胞系融合以形成杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，pp.59-103(Academic Press，1986))。

将如此制备的杂交瘤细胞接种并生长在合适的培养基中，该培养基优选含有抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞(也称为融合配偶体)生长或存活的一种或多种物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺少酶次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，那么杂交瘤的选择性培养基通常将包括次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)，所述物质阻止HGPRT缺乏细胞的生长。

优选的融合配偶体骨髓瘤细胞是有效融合、支持所选的抗体生产细胞稳定的高水平产生抗体，并且对针对未融合的亲本细胞进行选择的选择培养基敏感的那些细胞。优选的骨髓瘤细胞系是小鼠骨髓瘤细胞系，如可得自Salk Institute Cell Distribution Center，San Diego，Calif.USA的来自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的那些，和可从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，Manassas，Va.，USA)得到的SP-2和衍生物，例如X63-Ag8-653细胞。人骨髓瘤和小鼠-人异骨髓瘤细胞系也已经被描述用于产生人单克隆抗体(Kozbor，J.Immunol.，133：3001(1984)；和Brodeur et al.，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，pp.51-63(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987))。

对用于生长杂交瘤细胞的培养基测定针对抗原的单克隆抗体的产生。优选地，通过免疫沉淀或者通过体外结合测定法，如放射免疫测定法(RIA)或者酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性。

例如通过Munson et al.，Anal.Biochem.，107：220(1980)中描述的Scatchard分析可以测定单克隆抗体的结合亲和力。一旦鉴定了产生具有希望的特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞，那么克隆可以通过有限稀释程序亚克隆并通过标准方法生长(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，pp.59-103(Academic Press，1986))。用于该目的的合适培养基包括例如，D-MEM或RPMI-1640培养基。此外，杂交瘤细胞可以例如通过腹膜内注射细胞到小鼠中在动物中作为腹水肿瘤在体内生长。通过常规的抗体纯化程序，例如，亲和层析(例如，使用A蛋白或G蛋白Sepharose)或离子交换层析、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析等等从培养基、腹水或血清合适地分离亚克隆分泌的单克隆抗体。

容易地分离编码单克隆抗体的DNA并使用常规程序测序(例如，通过使用能够特异结合编码鼠抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。杂交瘤细胞作为此类DNA的优选来源。一旦分离，可以将DNA置于表达载体中，然后表达载体被转染到否则不产生抗体蛋白的宿主细胞，例如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或者骨髓瘤细胞，以得到在重组宿主细胞中合成单克隆抗体。关于在细菌中重组表达编码抗体的DNA的综述文章包括Skerra et al.，Curr.Opinion in Immunol.，5：256-262(1993)和Pluckthun，Immunol.Revs.130：151-188(1992)。

在另一实施方案中，可以从使用McCafferty et al.，Nature，348：552-554(1990)中描述的技术产生的抗体噬菌体文库分离单克隆抗体或抗体片段。Clackson et al.，Nature，352：624-628(1991)和Marks et al.，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)描述了使用噬菌体文库分别分离小鼠和人抗体。随后的出版物描述了通过链改组产生高亲和力(nM范围)人抗体(Marks et al.，Bio/Technology，10：779-783(1992))，以及组合感染和体内重组作为构建极大噬菌体文库的策略(Waterhouse et al.，Nuc.Acids.Res.21：2265-2266(1993))。从而，这些技术是用于分离单克隆抗体的常规单克隆抗体杂交瘤技术的可行备选方案。

可以修饰编码抗体的DNA以产生嵌合或融合抗体多肽，例如，通过用人重链和轻链恒定结构域(CH和CL)序列取代同源鼠序列(美国专利号4,816,567；和Morrison，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851(1984))，或通过将免疫球蛋白编码序列与非免疫球蛋白多肽(异源多肽)的编码序列的全部或部分融合。非免疫球蛋白多肽序列可以取代抗体的恒定结构域，或者它们可以取代抗体的抗原组合位点的可变结构域以产生嵌合的二价抗体，该二价抗体包含具有对一种抗原特异性的一个抗原结合位点和具有对不同抗原特异性的另一抗原结合位点。

示例性抗β7抗体是Fib504，Fib 21，22，27，30(Tidswell，M.J Immunol.1997Aug 1；159(3)：1497-505)或其人源化衍生物。Fib504的人源化抗体详细公开在美国专利公开号20060093601中，将其内容完整并入本文作为参考(也参见下面的讨论)。

3.人和人源化抗体

本发明的抗β7整联蛋白抗体可以还包含人源化抗体或人抗体。非人(例如鼠)抗体的人源化形式是嵌合免疫球蛋白、其免疫球蛋白链或片段(如抗体的Fv，Fab，Fab′，F(ab′)₂或其他抗原结合子序列)，其含有来自非人免疫球蛋白的最小序列。人源化抗体包括人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的互补决定区(CDR)的残基被非人种类(供体抗体)如小鼠、大鼠或兔的CDR的残基替代，具有希望的特异性、亲和力和能力。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv构架残基被相应的非人残基替代。人源化抗体可以也包含在受体抗体和输入的CDR或构架序列中都没有发现的残基。通常，人源化抗体将包含基本上所有的或至少一个并且通常两个可变结构域，所述可变结构域中，所有的或基本上所有的CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些CDR区并且所有的或基本上所有的FR区为人免疫球蛋白共有序列的那些FR区。人源化抗体最佳地也将包含至少部分的免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常人免疫球蛋白的恒定区[Jones et al.，Nature，321：522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature 332：323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2：593-596(1992)]。

人源化非人抗体的方法是本领域公知的。通常，人源化抗体具有引入其中的来自非人来源的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常被称作“输入”残基，其通常取自“输入”可变区。人源化可以基本上按照下面的Winter和同事的方法[Jones et al.，Nature，321：522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature，332：323-327(1988)；Verhoeyen et al.，Science，239：1534-1536(1988)]，通过用啮齿动物CDR或CDR序列代替人抗体的相应序列进行。因此，此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利号4,816,567)，其中基本上少于完整人可变结构域已经被来自非人物种的相应序列取代。实际上，人源化抗体通常是人抗体，其中一些CDR残基和可能一些FR残基被来自啮齿动物抗体中类似位点的残基取代。当抗体意在用于人类治疗用途时，待用于制备人源化抗体的人(轻和重)可变结构域的选择对于降低抗原性和HAMA应答(人抗小鼠抗体)是非常重要的。根据所称作的“最佳拟合”方法，将啮齿动物抗体的可变结构域的序列对已知的人可变结构域序列的整个文库筛选。鉴定与啮齿动物的最接近的人V结构域序列，并且其中的人框架区(FR)被接受用于人源化抗体(Sims et al.，J.Immunol.151：2296(1993)；Chothia et al.，J.Mol.Biol.，196：901(1987))。另一方法使用来自特定亚组的轻链或重链的所有人抗体的共有序列的特定构架区。相同的构架可以用于一些不同的人源化抗体(Carter et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285(1992)；Presta et al.，J.Immunol.151：2623(1993))。更重要的是被人源化的抗体保留对抗原的高结合亲和力和其他有利的生物学性质。为实现该目标，根据优选方法，通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和多种概念上人源化产物的方法制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型是本领域技术人员通常可得的和熟悉的。可以利用阐明并显示所选的候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构的计算机程序。这些画面的检查允许分析所述残基在候选免疫球蛋白序列的功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，可以从受体和输入序列选择并组合FR残基使得实现所希望的抗体特征，如对靶抗原增加的亲和力。通常，高变区残基直接并且最基本上涉及影响抗原结合。

设想多种形式的人源化抗β7整联蛋白抗体。例如，人源化抗体可以是抗体片段，如Fab，其任选与一种或多种细胞毒性剂缀合，以便产生免疫缀合物。备选地，人源化抗体可以是完整抗体，如完整的IgG1抗体。

示例性人源化抗β7抗体包括，但不限于rhuMAbβ7，其是抗整联蛋白亚基β7的人源化单克隆抗体，并且来源于大鼠抗小鼠/人单克隆抗体FIB504(Andrew et al.，1994 J Immunol 1994；153：3847-61.)。已经将其工程化以包括人免疫球蛋白(Ig)G1重链和κ1轻链构架并且由中国仓鼠卵巢细胞产生。该抗体结合两种整联蛋白α4β7(Holzmann et al.1989 Cell，1989；56：37-46；Hu et al.，1992，Proc Natl Acad Sci USA 1992；89：8254-8)和αEβ7(Cepek et al.，1993 J Immunol 1993；150：3459-70)，这两种整联蛋白调节胃肠道中淋巴细胞亚群的运输和保留并且涉及炎性肠病(IBD)，如溃疡性结肠炎(UC)和局限性回肠炎(CD)。rhuMAb β7是α4β7和其配体(粘膜地址素细胞粘附分子-1[MAdCAM]-1，血管细胞粘附分子[VCAM]-1，和纤连蛋白)之间细胞相互作用以及αEβ7和其配体(E-钙粘蛋白)之间相互作用的有效体外阻断剂。rhuMAbβ7可逆地结合来自兔、猕猴和人的淋巴细胞上的β7并且具有相似的高亲和力。它还以高亲和力结合小鼠β7。rhuMAbβ7及其变体的氨基酸序列和制备和用途在美国专利申请公开号20060093601中详细公开，将该申请的内容完整并入本文。

图16A和16B描述了如下的可变轻链和重链序列的比对：

轻链人亚群κI共有序列(图16A，SEQ ID NO：23)，重链人亚群III共有序列(图16B，SEQ ID NO：24)，大鼠抗小鼠β7抗体(Fib504)可变轻链(图16A，SEQ ID NO：10)，大鼠抗小鼠β7抗体(Fib504)可变重链(图16B，SEQID NO：11)，和人源化抗体变体：人源化hu504K移植物可变轻链(图16A，SEQ ID NO：25)，人源化hu504K移植物可变重链(图16B，SEQ ID NO：26)，变体hu504.5(对于变体hu504.5，hu504.16，和hu504.32，从人源化hu504K移植物的氨基酸改变在图16A(轻链)和图16B(重链)中指出)。hu504K移植物的HVR-H1和HVR-H2中导致β7结合抗体的额外氨基酸取代在图16C中指出。

4.人抗体

作为人源化的备选方案，可以产生人抗体。例如，现在可能产生转基因动物(例如小鼠)，其在免疫时能够在不产生内源免疫球蛋白的情况下产生人抗体的所有组成成分。例如，已经描述嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(J_H)基因的同源缺失导致完全抑制内源抗体的产生。将人种系免疫球蛋白基因组列到此类种系突变小鼠将导致在抗原攻击是产生人抗体。见例如，Jakobovits et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：2551(1993)；Jakobovits et al.，Nature，362：255-258(1993)；Bruggemann et al.，Year inImmuno.7：33(1993)；美国专利号5,545,806，5,569,825，5,591,669(都是GenPharm的)；美国专利号5,545,807；和WO 97/17852。

备选地，噬菌体展示技术(McCafferty et al.，Nature 348：552-553[1990])可以用于从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)结构域基因所有组成成分在体外产生人抗体和抗体片段。根据该技术，将抗体V结构域基因符合读框地克隆到丝状噬菌体如M13或fd的主要或次要外壳蛋白基因中，并在噬菌体颗粒表面上展示为功能抗体片段。因为丝状颗粒含有噬菌体基因组的单链DNA拷贝，所以基于抗体的功能性质的选择也导致编码显示出那些性质的抗体的基因的选择。从而，噬菌体模拟了B细胞的一些性质。噬菌体展示可以以多种形式进行，综述见Johnson，Kevin S.and Chiswell，David J.，Current Opinion in Structural Biology 3：564-571(1993)。V基因区段的一些来源可以用于噬菌体展示。Clackson et al.，Nature，352：624-628(1991)从来自经免疫小鼠的脾脏的V基因的小的随机组合文库分离了多种不同的抗噁唑酮抗体。按照Marks et al.，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)，或Griffith et al.，EMBO J.12：725-734(1993)所述的技术基本上可以构建来自未经免疫的人供体的V基因的所有组成成分并分离抗多种不同抗原(包括自身抗原)的抗体。也见美国专利号5,565,332和5,573,905。

如上述，通过体外活化的B细胞也可以产生人抗体(见美国专利号5,567,610和5,229,275)。

5.抗体片段

在一些情况下，使用抗体片段而不是完整抗体是有益的。片段的较小尺寸允许快速清除，并且可以导致更易接近实体瘤。

已经开发了用于产生抗体片段的多种技术。通常，这些片段通过完整抗体的蛋白水解消化得到(见例如，Morimoto et al.，Journal of Biochemicaland Biophysical Methods 24：107-117(1992)和Brennan et al.，Science，229：81(1985))。然而，现在通过重组宿主细胞可以直接产生这些片段。例如，可以从上面讨论的抗体噬菌体文库分离抗体片段。备选地，Fab′-SH片段可以从大肠杆菌直接回收并化学偶联以形成F(ab′)₂片段(Carter et al.，Bio/Technology 10：163-167(1992))。根据另一方法，可以直接从重组宿主细胞培养物分离F(ab′)₂片段。用于产生抗体片段的其他技术是技术人员显而易见的。在其他实施方案中，所选的抗体是单链Fv片段(scFv)。见WO93/16185；美国专利号5,571,894；和美国专利号5,587,458。抗体片段也可以是“线性抗体”，例如，美国专利号5,641,870中所述。此类线性抗体片段可以是单特异性或双特异性的。

6.双特异性抗体

双特异性抗体是对至少两个不同的表位具有结合特异性的抗体。示例性双特异性抗体可以结合如本文所述的β7整联蛋白的两个不同的表位。其他此类抗体可以组合TAT结合位点与另一蛋白质的结合位点。备选地，抗β7整联蛋白臂可以与结合白细胞上的引发分子，如T细胞受体分子(例如，CD3)，或IgG的Fc受体(Fc.γ.R)，如Fc.γRI(CD64)，Fc.γRII(CD32)和Fc.γ.RIII(CD16)的臂组合，以便将细胞防御机制集中并定位到表达TAT的细胞。双特异性抗体也可以用于将细胞毒性剂定位到表达TAT的细胞。这些抗体具有TAT结合臂和结合细胞毒性剂(例如肥皂草毒蛋白、抗α干扰素、长春花生物碱、蓖麻毒蛋白A链、甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂。可以将双特异性抗体制备为全长抗体或抗体片段(例如，F(ab′)₂双特异性抗体)。

制备双特异性抗体的方法是本领域公知的。全长双特异性抗体的常规生产是基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中这两个链具有不同的特异性(Millstein et al.，Nature 305：537-539(1983))。因为免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(细胞杂交瘤)产生10种不同抗体分子的潜在混合物，其中仅一种具有正确的双特异性结构。正确分子的纯化(其通常是通过亲和层析步骤进行的)是相当麻烦的，并且产物产率很低。类似的步骤公开在WO 93/08829，和Traunecker et al.，EMBO J.10：3655-3659(1991)中。

根据不同的方法，将具有希望的结合特异性(抗体-抗原组合位点)的抗体可变结构域融合到免疫球蛋白恒定结构域序列。优选地，与Ig重链恒定结构域融合，包含至少部分铰链、C_H2，和C_H3区。它优选具有含有轻链结合必要的位点的第一重链恒定区(C_H1)，其存在于至少一个融合物中。将编码免疫球蛋白重链融合物的DNA，和如果希望，免疫球蛋白轻链的DNA插入到单独的表达载体中，并共转染到合适宿主细胞中。在用于构建的三个多肽链的不等比例提供所希望的双特异性抗体的最佳产量时，这为调节实施方案中三种多肽片段的相互比例中提供了更大的灵活性。然而，当相等比例的至少两条多肽链的表达导致高产量或者当所述比例对所希望的链组合的产量没有显著影响时，可能将两条或所有三条多肽链的编码序列插入单个表达载体中。

在该方法的优选实施方案中，双特异性抗体由在一个臂中具有第一种结合特异性的杂合免疫球蛋白重链和在另一个臂中的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二种结合特异性)组成。发现该不对称结构方便从不想要的免疫球蛋白链组合分离希望的双特异性化合物，因为在仅仅一半的双特异性分子中存在免疫球蛋白轻链提供了容易的分离方法。该方法公开在WO 94/04690中。关于产生双特异性抗体的进一步细节见例如Suresh etal.，Methods in Enzymology 121：210(1986)。

根据美国专利号5,731,168中描述的另一方法，可以工程化一对抗体分子之间的界面以将从重组细胞培养物回收的异源二聚体的百分比最大化。优选的界面包含至少部分的C_H3结构域。在该方法中，来自第一种抗体分子界面的一个或更多小的氨基酸侧链用更大的侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)替代。通过将大氨基酸侧链用更小的(例如，丙氨酸或苏氨酸)代替可以在第二个抗体分子界面上产生与大侧链相同或相似大小的互补“腔”。这提供了相对于其他不想要的终产物如同源二聚体增加异源二聚体产量的机理。

双特异性抗体包括交联的或“异缀合物”抗体。例如，异缀合物中抗体之一偶联到抗生物素蛋白，另一个偶联到生物素。例如，已经提出此类抗体将免疫系统细胞靶向不需要的细胞(美国专利号4,676,980)，并用于治疗HIV感染(WO 91/00360，WO 92/200373，和EP 03089)。使用任何常规的交联方法可以制备异缀合物抗体。合适的交联试剂是本领域公知的，并且与许多交联技术一起公开在美国专利号4,676,980中。

文献中已经公开了从抗体片段产生双特异性抗体的技术。例如，使用化学连接可以制备双特异性抗体。Brennan et al.，Science 229：81(1985)描述了一种方法，其中将完整抗体蛋白水解切割产生F(ab′)₂片段。这些片段在二硫醇络合剂亚砷酸钠存在下被还原，以稳定邻位的二硫醇并防止分子间二硫键形成。产生的Fab′片段然后被转化为硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物：Fab′-TNB衍生物之一通过用巯基乙胺还原再次转化为Fab′-硫醇并与等量的另一Fab′-TNB衍生物混合形成双特异性抗体。产生的双特异性抗体可以用作酶的选择性固定化的试剂。

最近的进展已经方便从大肠杆菌直接回收Fab′-SH片段，其可以化学偶联形成双特异性抗体。Shalaby et al.，J.Exp.Med.175：217-225(1992)描述了产生完全人源化的双特异性抗体F(ab′)₂分子。每个Fab′片段从大肠杆菌分别分泌并在体外进行定向化学偶联形成双特异性抗体。所形成的双特异性抗体能够结合过表达ErbB2受体的细胞和正常的人T细胞，以及引起人细胞毒性淋巴细胞针对人乳腺肿瘤靶标的裂解活性。也已经描述了从重组细胞培养物直接制备和分离双特异性抗体片段的多种技术。例如，已经使用亮氨酸拉链产生了双特异性抗体。Kostelny et al.，J.Immunol.148(5)：1547-1553(1992)。来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合连接到两个不同抗体的Fab′部分。该抗体同源二聚体在铰链区还原形成单体，然后再次氧化形成抗体异源二聚体。该方法也可以用于产生抗体同源二聚体。Hollinger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)描述的“双抗体”技术已经提供了制备双特异性抗体片段的备选机理。所述片段包含通过接头连接V_L的V_H，该接头很短而不允许相同链上两个结构域之间配对。因此，一个片段的V_H和V_L结构域被迫与另一片段的互补的V_L和V_H结构域配对，从而形成两个抗原结合位点。也已经报导了通过使用单链Fv(sFv)二聚体制备双特异性抗体片段的另一策略。见Gruber et al.，J.Immunol.，152：5368(1994)。

考虑具有两个以上化学价的抗体。例如，可以制备三特异性抗体。Tuttet al.，J.Immunol.147：60(1991)。

7.异缀合物抗体

异缀合物抗体也在本发明范围内。异缀合物抗体由两个共价结合的抗体组成。例如，已经提出此类抗体将免疫系统细胞靶向不需要的细胞[美国专利号4,676,980]，和用于治疗HIV感染[WO 91/00360；WO 92/200373；EP03089]。设想使用合成蛋白质化学中的公知方法，包括涉及交联剂的方法在体外制备所述抗体。例如，使用二硫键交换反应或者通过形成硫醚键可以构建免疫毒素。用于该目的的合适试剂的实例包括亚氨基硫醇盐和甲基-4-巯基butyrimidate和例如美国专利号4,676,980中公开的那些。

9.多价抗体

多价抗体可以比二价抗体更快地被表达所述抗体结合的抗原的细胞内化(和/或分解代谢)。本发明的抗体可以是具有三个或更多抗原结合位点的多价抗体(其不同于IgM类别)(例如，四价抗体)，其可以通过编码抗体的多肽链的核酸的重组表达容易地产生。多价抗体可以包含二聚化结构域和三个或更多抗原结合位点。优选的二聚化结构域包含(或组成为)Fc区或铰链区。在该方案中，抗体将包含Fc区和Fc区氨基末端的三个或更多抗原结合位点。本文优选的多价抗体包含(或组成为)三到约八个，但是优选四个抗原结合位点。多价抗体包含至少一条多肽链(并且优选两条多肽链)，其中多肽链包含两个或更多可变结构域。例如，多肽链可以包含VD1-(X1)_n-VD2-(X2)_n-Fc，其中VD1是第一个可变结构域，VD2是第二个可变结构域，Fc是Fc区的一条多肽链，X1和X2代表氨基酸或多肽，n是0或1。例如，多肽链可包含：VH-CH1-柔性接头-VH-CH1-Fc区链；或VH-CH1-VH-CH1-Fc区链。本文的多价抗体优选还包含至少两个(并且优选四个)轻链可变结构域多肽。本文的多价抗体可以例如包含约二到约八个轻链可变结构域多肽。本文设想的轻链可变结构域多肽包含轻链可变结构域和任选地，还包含CL结构域。

9.效应子功能工程化

可以希望在效应子功能方面修饰本发明的抗体，例如，以便增强抗体的抗原依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。这可以通过在抗体的Fc区中引入一个或多个氨基酸取代实现。备选地或额外地，可以在Fc区中引入半胱氨酸残基，从而允许在该区域中的链间二硫键形成。所产生的同源二聚抗体可以具有改善的内化能力和/或增加的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。见Caron etal.，J.Exp Med.176：1191-1195(1992)and Shopes，B.J.Immunol.148：2918-2922(1992)。具有增强的抗肿瘤活性的同源二聚体抗体也可以用如Wolff et al.，Cancer Research 53：2560-2565(1993)中所述的异双功能交联剂制备。备选地，可以工程化抗体，其具有两个Fc区，并且可以从而具有增强的补体裂解和ADCC能力。见Stevenson et al.，Anti-Cancer DrugDesign 3：219-230(1989)。为了增加抗体的血清半寿期，例如，可以如美国专利号5,739,277中所述向抗体(特别是抗体片段)中掺入补救受体结合表位。如本文所用的术语“补救受体结合表位”指IgG分子(例如，IgG₁，IgG₂，IgG₃，或IgG₄)的Fc区的表位，该表位负责增加IgG分子的体内血清半寿期。

10.免疫缀合物

用于本文方法中的拮抗剂或抗体任选地缀合到另一试剂，如细胞毒性剂，或细胞因子。

缀合将通常通过共价连接实现，其确切的性质将由靶定分子和整联蛋白β7拮抗剂或抗体多肽上的连接位点决定。通常，通过加入接头修饰非肽试剂，所述接头允许通过抗β7整联蛋白抗体的氨基酸侧链、碳水化合物链，或者通过化学修饰引入抗体上的反应基而缀合到该抗体。例如，药物可以通过赖氨酸残基的ε氨基、通过游离α氨基，通过与半胱氨酸残基的二硫键交换，或者通过碳水化合物链中1，2-二醇用高碘酸氧化以允许含有多种亲核试剂的药物通过希夫碱连接进行连接。见例如，美国专利号4,256,833。蛋白质修饰剂包括胺反应性试剂(例如，反应性酯、异硫氰酸酯、醛和磺酰卤)、硫醇反应试剂(例如，卤代乙酰基衍生物和马来酰亚胺类)，和羧酸和醛反应性试剂。整联蛋白β7拮抗剂或抗体多肽可以通过使用双功能交联试剂共价连接到肽试剂。异双功能试剂更通常使用并且允许通过使用两个不同的反应性部分(例如胺反应性加上硫醇，碘乙酰胺或马来酰亚胺)控制两种不同蛋白质的偶联。此类连接试剂的使用是本领域公知的。见例如，Brinkley，上文和美国专利号4,671,958。也可以使用肽接头。在备选方案中，抗β7整联蛋白抗体多肽可以通过融合多肽的制备连接到肽部分。

其他双功能蛋白质偶联试剂的实例包括N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯，亚氨基硫烷(IT)，酰亚胺酯的双功能衍生物(如二甲基己二酸HCL)，活性酯(如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)，醛(如戊二醛)，二-叠氮基化合物(如二(对-叠氮基苯甲酰基)己二胺)，二-重氮衍生物(如二-(对-重氮基苯甲酰基)-乙二胺)，二异氰酸酯(如亚苄基(tolyene)2，6-二异氰酸)，和二活性氟化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。

11.免疫脂质体

本文公开的抗β7整联蛋白抗体也可以配制为免疫脂质体。“脂质体”是由多种类型的脂质、磷脂和/或表面活性剂组成的小囊，其可以用于向哺乳动物递送药物。脂质体的组分通常以双层形式排列，类似于生物膜的脂质排列。通过本领域公知的方法，如Epstein et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：3688(1985)；Hwang et al.，Proc.Natl Acad.Sci.USA 77：4030(1980)；美国专利号4,485,045和4,544,545；和1997年10月23日公开的WO97/38731中所述的制备含有抗体的脂质体。在美国专利号5,013,556中公开了具有增强的循环时间的脂质体。

用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG-衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物，通过反相蒸发法可以产生尤其有用的脂质体。将脂质体通过确定孔径的滤器挤出产生具有所希望直径的脂质体。

可以如Martin et al.，J.Biol.Chem.257：286-288(1982)中所述通过二硫键交换反应将本发明抗体的Fab′片段缀合到脂质体。化学治疗剂任选包含在脂质体内。见Gabizon et al.，J.National Cancer Inst.81(19)：1484(1989)。

12.用于抗体生产的载体、宿主细胞和重组方法

本发明还提供了编码如本文所述的抗β7抗体或多肽试剂的分离的核酸、包含所述核酸的载体和宿主细胞，和产生抗体的重组技术。

为了重组生产抗体，分离编码它的核酸并插入到复制载体用于进一步克隆(DNA的扩增)或用于表达。在另一实施方案中，可以通过同源重组产生抗体，如美国专利号5,204,244中所述(特别引入本文作为参考)。使用常规方法(例如，通过使用能够特异结合编码抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)可以容易地分离和测序编码单克隆抗体的DNA。许多载体是可得到的。载体组分一般包括但不限于，下面的一种或多种：信号序列、复制起点、一种或多种标记基因、增强子元件、启动子、转录终止序列，例如，1996年7月9日授权的美国专利号5,534,615，将其特别并入本文作为参考。

用于克隆或表达本文载体中的DNA的合适宿主细胞是上述的原核生物、酵母或高级真核生物细胞。用于该目的的合适原核生物包括真细菌，如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，如肠杆菌科(enterobacteriaceae)，如埃希氏菌属(Escherichia)，如大肠杆菌，肠杆菌属(Enterobacter)，欧文氏菌属(Erwinia)，克雷伯氏菌属(Klebsiella)，变形杆菌属(Proteus)，沙门氏菌属(Salmonella)，例如，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)，沙雷氏菌属(Serratia)，如，Serratia marcescans，和志贺氏菌属(Shigella)，以及芽孢杆菌属(Bacilli)，如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)，和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)(例如，1989年4月12日出版的DD 266,710中公开的地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)41P)，假单胞菌属(Pseudomonas)，如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)，和链霉菌属(Streptomyces)。一个优选的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC 31,446)，尽管其他菌株如大肠杆菌B和大肠杆菌X1776(ATCC 31,537)，和大肠杆菌W3110(ATCC 27,325)是合适的。这些实例是说明性的而非限制性的。

除了原核生物外，真核微生物如丝状真菌或酵母是抗β7整联蛋白抗体编码载体的合适克隆或表达宿主。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或常见的面包酵母是低级真核宿主微生物中最常用的。然而，许多其他属、种和菌株是通常可得到的和在本文可用的，如栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)宿主如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)，脆弱克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)，保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)，K.wickeramii(ATCC24,178)，K.waltii(ATCC 56,500)，K.drosophilarum(ATCC 36,906)，K.thermotolerans，和K.marxianus；耶氏酵母属(yarrowia)(EP 402,226)；巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(EP 183,070)；假丝酵母属(Candida)；里氏木霉(Trichoderma reesia)(EP 244,234)；粗糙链孢霉(Neurospora crassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)如Schwanniomyces occidentalis；和丝状真菌，如链孢霉属(Neurospora)，青霉属(Penicillium)，Tolypocladium，和曲霉属(Aspergillus)宿主，如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。

用于表达糖基化抗β7抗体的合适宿主细胞来自多细胞生物。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了许多杆状病毒菌株和变种和来自宿主的相应的许可的昆虫宿主细胞，所述宿主如草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、Aedesalbopictus(蚊子)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇)和家蚕(Bombyx mori)。用于转染的多种病毒毒株是可公开获得的，例如Autographa californica NPV的L-1变种和家蚕NPV的Bm-5毒株，并且此类病毒可以用作根据本发明的本文的病毒，尤其用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。棉花、玉米、马铃薯、大豆、牵牛花、番茄和烟草的植物细胞培养物也可以用作宿主。

然而，在脊椎动物细胞中的兴趣最大，并且在培养物(组织培养物)中增殖脊椎动物细胞已经成为常规程序。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾系(亚克隆用于悬浮培养生长的293或293细胞，Graham et al.，J.Gen Virol.36：59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))；小鼠支持细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980))；猴肾细胞(CV1ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；水牛鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳房肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather et al.，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；和人肝细胞瘤系(Hep G2)。

将宿主细胞用上述用于抗-β7整联蛋白抗体生产的表达或克隆载体转化并培养在常规营养培养基中，如合适，为了诱导启动子、选择转化体或者扩增编码所需序列的基因修饰所述培养基。

用于产生本发明的抗β7整联蛋白抗体的宿主细胞可以在多种培养基中培养。可商购的培养基如Ham′s F10(Sigma)，最小必需培养基((MEM)，(Sigma)，RPMI-1640(Sigma)，和Dulbecco′s改良的Eagle′s培养基((DMEM)，Sigma)适合培养宿主细胞。此外，Ham et al.，Meth.Enz.58：44(1979)，Barnes et al.，Anal.Biochem.102：255(1980)，美国专利号4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国专利再版30,985中所述的任何培养基可以用作宿主细胞的培养基。如果必要，这些培养基任一种可以补充激素和/或其他生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或者表皮生长因子)，盐(如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)，缓冲剂(如HEPES)，核苷酸(如腺苷和胸苷)，抗生素(如GENTAMYCIN.TM.药物)，微量元素(定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物)，和葡萄糖或等同的能源。任何其他必要的补充物也可以以技术人员将已知的合适浓度包括在内。培养条件，如温度、pH等等是事先与选择用于表达的宿主细胞使用的条件，并且对于技术人员将是显而易见的。

当使用重组技术时，抗体可以在细胞内产生、在周质空间中产生，或直接分泌到培养基。如果抗体在细胞内产生，作为第一步，例如，通过离心或超滤除去细微碎片(宿主细胞或裂解的碎片)。Carter et al.，Bio/Technology 10：163-167(1992)描述了分离分泌到大肠杆菌的周质空间的抗体的方法。简言之，将细胞糊在乙酸钠(pH 3.5)，EDTA，和苯甲基磺酰氟化物(PMSF)存在下解冻约30分钟。通过离心去除细胞碎片。当抗体被分泌到培养基时，来自此类表达系统的上清液通常首先用可商购的蛋白质浓缩离心机，如Amicon或Millipore Pellicon超速离心单元浓缩。在任一个前面步骤中可以包括蛋白酶抑制剂如PMSF以抑制蛋白水解，并且可以包括抗生素以防止偶然的污染物的生长。

从细胞制备的抗体组合物可以用例如羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析进行纯化，亲和层析是优选的纯化技术。A蛋白作为亲和配体的适合性取决于存在于抗体中的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。A蛋白可以用于纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(Lindmark et al.，J.Immunol.Meth.62：1-13(1983))。G蛋白推荐用于所有小鼠同种型和人γ3(Guss et al.，EMBO J.5：15671575(1986))。亲和配体所连接的基质最通常是琼脂糖，但是其他基质是可得到的。机械稳定的基质，如可控孔度玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯允许比用琼脂糖可以实现的更快的流速和更短的处理时间。当抗体包含C_H3结构域时，Bakerbond ABX.TM.树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，N.J.)可用于纯化。取决于待回收的抗体，也可以利用其他蛋白质纯化技术，如在离子交换柱上分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、二氧化硅上层析、肝素SEPHAROSE.TM.上的层析、阴离子或阳离子交换树脂上的层析(如聚天冬氨酸柱)、层析聚焦、SDS-PAGE、和硫酸铵沉淀。在任何初步纯化步骤后，包含目的抗体和污染物的混合物进行低pH疏水作用层析，使用约2.5-4.5之间pH的洗脱缓冲液，优选在低盐浓度(例如，约0-0.25M盐)下进行。

C.药物制剂

通过将具有所希望纯度的抗体与任选的生理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington′s Pharmaceutical Sciences 16th edition，Osol，A.Ed.(1980))混合，以水溶液、冻干或其他干燥形式制备包含本发明的治疗剂、拮抗剂或抗体的治疗制剂用于保存。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所用的剂量和浓度下对接受者是无毒的，并且包括缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐、组氨酸和其他有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶，或者免疫球蛋白；亲水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、或赖氨酸；单糖、二糖和其他糖类，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，如钠；金属络合物(例如，Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，如TWEEN.TM.，PLURONICS.TM.或聚乙二醇(PEG)。

如对于所治疗的具体适应症必需的，本文的制剂也可以含有一种以上活性化合物，优选具有不相互不利地影响的互补活性的那些化合物。此类分子以对于预期目的有效的量合适地组合存在。

活性成分也可以被捕获在所制备的微囊中，例如，通过凝聚技术，或者通过界面聚合，分别地，例如在胶体给药系统(例如脂质体、白蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)或在粗乳液中的羟甲基纤维素或者明胶微囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微囊。此类技术公开在Remington′sPharmaceutical Sciences 16th edition，Osol，A.Ed.(1980)中。

待用于体内施用的制剂必须是无菌的。这通过经无菌滤膜过滤容易地完成。

可以制备缓释制剂。缓释制剂的合适例子包括含有本发明的免疫球蛋白的固体疏水聚合物的半透性基质，所述基质为成型物品，如膜或者微囊的形式。缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟基乙基-甲基丙烯酸酯)，或聚(乙烯醇)、聚交酯(美国专利号3,773,919)，L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸的共聚物、不可降解的乙烯乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，如LUPRON DEPOT.TM.(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射的微球体)，和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。尽管聚合物如乙烯乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸使得可以释放分子100天以上，但是某些水凝胶释放蛋白质更短的时间。当包囊的免疫球蛋白长时间保持在身体中时，它们由于接触37℃的水分而可以变性或聚集，导致丧失生物活性并且免疫原性可能改变。根据所涉及的机理，可以为稳定化设计合理策略。例如，如果发现聚集机制是通过硫代-二硫化物交换形成分子间S-S键，那么通过修饰巯基残基、从酸性溶液冻干、控制水分含量、使用额外的添加剂，和开发特定的聚合物基质组合物实现稳定化。

D.治疗方法

通过任何合适的手段施用整联蛋白β7拮抗剂，如本发明的抗β7抗体(和辅助治疗剂)，所述手段包括肠胃外、皮下、腹膜内、肺内和鼻内途径，并且如果希望局部治疗，进行损伤内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或者皮下施用。此外，通过脉冲输注，尤其施用降低剂量的抗体合适地施用抗体。给药可通过任何合适途径进行，例如，通过注射，如静脉内或皮下注射，这部分取决于施用是快速还是长期的。

本发明的治疗剂将以符合良好医学实践的方式配制、给药和施用。在该背景下考虑的因素包括被治疗的具体病症、被治疗的具体哺乳动物、个体患者的临床状况、病症的病因、药剂的递送部位、施用方法、施用时序安排，和医学从业者已知的其他因素。治疗剂不必但是任选用当前用于预防或治疗所讨论的病症的一种或多种活性剂配制。此类其他活性剂的有效量取决于制剂中存在的本发明抗体的量、病症或治疗的类型，和上面讨论的其他因素。这些通常以与前面使用的具有相同的剂量和施用途径或者为迄今使用剂量的约1到99％。

为了预防或治疗疾病，本发明的β7拮抗剂(当单独使用或者与其他活性剂如化学治疗剂组合使用时)的合适剂量将取决于待治疗的疾病类型、抗体类型、疾病的严重性和过程、该活性剂被施用是用于预防还是治疗目的、以前的疗法、患者的临床史和对抗体的应答、和主治医生的判断。将β7拮抗剂，如β7抗体一次或者在一系列治疗中适当地施用于患者。取决于疾病的类型和严重性，约1mg/kg到15mg/kg抗体是施用于患者的初始候选剂量，无论例如通过一次或多次单独施用，还是通过连续输注。一个典型的日剂量可以为约1mg/kg到100mg/kg或以上，这取决于上面提到的因素。对于在几天或更长时间内的重复施用，取决于状况，持续治疗直到出现疾病症状的所希望的抑制。抗体的一个示例性剂量将在约5mg/kg到约50mg/kg的范围内。从而，可以将约15mg/kg，20mg/kg，30mg/kg或50mg/kg(或其任何组合)的一个或多个剂量施用于患者。此类剂量可以间歇性施用，如每周至少一次或每2、3、4、5、6、7、8、10、12周至少一次(例如，使得患者接受约2到约20，例如约6次剂量的抗体)。可以施用最初较高的装载剂量，接着是一次或多次较低剂量。一个示例性给药方案包括施用约4mg/kg的最初装载剂量，接着是约2mg/kg抗体的每周维持剂量。然而，其他剂量方案可以是有用的。该疗法的进展通过常规技术和测定法容易地监测。取决于治疗的希望结果，可以治疗患者至少约1，2，6，12，24，36，或52周。

具有活动中等-严重活动UC的受试者的护理标准涉及用如下标准剂量的治疗：氨基水杨酸盐、口服皮质类固醇、6-巯基嘌呤(6-MP)和/或硫唑嘌呤。用整联蛋白β7拮抗剂，如本文公开的抗β7整联蛋白抗体的疗法将导致疾病减轻的改善(快速控制疾病和/或延长的减轻)，和/或临床应答，优于用此类受试者的护理标准所实现的效果。

在一个实施方案中，本发明对于具有IBD的人类受试者中炎性肠病(IBD)的治疗包括对该受试者施用有效量的治疗剂，如抗β7整联蛋白抗体，并且还包括对该受试者施用有效量的第二种药物，即免疫抑制剂、疼痛控制剂、止泻药、抗生素，或者其组合。

在示例性实施方案中，所述第二种药物选自由氨基水杨酸盐、口服皮质类固醇、6-巯基嘌呤(6-MP)和硫唑嘌呤组成的组。在另一示例性实施方案中，所述第二种药物是另一种整联蛋白β7拮抗剂，如另一抗β7整联蛋白抗体或者抗细胞因子的抗体。

各自地，所有这些第二种药物可以相互组合使用或者自身与第一种药物组合，使得如本文所用的表述“第二种药物”不表示它是除了第一种药物的唯一药物。从而，第二种药物不必是一种药物，而是可以组成或包含一种以上的此类药物。

如本文所述的这些第二种药物通常与如前面使用的药物以相同剂量和相同施用途径使用，或者为迄今使用的剂量的约1到99％。如果最终使用此类第二种药物，任选地，它们使用的剂量低于不存在第一种药物时使用的剂量，特别是在第一种药物的初始给药后随后的给药中，以便消除或减小由此导致的副作用。例如，用本文的抗β7整联蛋白抗体的疗法允许逐渐减少或者中断施用类固醇。

本文的组合施用包括使用分离的制剂或者单一的药物制剂共同施用，和以任一顺序连续施用，其中优选地存在两种(或所有)活性剂同时发挥它们的生物活性的时期。

第二种药物的组合施用包括使用分离的制剂或者单一的药物制剂共同施用(同时施用)，和以任一顺序连续施用，其中优选地存在两种(或所有)活性剂(药物)同时发挥它们的生物活性的时期。

E.使用生物标记评估整联蛋白β7拮抗剂对胃肠道炎性病症的治疗

本发明涉及治疗剂(或药物)，如整联蛋白β7拮抗剂治疗患有胃肠道炎性病症的患者的效果、功效、安全性、预后和/或给药的方法。具体地，本发明涉及使用患者外周血中的肠归巢淋巴细胞的水平、药物在肠归巢淋巴细胞上的占据水平、和/或肠归巢淋巴细胞上β整联蛋白受体的水平作为治疗剂如整联蛋白β7拮抗剂治疗胃肠道炎性病症的效果、功效、安全性、预后和/或给药的指示(或“生物标记”)的方法。此类方法包括例如，使用这些生物标记的一种或多种，评估患者对整联蛋白β7拮抗剂治疗胃肠道病症的应答性。此外，本发明提供使用此类生物标记设计药物治疗和/或给药方案或预后的方法。

在一些方面，将用治疗剂治疗患者前的生物标记水平与患者治疗期间和/或之后相同生物标记水平比较，并且患者中该生物标记水平的改变(例如，增加或减少)表明治疗剂如整联蛋白β7拮抗剂治疗患者中胃肠道炎性病症的效果、功效、安全性、和/或预后。此外，本发明的此类方法可用于设计药物治疗或治疗患者中胃肠道炎性病症的给药方案。

1.应答性的预测和/或监测

一方面，本发明涉及确定整联蛋白β7拮抗剂治疗患者中胃肠道炎性病症的功效的方法，该方法包括将用整联蛋白β7拮抗剂治疗之后或期间从患者得到的样品中生物标记的量与治疗前从患者得到的样品中该生物标记的量比较，其中与治疗前相比，治疗之后或期间该生物标记的量的改变表明该拮抗剂在治疗患者中胃肠道病症的功效。

另一方面，本发明涉及预测胃肠道炎性病症患者对整联蛋白β7拮抗剂治疗的应答性的方法，该方法包括将用整联蛋白β7拮抗剂治疗之后或期间从患者得到的样品中生物标记的量与治疗前从患者得到的样品中该生物标记的量比较，其中与治疗前相比，治疗之后或期间该生物标记的量的改变表明所述患者对所述拮抗剂治疗的应答性。在一个具体实施方案中，本发明提供了预测被诊断为胃肠道炎性病症的患者是否将应答包括β7施用的治疗的方法。该方法包括比较治疗后患者血样中肠归巢淋巴细胞的量与治疗前肠归巢淋巴细胞的量，其中用整联蛋白β7拮抗剂治疗后升高的量表明该患者应答所述治疗。

生物标记的量的测量，包括患者外周血中肠归巢淋巴细胞、肠归巢淋巴细胞上整联蛋白β7拮抗剂占据和肠归巢淋巴细胞上β7整联蛋白受体的量的测量，提供了在治疗期间早期，如接受第一次剂量的β7拮抗剂后不久，预测患者对β7拮抗剂治疗的应答性的益处。从而，患者和患者的医生不必等到治疗完成才发现治疗是否对该患者提供了任何益处。

在本发明的一个实施方案中，预测对β7拮抗剂治疗的应答性的方法包括：a)治疗前从患者得到血样；b)测量血样中生物标记的量；c)对患者施用整联蛋白β7拮抗剂；d)接受整联蛋白β7拮抗剂后从患者得到血样，e)测量血样中生物标记的量；f)比较b)中生物标记的量与e)中生物标记的量。如果观察到e)和b)之间升高的量，那么患者将应答该治疗。

为了建立生物标记的基线治疗前水平，那么优选在治疗前多个时间点，例如在治疗前至少1，2，5，10，20，30，40天测量生物标记的量。在示例性实施方案中，在治疗前5，10，20，30，60天测量患者血样中肠归巢淋巴细胞的量。计算每个点所测量量的平均值并且其将用作肠归巢淋巴细胞的治疗前基线水平。

为了预测患者对整联蛋白β7拮抗剂治疗的应答性，可以在治疗期间的，并且优选在治疗期间的早期任何给定点，例如，但不限于，在患者接受第一次剂量后约8小时，12小时，1，2，4，10，20，50，100，300或500天内，优选在患者接受第一次剂量后1-50天测量患者血液中生物标记的量。在一个实施方案中，在治疗期间单个目的点测量生物标记的量。将在测量的点得到的值与治疗前基线水平比较以为该点产生差别值。在另一实施方案中，在治疗期间的多个时间点(例如，至少2，4，6，8，10，16，20，40个点)测量生物标记的量。在每个点得到的值可以与治疗前基线水平比较以为每个测量点产生差别值。将基于这些差别值的分析评估对治疗的应答。

使用本领域可用的技术，如流式细胞术分析(FACS)等等，通过生物标记例如，但不限于CD4，CD45RA和Beta7的组合的表达水平鉴定肠归巢淋巴细胞。用本领域所用的标准技术，如流式细胞术(FACS)鉴定具有这些标记的不同表达模式的淋巴细胞亚群。

荧光激活细胞分选(FACS)提供了基于每个细胞的特定光散射和荧光特征将生物学细胞的异质性混合物分选到两个或更多容器(每次一个细胞)的方法。它是有用的科学仪器，因为它提供了快速、客观和定量记录来自个体细胞的荧光信号以及尤其感兴趣的细胞的物理分离。细胞悬浮液在液体的狭窄、快速流动的流体中心产生。该细胞流被排列为使得相对于它们的直径细胞间存在大的分离。振动机制引起细胞流断裂成个体的小滴。调节系统使得一个以上的细胞存在于一个小滴中的概率很低。刚好在细胞流断裂成小滴之前，细胞流穿过荧光测量站，在这里测量每个细胞的目的荧光特征。将充电环置于每个细胞流断裂成小滴的点处。基于刚好之前在荧光强度测量将电荷置于环上，并且相反电荷被捕获在从细胞流断裂的小滴上。然后带电的小滴下落通过静电偏转系统，该系统基于它们的电荷使得小滴转向到各容器中。在一些系统中，直接对细胞流施加电荷并且断裂的小滴保留与细胞流相同符号的电荷。然后细胞流在小滴断裂后返回到中性。

流式细胞仪产生的数据可以一维方向上作图以产生柱状图，或者以二维散点图作图，或甚至以三维作图。这些图上的区域可以基于荧光强度，通过产生一系列子集提取(称作“门”)顺序分开。对于诊断和临床目的存在特定的门控方案。通常基于对数尺度制图。因为在检测器处不同荧光染料的发射光谱重叠信号必须在电学上以及在计算上被弥补。通常，使用流式细胞术积累的数据可以在别处再次分析，将该机器让出来供别人使用(Loken MR.″Immunofluorescence Techniques in Flow Cytometry andSorting″：341-53.Wiley.(1990)。

通常，在人类患者血样中，使用本发明的生物标记，通过流式细胞术可以区分外周血CD4⁺淋巴细胞的三个亚型：CD45RA^-细胞，其优先归巢到肠淋巴结和组织，CD45RA^-细胞，其优先归巢到外周淋巴结和组织，和CD45RA⁺细胞，其不优先定位到肠和外周淋巴结和组织。从而，肠归巢淋巴细胞可以在流式细胞术中至少通过CD4⁺CD45RA^-或其他细胞表面标记或其组合，如CD8⁺CD45RA^-来鉴定。这三个淋巴细胞亚型位于FACS分析的散点图或柱状图的不同部分，因此技术人员可以区分。

可以用本领域的多种方式定量肠归巢淋巴细胞的量。可以为从患者收集的样品中每个时间点肠归巢CD4⁺淋巴细胞亚型计算作为预剂量基线水平百分比的绝对计数。也可以计算淋巴细胞的每个各自亚型的绝对计数，其等于绝对淋巴细胞数(表示为每微升外周血的淋巴细胞的从血液学测量得到的值)乘以(从流式细胞术分析得到的)每个亚型的门控淋巴细胞百分比。通过抗体计数也可以定量肠归巢淋巴细胞，抗体计数是绝对计数，为给药前得到的基线抗体数计数的百分比；计算为抗体计数除以预剂量绝对计数的平均数。作为对照，也可以为每个时间点的相同样品定量其他淋巴细胞亚型的量，如外周归巢淋巴细胞的量。

使用本领域公知的和本申请实施例中公开的技术也可以测量肠归巢淋巴细胞上β7拮抗剂占据的量和肠归巢淋巴细胞上β7整联蛋白受体的量。

可能为患者提供有益应答的治疗应该显著增加患者血液中肠归巢淋巴细胞的量而不实质性增加患者血样中外周归巢淋巴细胞的量。优选地，与治疗前基础水平相比，治疗后1，2，4，6，8，20，30，50，100天，治疗增加生物标记的量至少约30％，50％，或1，2，3，4，或5倍。在具体实施方案中，至少3或5倍的增加表明对治疗的有效应答。

另一方面，本发明提供了预测被诊断为胃肠道炎性病症的患者对治疗的有益应答的可能性的预后方法，所述治疗包括对所述患者施用整联蛋白β7拮抗剂，所述方法包括比较所述患者在接受整联蛋白β7拮抗剂后与治疗前血样中生物标记的量，其中接受整联蛋白β7拮抗剂后血样中生物标记的升高的量表明有益应答的可能性。

与预测治疗的应答性相似，外周血中生物标记的量可用于预测长期有益应答的可能性。有益应答包括，但不限于，减轻或消除胃肠道炎性病症的一种或多种典型症状，如腹痛、恶心、呕吐、腹泻、频繁的肠运动、发热、疲劳和体重减轻，或者实现疾病的部分或完全减轻。患者血样中肠归巢淋巴细胞的量可以用本文所述的相同方法定量。可能对患者提供长期有益应答的治疗将显著增加患者血液中生物标记的量而不实质上增加外周归巢淋巴细胞的量。优选地，与治疗前基线水平相比，对患者施用第一次剂量的所比较的整联蛋白β7拮抗剂后1，2，4，6，8，20，30，50，100天，治疗将生物标记的量增加至少约1，3，5，8，10倍。

在再一方面，本发明提供了监测被诊断为胃肠道炎性病症的患者对整联蛋白β7拮抗剂治疗的应答性的方法，包括监测所述治疗期间所述患者的外周血中生物标记的量，其中与治疗前相比，所维持的升高量表明维持对所述治疗的应答性。具体地，如本文所述的计算测试的患者中生物标记的量的治疗前基线水平。为了监测患者对整联蛋白β7拮抗剂治疗的应答性，可以在治疗过程期间的任何给定时间点并且优选在整个治疗过程的多个时间点测量患者血样中生物标记的量。例如，取决于治疗的持续时间或者所希望的治疗功效，至少每1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，20天测量生物标记的量。也可以使用该方法监测对治疗的应答性对介入事件的反应。例如，可以在施用第二次药物或者开始改变的剂量，或者患者的生理或精神状态的任何改变，等等后马上测量患者血样中生物标记的量。理想地，应该为维持的治疗应答性观察到肠归巢淋巴细胞的维持的升高水平。如果在治疗期间或者对某些介入事件的反应中的某个点生物标记水平降低，那么其表明患者对治疗的应答性降低。应该因此修饰治疗方案以维持升高量的生物标记。

本发明因此还包括对诊断为胃肠道炎性病症的患者用β7拮抗剂修饰治疗的方法，包括：a)用上述方法监测所述患者对所述治疗的应答性；和b)改变所述治疗使得维持所述淋巴细胞的升高的量。

本发明包括为患者中胃肠道炎性病症的治疗测定整联蛋白β7拮抗剂的给药或给药方案的方法，该方法包括基于用整联蛋白β7拮抗剂的剂量或给药方案治疗之后或期间从患者得到的样品中生物标记量与该治疗前从该患者得到的样品中生物标记量的比较，调节整联蛋白β7拮抗剂的剂量或给药方案，其中如与治疗前所比较的，治疗后或期间生物标记量的改变表明对于患者中胃肠道病症的治疗，整联蛋白β7拮抗剂的剂量或给药方案的功效或对所述剂量或给药方案的应答性。

2.设计治疗方案

药物开发是复杂并且昂贵的过程。将新药上市的费用估计为8亿到10亿美元之间。在I期临床试验中少于10％的药物进入批准期。药物在后来阶段失败的两个关键原因是缺少剂量-浓度反应和非预期的安全性事件之间的关系的理解。考虑到该情况，关键是有工具帮助预测药物在体内情况如何和协助临床治疗候选者的成功(Lakshmi Kamath，Drug Discovery andDevelopment；Modeling Success in PK/PD Testing Drug Discovery &Development(2006))。

药代动力学(PK)表征药物的吸收、分布、代谢和清除性质。药效学(PD)定义对施用的药物的生理学和生物学应答。PK/PD建模建立了这两种方法的数学和理论联系并且帮助更好地预测药物作用。集成的PK/PD建模和通过模拟进行的计算机辅助的试验设计正被整合到许多药物开发程序中并且具有不断增长的影响(Lakshmi Kamath，Drug Discovery and Development；Modeling Success in PK/PD Testing Drug Discovery & Development(2006))。

PK/PD试验通常在药物开发过程的每个阶段进行。因为开发正变得越来越复杂，费时，并且昂贵，许多公司正寻求更好地利用PK/PD数据以开始时清除有缺点的候选物并鉴定那些临床成功机会最高的那些候选物(Lakshmi Kamath，上文)。

PK/PD建模方法在确定生物标记应答、药物水平和给药方案之间的关系正被证明是有用的。药物候选者的PK/PD图和预测患者对其应答的能力对于临床试验的成功是关键的。分子生物学技术中的最近进展和多种疾病靶标的更好理解已经将生物标记验证为药物的治疗功效的良好的临床指标。生物标记测定法帮助鉴定对药物候选者的生物应答。一旦在临床上验证了生物标记，就可以对试验模拟有效建模。生物标记具有实现替代品状态的潜力，其可以某天代替药物开发中的临床结果(Lakshmi Kamath，上文)。

外周血中生物标记的量可用于鉴定对整联蛋白β7拮抗剂治疗的生物应答并且因此可以作为候选物治疗的治疗功效的良好临床指标发挥功能。

本发明包括为诊断为胃肠道炎性病症的人类患者设计候选试剂治疗的方法，包括基于应答所述候选试剂的治疗，有效增加非人类受试者的外周血中生物标记的量的剂量，确定人类患者的有效剂量，其中所述生物标记选自由患者外周血中肠归巢淋巴细胞、肠归巢淋巴细胞上所述治疗剂的占据，和肠归巢淋巴细胞上β7整联蛋白受体组成的组。

在示例性实施方案中，提供了为诊断为胃肠道炎性病症的人类患者设计整联蛋白β7拮抗剂治疗的方法，包括：a)测量应答候选治疗的非人类受试者血样中生物标记的量，所述候选治疗包括对所述非人受试者施用候选剂量的整联蛋白β7拮抗剂；b)测定候选剂量是否可以有效增加所述非人受试者外周血中生物标记的量；c)鉴定有效增加所述非人受试者外周血中生物标记量的剂量；和d)基于所鉴定的剂量确定对人类患者有效的剂量。

在一个实施方案中，本发明的方法用于鉴定在II期和/或III期临床试验研究中潜在提供希望的有益应答的候选剂量。

在I期临床试验中接受候选治疗前收集测试的非人受试者的血样，并如本申请E1部分中所述建立该受试者的外周血中生物标记的基线水平。测试的非人受试者然后接受候选治疗，包括对测试的受试者施用候选剂量的整联蛋白β7拮抗剂。在治疗期间的任何希望的时间点，或者在治疗结束后如E1部分所述从受试者再次收集血样。先将应答候选治疗的生物标记的量与治疗前基线比较，从而为候选治疗确定与治疗前基线相比的差别值。如果候选治疗导致生物标记的量显著增加，例如，至少50％，1，2，3，5，8，或10倍，那么将该剂量选择为II期或III期临床试验中治疗设计的候选剂量。肠归巢淋巴细胞可以用本领域中和本申请的E1部分描述的标准技术鉴定，尤其通过细胞表面标记，如CD45AR，CD4(CD8)和β7来鉴定。通过本领域可得的和E1部分所述的方法可以定量生物标记的量。

上述方法可以用于多次测试多种候选治疗，特别是多个候选剂量。导致测试的候选剂量中淋巴细胞量的最适增加的候选剂量将被选择用于II期或III期临床试验中的治疗设计。在一个实施方案中，可以为相同的非人受试者测试多个候选剂量的每一个。在结束候选治疗后，将使用本申请的方法，例如通过检查生物标记的量是否返回到治疗前基线水平来检查治疗的残留效果。生物标记的量返回到治疗前基线水平后，可以对相同受试者递送另一候选治疗来观察其对肠归巢淋巴细胞的影响。在另一实施方案中，可以同时在多个受试者中测试多个候选治疗，对每个受试者给予每个候选治疗。可能需要对多个受试者测试同一候选方案来消除受试者中应答相同治疗的个体差异。

从I期临床试验选择的候选剂量将用于使用本领域的标准方法，包括但不限于PK/PD建模来设计II和III期临床试验的最佳剂量。药物开发中的常规PK/PD建模定义如下参数，如药物剂量浓度、药物暴露效果、药物半寿期、随时间的药物浓度，和随着时间的药物效果。当更宽泛地使用时，定量技术如药物建模、疾病建模、试验建模，和市场建模可以支持整个开发过程，其导致在风险的明确考虑中更好的决策和更好地利用知识。药物开发研究人员可利用多种PK/PD建模工具，例如Pharsight，Inc.MountainView，California开发的WinNonlin and the Knowledgebase Server(PKS)。

F.对其他候选试剂治疗的应答性的生物标记

生物标记的量也可以用于预测对除了整联蛋白β7拮抗剂的候选治疗剂治疗的应答性。具体地，本文所述的预测整联蛋白β7拮抗剂治疗结果的方法可以以相同方式用于：1)预测患者是否将应答包括对该患者施用候选治疗剂的治疗；2)预测治疗益处的可能性；3)监测患者对治疗的应答性；和4)用候选治疗剂修改该治疗。生物标记的量也可以用于用上述方法设计用除了整联蛋白β7拮抗剂之外的候选治疗剂的治疗。

优选地，候选试剂为炎性肠病患者提供了有益效果，如本文所述的免疫抑制剂。更优选地，该试剂抑制肠归巢淋巴细胞直接或间接渗入患者的肠中。

G.预测预后

除了预测对治疗的应答性外，生物标记的量也可以用于预测炎性肠病的预后。

本发明因此包括预测患者的炎性肠病预后的方法，包括：a)测量所述患者血样中肠归巢淋巴细胞的量和外周归巢淋巴细胞的量之间的比率；和b)测量健康个体的血样中肠归巢淋巴细胞的量和外周归巢淋巴细胞的量之间的比率，其中所述患者与健康个体相比改变的比率表明该疾病的预后。

为了预测预后，得到许多健康个体的血样。用本发明的方法测量肠归巢淋巴细胞，特别是CD45RA^-CD4⁺细胞的量。也测量相同血样中外周归巢淋巴细胞(CD45RA^-CD4⁺)的量。然后为每个血样计算肠归巢淋巴细胞的量相对于外周归巢淋巴细胞量的比率。基于每个健康个体的比率建立健康个体的平均基线比率。该基线比率将用作确定是否观察到所检查的患者中降低的比率的对照。然后从测试的患者得到血样并计算肠归巢淋巴细胞的量相对于外周归巢淋巴细胞的量的比率。如果与基线对照相比对患者观察到该比率的显著改变(增加或减少)，如至少约30％，50％，100％，200％改变，那么患者将可能具有差的预后，例如，减轻的低概率、复发、突发或药物抗性的高概率。

H.鉴定淋巴细胞群体的方法

人源化抗β7整联蛋白抗体rhuMAb Beta7结合到β7整联蛋白亚基，不管其结合配偶体如何。从而，当β7单独存在或者与α4或αE结合时，rhuMAbBeta7都结合到β7。从而，该抗体和其变体是鉴定包含表达αEβ7整联蛋白和/或α4β7整联蛋白的淋巴细胞的淋巴细胞群体的良好标记。在优选实施方案中，所鉴定的淋巴细胞群体包含表达αEβ7整联蛋白的淋巴细胞、表达α4β7整联蛋白的淋巴细胞和表达α4β7整联蛋白和αEβ7的淋巴细胞。这与本领域中现有的抗β7抗体如act1(Meenan et al.，上文)不同，当β7亚基连接到α4时，act1只能结合β7亚基。

本发明涉及鉴定包含表达αEβ7整联蛋白和/或α4β7的淋巴细胞的淋巴细胞群体的方法，包括将所述淋巴细胞与分离的抗体结合，该抗体与包含SEQ ID NO：25的轻链可变区序列和SEQ ID NO：26的重链可变区序列的抗体结合相同表位。

在一个实施方案中，本发明的方法用于鉴定患者的外周血中表达β7的淋巴细胞。具体地，收集患者的血样并可以通过使用流式细胞术，用β7、CD4和CD45AR作为细胞表面标记鉴定并分离包含表达αEβ7整联蛋白的细胞和表达α4β7整联蛋白的细胞和表达这两种整联蛋白的细胞的淋巴细胞群体。

在另一实施方案中，本发明的方法用于通过本领域使用的标准程序，如用rhuMAb Beta7进行免疫组织学染色来显示患者肠的淋巴结和组织中包含表达αEβ7整联蛋白的细胞和表达α4β7整联蛋白的细胞的淋巴细胞群体。

本文所述的方法尤其可用于检测与炎性肠病的发生和进展密切相关的淋巴细胞群体。所鉴定的群体，尤其从患者的外周血获得的群体可用作预测患者对治疗的应答性，以及如E和F部分中所述设计治疗方案的生物标记。

认为前面的书面说明书足够使得本领域技术人员实施本发明。本发明的范围不受到所保藏的构建体的限制，因为所保藏的实施方案意在仅仅说明本发明的某些方面并且在功能上等同的任何构建体都在本发明的范围内。本文材料的保藏不构成承认本文所含的书面说明不足以能够实施本发明的任何方面，包括其最佳实施方式，也不理解为限制权利要求的范围。实际上，除了本文所述的显示的那些，根据前面的描述，本发明的多种修饰将对于本领域技术人员是显而易见的，并且在所述权利要求的范围内。

可以理解按照本文所含的教导，本发明教导对于具体问题或情况中的应用将在本领域普通技术人员的能力范围之内。

通过下面的非限制性实施例阐明本发明的其他细节。将说明书中所有引文的公开内容明确并入本文作为参考。

实施例

实施例1

通过猕猴中静脉内和皮下注射每周施用rhuMAb Beta7，进行12周安全性和毒理动力学研究与15周恢复期和延长期来评估药效学效果的逆转

1.摘要

rhuMAb Beta7是结合整联蛋白αEβ7和α4β7的人源化抗人整联蛋白β7单克隆抗体。表达这些整联蛋白的细胞已经与肠的炎性疾病如溃疡性结肠炎和局限性回肠炎有关(Feagan et al.2005；Sandborn et al.2005)。rhuMAb Beta7正被研究作为免疫系统介导的疾病如炎性肠病的潜在治疗剂。该研究的目的是评估当每周静脉内(IV)注射或皮下(SC)注射到猕猴(Macaca fascicularis)至少施用12周时，rhuMAb Beta7的安全性、毒理动力学和药效学，和评估15周恢复后任何药物相关效果的可逆性、持久性和延迟的发生。此外，在尸检前观察来自对照、中等剂量和高剂量组的动物亚组额外的时间(延长期中)，以评估药效学效果的逆转。

将首次用于实验的猕猴分成六组(组1、3、4、5和6中7只动物/性别/组，组2中5只动物/性别)。组1动物通过IV和SC注射给予总共12周剂量的载体。组2-6中的动物分别以5mg/kg IV(组2)，15mg/kg IV(组3)，50mg/kg IV(组4)，15mg/kg SC(组5)，或50mg/kg SC(组6)给予rhuMAb Beta7的总共12周的每周剂量。12周的给药期后，在研究的第80天(最后剂量后2天)将来自每个剂量组的3只雄性和3只雌性动物进行尸检。剩余的动物在恢复期期间观察额外的15周。在恢复期结束时(研究第184天)，对2只动物/性别/组进行尸检。15周恢复期尸检后，观察剩余的动物(来自组1和3每组2只雄性和1只雌性和来自组4、5和6每组2只雄性和2只雌性)以评估PD效果的逆转。在该延长期监测PD终点并将结果用于确定该研究的存活期的终点。

通过流式细胞术监测根据它们的归巢特性细分的三个亚型的外周血CD4⁺淋巴细胞作为探索性PD标记：CD45RA^-CD45RA^-和CD45RA⁺CD4⁺细胞(见图1)。CD45RA^-CD4⁺细胞在表型上与优先归巢到肠淋巴结和组织的人和小鼠记忆/效应淋巴细胞相似，而CD45RA^-CD4⁺细胞在表型上与优先归巢到外周淋巴结和组织的人和小鼠记忆/效应淋巴细胞相似(Rott et al.1996；Rott et al.1997；Williams etal.1998；Roséet al.1998；Williams和Butcher 1997；Butcher et al.1999)。表型上与人和小鼠幼稚淋巴细胞相似的CD45RA⁺CD4⁺细胞没有明显偏好性地运输到肠和外周淋巴结(Rott et al.1996；Rott et al.1997；Williams et al.1998；Roséet al.1998；Williams和Butcher 1997；Butcher etal.1999)。

IV施用5mg/kg rhuMAb Beta7后，在给药期内，CD45RA^-β7^高CD4⁺淋巴细胞的组平均值相对于基线水平增加了约4到5倍。施用15mg/kg或50mg/kg rhuMAb Beta7(IV或SC)导致与基线水平相比，给药期内CD45RA^-7^high CD4⁺淋巴细胞的组平均数目稍微更大的增加(约5到6倍)。一般，不像5mg/kg剂量组中的多数动物，给予15或50mg/kg(IV或SC)的动物多数在给药期内具有持续的PD效果。给予载体的动物在外周血CD45RA^-CD4⁺淋巴细胞的组平均数没有显示出实质改变。在给予载体或rhuMAb Beta7剂量的猕猴中CD45RA⁺β7^中CD4⁺淋巴细胞和CD45RA^-β7^低CD4⁺淋巴细胞的组平均数没有实质不同。这些发现与所提出的rhuMAb Beta7作用机理相一致——通过阻止α4β7与其配体的结合，抑制β7阳性淋巴细胞向肠的归巢。预期该提出的机理导致外周循环中CD45RA^-β7^高CD4⁺淋巴细胞的积累。

在15周恢复期结束时(研究第184天)，在给予5mg/kg IV剂量rhuMAb Beta7的所有动物(10只中的10只)中，CD45RA^-CD4⁺淋巴细胞的数目返回到基线水平。在给予IV剂量的15或50mg/kgrhuMAb Beta7的组中，分别为13只动物中的7只和14只动物中的2只动物中，CD45RA^-CD4⁺淋巴细胞数目返回到基线水平。在给予SC剂量的15或50mg/kg rhuMAb Beta7组中。分别为14只动物中的6只和14只动物中的1只动物中，CD45RA^-CD4⁺淋巴细胞数目返回到基线水平。从而，CD45RA^-CD4⁺淋巴细胞的绝对数目返回基线水平的比率似乎取决于剂量。在PD延长期结束时(在研究第288天)，研究中剩余的所有猕猴动物(给予15mg/kg IV的组中n＝3，给予50mg/kg IV，15mg/kgSC，或50mg/kg SC的每组中n＝4)显示出PD效果的逆转(返回到CD45RA^-CD4⁺淋巴细胞的基线水平)。

此外，PD效果似乎与药代动力学相关，因为所观察到的可逆性和向CD45RA^-β7^高CD4⁺淋巴细胞的基线水平的返回与rhuMAb Beta7的清除相关并且可逆性似乎是剂量依赖性的。

在PD效果向预剂量水平的返回比率中，相同剂量组中动物之间的变异性与rhuMAb Beta7清除的改变相关。

2.安全性、毒理动力学和药效学

当通过静脉内(IV)注射或皮下(SC)注射到猕猴(Macaca fascicularis)中至少12周每周施用时，评价rhuMAb Beta7的安全性、毒理动力学和药效学，并在15周恢复后评估任何药物相关效果的可逆性、持久性和延迟的发生。此外，在尸检前(延长期内)观察来自对照、中等剂量和高剂量组的动物亚组额外的时间以评估药效学效果的可逆性。

2.1试验材料

rhuMAb Beta7，批号M3-TOX165由Genentech作为澄清液体以150mg/mL(每瓶1.3mL)的浓度提供。在研究中使用前，将测试试剂保存在冰箱设备中以保持2℃-8℃的温度范围。

载体rhuMAb Beta7载体，批号M3-TOX166由Genentech作为澄清液体在25-mL瓶中提供。在该研究中使用前，将载体保存在冰箱设备中以保持2℃-8℃的温度范围。

2.2物种

毛里求斯来源的雄性和雌性幼稚猕猴(Macaca fascicularis)来自Covance Research Products，Inc.(Harrisburg，PA)。动物在给药开始前适应约4周。

47只雄性和47只雌性动物在该研究中可能使用前初步适应。在适应期间(预剂量期)收集的数据用于为研究选择清除不予考虑的动物以产生最小的变异。使用设计的计算机化程序将40只雄性和40只雌性猕猴分配到该研究中以实现各组的体重平衡。

2.3研究设计

该研究包含三个期：12周的给药期、15周恢复期，和延长期。施用最后剂量的rhuMAb Beta7，2天后，在研究第80天尸检时结束12周给药期。15周的恢复期在12周给药期后，并且在研究第184天尸检时结束。15周恢复期后，是额外期(延长期到研究第288天)以评估PD效果的逆转。完整的研究设计在表1中概述。

表1

研究概述

IV＝静脉内；SC＝皮下。

^a12-周给药期(最后剂量后2天)后，安乐死3只动物/性别/组。剩余的动物经历恢复期。15周恢复期后，安乐死2只动物/性别/组。在尸检前观察来自组4、5和6的2只动物/性别/组和来自组1和3的2只雄性和1只雌性动物/组额外的时间。在该延长期监测PD终点并且结果用于确定结束的时限。

^b动物在研究第1，8，15，22，29，36，43，50，57，64，71，和78天给药。

^c组1的动物通过IV和SC注射接受载体(对照)。

^d组5和6仅仅接受SC注射rhuMAb Beta7。

2.5剂量施用

动物在研究第1，8，15，22，29，36，43，50，57，64，71，和78天每周通过隐静脉静脉内注射或SC注射接受12次注射。记录SC剂量的注射部位。基于最近记录的体重确定剂量。以每千克体重0.33mL的体积对动物给药。IV注射后是约1mL的盐水冲洗。

记录这些偏差并且其不影响PD结果的解释。

2.6PD血样收集

在预剂量期(剂量开始前约6天)、研究第1日给药前、研究第2日(第一次剂量后24小时)、研究第15，29，43，57，71和78天给药前，和尸检前研究第80天，通过从股静脉静脉穿刺一次从每只动物收集用于PD分析的血样(约1mL)。在15周的恢复期(R)，在研究第92(R13)，106(R27)，120(R41)，134(R55)，148(R69)，162(R83)，和184天(R105)收集样品。在延长期内，在研究第190日(R111)开始直到并包括最后尸检日(研究第288日)，每隔一周从存活的动物收集血样，以评估PD效果的逆转。

2.7PD血样处理

用于PD分析的样品在冷冻的凝胶包上包装以保持约2℃-15℃的温度范围至少72小时并在收集当天运输到Genentech。

2.8PD流式细胞术测定

通过流式细胞术评价三个外周血CD4⁺淋巴细胞亚型作为探测性PD生物标记：CD45RA^-细胞(表型与人记忆/效应CD4⁺淋巴细胞相似，其优先归巢到肠淋巴结和组织)，CD45RA^-细胞(表型与人记忆/效应CD4⁺淋巴细胞相似，其优先归巢到外周淋巴结和组织)，和CD45RA⁺细胞(表型与人幼稚CD4⁺淋巴细胞相似，其不优先定位到肠和外周淋巴结和组织)(Rott et al.1996；Rott et al.1997；Williams et al.1998；Roséet al.1998；Williams and Butcher 1997；Butcher et al.1999)。在图1中给出了猕猴中CD4⁺淋巴细胞亚型的代表性流式细胞术图。外周血CD8⁺淋巴细胞亚型(CD45RA^-CD45RA^-和CD45RA⁺CD8⁺淋巴细胞)以相似方式检查，但是不用于PD评估中。

2.8.1表达测定法：评估外周血中表达β7-的淋巴细胞亚型

使用在rhuMAb Beta7存在下结合β7的非封闭性抗β7抗体(9D8)，通过流式细胞术评估CD45RA^-CD45RA^-和CD45RA⁺.CD4⁺或CD8⁺淋巴细胞。在表2给出了全血样品分析的小组配置。所有抗体购自BD Biosciences(BD；San Jose，CA)，只是链霉抗生物素蛋白-别藻蓝蛋白(SA-APC)(其购自Invitrogen Corp.(Carlsbad，CA))以及9D8-生物素(其由Genentech提供)除外。

表2

用于测量表达β7的淋巴细胞的全血小组配置

APC＝别藻蓝蛋白；FITC＝异硫氰酸荧光素；FSC＝前向散射；IgG＝免疫球蛋白G；PE＝藻红蛋白(phycoerytherin)；PerCP-Cy5.5＝多甲藻素叶绿素蛋白-花菁-5.5；SA＝链霉抗生物素蛋白；SSC＝侧向散射。

^a9D8-生物素首先温育，之后加入SA-APC。

对于所有全血样品，根据程序55656-43进行流式细胞术测定。对于每个样品，将管2和3首先与饱和浓度的9D8-生物素温育。手工制备仪器设置对照管(同种型对照和单个染料)和测定管(管1、2和3)。首次温育后，向裂解的红细胞加入2mL裂解溶液，接着进行一轮细胞洗涤。第二次温育后，将样品(管2和3)与饱和浓度的针对CD4(克隆L200)(管2)或CD8(克隆SK1)(管3)，以及CD45RA(克隆5H9)和CD49d(克隆9F10)的荧光缀合的单克隆抗体或同种型对照抗体(管1)温育。除了同种型对照抗体外，每种上述抗体都与猕猴白细胞交叉反应。也向管1、2和3加入SA-APC以检测生物素化的抗体。在黑暗中湿润冰上进行温育30-3033330-分钟。进行一系列洗涤步骤，然后将细胞重悬浮在固定缓冲液中。样品在2℃-4℃保持最少30分钟并且在同一天获得。

在(BD，序列号E2020)上进行流式细胞术获取。使用前向散射(FSC)/侧向散射(SSC)图获得25000个淋巴细胞事件。数据分析基于FSC/SSC-门控的淋巴细胞和CD4⁺/SSC^低-门控的淋巴细胞或CD8⁺/SSC^低-门控的淋巴细胞，使用CellQuest Pro软件(BD CellQuest Pro，版本5.2.1)。产生流式细胞术图以建立每种细胞表面标记阳性的细胞分数。

分析β7亚群作为门控的CD4⁺细胞或门控的CD8⁺细胞的百分比，并且单独作为几何平均荧光强度(GMFI)。为了分析CD4⁺细胞和CD8⁺细胞的细胞表面上β7的相对水平，通过乘以每个群体的GMFI计算等同可溶荧光的分子(MOEF)，用SpheroTech Beads(Spherotech，Inc.；Lake Forest，IL)产生标准曲线。在整个研究中监测门控细胞的GMFI和百分比，以检查检品对三个CD4⁺和CD8⁺淋巴细胞亚型每一个的影响。基于每微升外周血(Covance提供)的淋巴细胞计数，为每个时间点的每个样品计算绝对细胞数。

2.8.2占据测定法：外周血中可用CD45RA^-β7^高淋巴细胞

使用在饱和浓度rhuMAb Beta7存在下不结合的封闭性抗β7抗体(荧光标记的检品，rhuMAb Beta7)测量CD45RA^-淋巴细胞和CD45RA^-淋巴细胞上β7的占据。荧光缀合的(一种人源化IgG1抗体)用作rhuMAb Beta7的同种型对照。

在表3中给出了用于分析全血样品的小组配置。所有抗体购自BD，Herceptin-Alexa 647和rhuMAb Beta7-Alexa 647除外(由Genentech提供)。

表3用于测量淋巴细胞上β7占据的全血小组配置

Alx647＝Alexa 647；FITC＝异硫氰酸荧光素；Her＝Herceptin；PE＝藻红蛋白；PerCP＝多甲藻素叶绿素蛋白。

根据程序55656-50，用饱和浓度的下列抗体缀合物染色血样：缀合到异硫氰酸荧光素的CD4(FITC；克隆M-T477)；缀合到藻红蛋白的CD45RA(PE；克隆5H9)，缀合到PerCP的CD8(克隆SK1)，和缀合到Alexa-647的Herceptin或缀合到Alexa 647的rhuMAb Beta7。在试管3中，向外周血样中加入饱和浓度(10μg/mL)的rhuMAb Beta7。

所有温育在冰上黑暗中进行30-35分钟。染色后，将血红细胞裂解，洗涤样品，用Lyse Wash Assistant(BD)将细胞重悬浮在固定缓冲液中。在BD FACSCalibur上用FSC/SSC门获得25000个门控的淋巴细胞事件。

从SSC/FSC点图鉴定淋巴细胞。然后分别使用SSC/CD 4FITC或SSC/CD8 PerCP图鉴定CD4和CD8细胞。试管1用作门控的阴性对照。为有和没有饱和浓度rhuMAb Beta7的试管鉴定CD45RA^-β7^高，CD45RA^-β7^低，和CD45RA⁺β7^中CD4细胞或细胞。图1显示了猕猴外周血中淋巴细胞亚型。

2.9PD数据分析

在给予载体或rhuMAb Beta7的动物收集的样品中在每个时间点，为CD4⁺淋巴细胞亚型(CD45RA^-β7^高，CD45RA^-β7^低，和CD45RA⁺β7^中)和CD8⁺淋巴细胞亚型(CD45RA^-β7^高，CD45RA^-β7^低，和CD45RA⁺β7^中)计算绝对计数作为预剂量的基线水平百分比(绝对计数，％BL)。为每组确定个体绝对计数的平均值作为基线百分比。对于雌性，两个预剂量值用于计算所有流式细胞术评估的基线值。对于雄性，因为技术困难(仪器故障)，仅仅一个预剂量值(来自研究第1天)用于计算用于9D8非封闭抗体的表达测定法的基线值。从使用表3中所示血液小组配置的流式细胞术分析获得的总CD4⁺淋巴细胞和总CD8⁺淋巴细胞的门控值(作为百分比)分别用于计算占据和表达测定中总CD4⁺淋巴细胞和总CD8⁺淋巴细胞的绝对计数。图1显示了猕猴外周血中CD+淋巴细胞亚型。通过流式细胞术分析测定值的定义如下：

绝对计数：每个各自淋巴细胞亚型的绝对数；等于绝对淋巴细胞计数(从血液学测量得到的值，表示为每微升外周血的淋巴细胞)乘以每个亚型的门控淋巴细胞百分比(从流式细胞术分析得到)。

绝对计数(％BL)：作为基线绝对计数百分比的给药前获得的绝对计数；计算为绝对计数除以预剂量绝对计数的平均值。

MOEF：等同荧光的分子；使用FL4通道的斜率乘以几何平均荧光强度计算。

MOEF(％预剂量)：作为给药前MOEF百分比的MOEF；计算为给药后各时间点的MOEF除以给药前平均MOEF。

3.结果和讨论

在图2-7中给出了用非封闭性9D8抗体评估的外周血CD4⁺淋巴细胞亚型的组平均(±SD)和个体猕猴绝对计数(％BL)。

静脉内施用5mg/kg rhuMAb Beta7后，CD45RA^-β7^高CD4⁺淋巴细胞的组平均数相对于基线水平增加了约4到5倍(见图2)。施用15mg/kg或50mg/kg rhuMAb Beta7(IV或SC)导致与基线水平相比，CD45RA^-β7^高CD4⁺淋巴细胞的组平均数稍微更大的增加(约5到6倍)(见图2和3)。一般，不像5mg/kg剂量组中的多数动物，给予15或50mg/kg(IV或SC)的动物多数在给药期内具有持续的PD效果(图14-18)。给予载体的动物在CD45RA^-β7^高CD4⁺淋巴细胞的组平均数没有显示出实质改变(见图2和3)。在静脉内施用25mg/kg rhuMAb Beta7后，CD45RA^-β7^高CD4⁺淋巴细胞的组平均数相对于基线水平增加了约4到6倍(见图8)。

这些发现与所提出的rhuMAb Beta7作用机理相一致：抑制CD45RA^-淋巴细胞向肠的运输，导致外周循环中这些细胞的积累(见图11)。也支持该提出的作用机理的是，与给予rhuMAb Beta7的动物相比，在给予载体的动物中CD45RA⁺β7^中CD4⁺淋巴细胞或CD45RA^-β7^低CD4⁺淋巴细胞的组平均水平没有实质性不同(见图4-8)。

到15周恢复期结束时(研究第184天)，在给予静脉内剂量的5mg/kgrhuMAb Beta7的10只动物的10只动物中，外周血CD45RA^-β7^高CD4⁺淋巴细胞的数目返回到基线水平(见图14)。在给予15mg/kg和50mg/kg的静脉内剂量的组中，分别在13只动物中7只和14只动物中的2只动物中，外周血CD45RA^-β7^高CD4⁺淋巴细胞的数目返回到基线水平(见图15-16)。在给予15mg/kg和50mg/kg的皮下剂量的动物中，分别在14只动物中6只和14只动物中的1只动物中，CD45RA^-β7^高CD4⁺淋巴细胞的数目返回到预剂量水平(见图17-18)。从而，所观察到的PD效果向基线的返回似乎是剂量依赖性的。在给予载体的动物的外周血中CD45RA^-β7^高CD4⁺淋巴细胞的数目没有实质改变，1只动物除外，该动物显示出轻微的差异性(见图13)。

到PD延长期结束时(研究第288天)，研究中剩余的(15mg/kg IV剂量组中n＝3；50mg/kg IV，15mg/kg SC，和50mg/kg SC剂量组中n＝4/组)被给予rhuMAb Beta7的所有猕猴都显示出PD效果的逆转(CD45RA^-β7^高CD4⁺淋巴细胞返回到基线水平；见图15-18)。也检查了外周血CD8⁺淋巴细胞亚型(CD45RA^-CD45RA^-和CD45RA⁺CD8⁺淋巴细胞)并且观察到相似结果。

检查了外周血CD4⁺淋巴细胞上β7表达的相对水平作为MOEF。5，15，或50mg/kg rhuMAb Beta7的IV剂量或15或50mg/kg rhuMAb Beta7的SC剂量后，在猕猴中没有外周血CD4⁺淋巴细胞上β7下调的证据(见图19-22)。

总之，外周血中CD45RA^-β7^高CD4⁺淋巴细胞向基线水平的返回速率在给予rhuMAb Beta7的猕猴中似乎是剂量依赖性的。而且，不像5mg/kg剂量组中的多数动物，给予15或50mg/kg(IV或SC)的动物中多数在给药期内具有持续的PD效果。此外，PD效果似乎与药代动力学相关，因为所观察到的可逆性和CD45RA^-β7^高CD4⁺淋巴细胞向基线水平的返回与rhuMAb Beta7的清除相关并且似乎是剂量依赖性的。在相同剂量组中动物之间PD效果向预剂量水平的返回速率的变异性与rhuMAb Beta7的清除的改变相关。rhuMAb Beta7清除中这些改变一般与一些动物中抗治疗抗体(ATAs)的存在有关(见图14-18)。

7.结论

猕猴中5，15，或50mg/kg rhuMAb Beta7的IV或SC剂量后，与预剂量水平相比，CD45RA^-β7^高CD4⁺淋巴细胞(表型上与肠归巢细胞相似)的组平均数增加了约4到6倍。相反，给予载体的动物直到研究第184日，外周血CD45RA^-β7^高CD4⁺淋巴细胞的组平均数没有显示出实质改变。

这些研究与rhuMAb Beta7的作用机理一致：通过阻止α4β7与其配体的结合，抑制β7阳性淋巴细胞向肠的归巢。该提出的机理预期导致外周循环中CD45RA^-β7^高CD4⁺淋巴细胞的积累，其在该研究中观察到。也支持该提出的作用机理的是，与给予rhuMAb Beta7的动物相比，在给予载体的猕猴中CD45RA⁺β7^中CD4⁺淋巴细胞(表型上与幼稚CD4⁺细胞相似)或CD45RA^-β7^低CD4⁺淋巴细胞(表型上与外周归巢CD4⁺细胞相似)的组平均水平没有实质差异。

到15周恢复期结束时(研究第184日)，在给予5mg/kg rhuMAb Beta7的IV剂量的组中所有动物(10只动物中的10只)中外周血CD45RA^-β7^高CD4⁺淋巴细胞的数目返回到预剂量水平。在给予15mg/kg或50mg/kgrhuMAb Beta7的动物中，在IV剂量组中13只动物的7只和14只动物的2只(分别)以及在SC剂量组中14只动物的6只和14只动物的1只(分别)中，外周血CD45RA^-β7^高CD4⁺淋巴细胞的数目返回到预剂量水平。在PD延长期结束时(研究第288日)，研究中剩余的给予rhuMAb Beta7的所有猕猴都显示出PD效果的逆转。

这些发现表明外周血中CD45RA^-β7^高CD4⁺淋巴细胞向基线水平的返回的表观剂量依赖性。此外，PD效果似乎与药代动力学相关，因为所观察到的可逆性和许多CD45RA^-β7^高CD4⁺淋巴细胞向基线水平的返回与rhuMAb Beta7的清除相关。在相同剂量组中动物之间PD效果向预剂量水平的返回速率的变异性与rhuMAb Beta7的清除的改变相关，所述改变与一些动物中ATA的存在有关。

参考文献

1.Andrew DP，Berlin C，Honda S，et al.Distinct but overlapping epitopesare involved in α4β7-mediated adhesion to vascular cell adhesion molecule-1，mucosal adhesion molecule-1，fibronectin，and lymphocyte aggregation.JImmunol 1994；153：3847-61.

2.Butcher EC，Williams M，Youngman K，et al.Lymphocyte trafficking andregional immunity.Adv Immunol 1999；72：209-53.

3.Cepek KL，Parker CM，Madara JL，et al.Integrin αEβ7 mediates adhesionof T lymphocytes to epithelial cells.J Immunol 1993；150：3459-70.

4.Feagan BG，Greenberg GR，Wild G，et al.Treatment of ulcerative colitiswith a humanized antibody to the α4β7 integrin.N Engl J Med2005；352：2499-507.

5.Holzmann B，McIntyre BW，Weissman IL.Identification of a murinePeyer’s patch-specific lymphocyte homing receptor as an integrin moleculewith an α-chain homologous to human VLA-4-α.Cell 1989；56：37-46.

6.Hu MC，Crowe DT，Weissman IL，et al.Cloning and expression of mouseintegrin βp(β7)：a functional role in Peyer′s patch-specific lymphocyte homing.Proc Natl Acad Sci USA 1992；89：8254-8.

7.RoséJR，Williams MB，Rott LS，et al.Expression of the mucosal homingreceptor α₄β₇ correlates with the ability of CD8⁺memory T cells to clearrotavirus infection.J Virol 1998；72：726-30.

8.Rott LS，Briskin MJ，Andrew DP，et al. A fundamental subdivision ofcirculating lymphocytes defined by adhesion to mucosal addressin celladh

9.Rott LS，RoséJR，Bass D，et al.Expression of mucosal homing receptorα4β7 by circulating CD4⁺cells with memory for intestinal rotavirus.J ClinInvest 1997；100：204-8.

10.Sandborn WJ，Colombel JF，Enns R，et al.Natalizumab induction andmaintenance therapy for Crohn’s disease.N Engl J Med 2005；353：1912-25.

11.Williams MB，Butcher EC.Homing ofand memory T lymphocytesubsets to Peyer’s patches，lymph nodes，and spleen.J Immunol1997；159：1746-52.

12.Williams MB，Rose JR，Rott LS，et al.The memory B cell subsetresponsible for the secretory IgA response and protective humoral immunity torotavirus expresses the intestinal homing receptor，α4β7.J Immunol1998；161：4227-35.

实施例2

通过静脉内注射到猕猴中每周施用的rhuMAb β7(PRO145223)(具有23周恢复期)的四周先导试验安全性和药代动力学评估

摘要

rhuMAb β7(也称作PRO145223)是结合人类和猕猴(Macacafascicularis)中淋巴细胞上αEβ7和α4β7整联蛋白的人源化免疫球蛋白G1(IgG1)抗人β7抗体。认为表达αEβ7和α4β7整联蛋白的细胞在肠的炎性疾病，如溃疡性结肠炎(UC)和局限性回肠炎(CD)中具有重要作用。正研究rhuMAb β7作为具有炎性肠病如CD和UC的患者的潜在治疗剂。该研究的目标是评估对猕猴每周静脉内(IV)施用一次共四周后rhuMAbβ7的安全性、药代动力学(PK)和药效学(PD)效果，并表征在23周的恢复期内任何不利的药物相关效果的可逆性。猕猴组被四次给予每周5或25mg/kg的静脉内剂量的载体或者rhuMAb β7。来自每个剂量组的三只雄性和3只雌性动物在最后剂量后7天进行尸检并且在尸检前最后剂量后，观察来自载体和25mg/kg剂量组的剩余动物(2/性别/组)23周。

总之，四次每周IV剂量后rhuMAb β7的血清浓度时间图是二相性的，快速的最初分布期后接着是较慢的清除期。对猕猴给予四次每周IV推注5或25mg/kg rhuMAbβ7剂量后，第二次剂量后波谷血清浓度升高，只是此时检测到抗治疗抗体(ATA)。第一次剂量后从第0天到第7天(AUC_0-7/剂量)血清浓度时间图下的剂量归一化面积与5mg/kg和25mg/kg剂量组相似，提示rhuMAb β7在所研究的剂量范围下在猕猴中显示出剂量成比例的药代动力学。对于25mg/kg剂量组，与第一次剂量相比，最后剂量后，AUC_0-7和最大血清浓度(C_max)增加了约2倍。这些发现都提示对猕猴给予四次每周IV25mg/kg剂量后，存在rhuMAb β7的积累；然而，这种积累是对具有长半寿期的抗体在这些剂量下所预料中的。来自25mg/kg恢复动物的数据的代谢区分析估计到2.93mL/天/kg的缓慢清除和14.5天的相对长的终末半寿期。然而，4只猴子的3只具有可能促进rhuMAb β7的较快清除的ATA。

研究将外周血T细胞的饱和和循环β7⁺T细胞水平的升高作为PD标记。整联蛋白β7-受体占据测定法提示在对猕猴给予四次每周5或25mg/kg rhuMAb β7剂量的第一次剂量后，外周血T细胞亚型上β7受体被完全饱和。当血清浓度高于约110μg/mL时，维持了外周血T细胞上β7受体的占据，并且可用β7的检测与rhuMAb β7的血清浓度的降低相关。对猕猴给予四次每周25mg/kg的剂量后，CD45RA^-β7^高T细胞(表型相似于人类和小鼠中的肠归巢T细胞)相对于基线水平增加了约5倍。类似地，四次每周25mg/kg剂量后，CD45RA⁺β7^中T细胞(表型相似于人类幼稚T细胞)也增加了(相对于基线水平约2.5倍)。相反，CD45RA^-β7^低T细胞在整个研究中保持稳定。这些发现与rhuMAb β7的作用机理相一致，即，通过抑制α4β7与其配体的结合抑制β7阳性淋巴细胞向肠的归巢，其然后导致外周循环中这些细胞的积累。这些现象将在猕猴中的将来研究中进一步探索。

引言

rhuMAb β7(也称作PRO145223)是结合人类和非人灵长类中淋巴细胞上αEβ7和α4β7整联蛋白的人源化免疫球蛋白G1(IgG1)抗人β7抗体。rhuMAbβ7以0.07-0.1nM的亲和力(50％最大抑制浓度[IC₅₀])阻断α4β7与MadCAM-1，VCAM-1和纤连蛋白的相互作用，也以5nM的IC₅₀阻断E-钙粘蛋白与αEβ7的结合。认为表达αEβ7和α4β7整联蛋白的细胞在肠的炎性疾病如局限性回肠炎(CD)和溃疡性结肠炎(UC)中具有重要作用。正研究rhuMAbβ7作为炎性肠病如CD和UC的患者的潜在治疗剂。

目标

本研究的目标是评估对猕猴(Macaca fascicularis)每周一次静脉内(IV)施用共四周后，rhuMAb β7的安全性、药代动力学(PK)和药效学(PD)效果，和表征在23周恢复期内任何不利的检品相关效果的可逆性。该研究的目的是报告PK和流式细胞术分析的结果。

材料和方法

测试材料

rhuMAb β7(PRO145223)，批号M3-TOX132，由Genentech提供，其为澄清到稍微乳白色、无色到稍微黄色的液体，浓度为20mg/mL(4.5mL/瓶)。rhuMAbβ7载体，批号M3-TOX133，也作为澄清到稍微乳白色、无色到稍微黄色的液体提供(10.5mL/瓶)。在用于研究前，将检品保存在冰箱设备中以保持2℃-8℃的温度范围。

物种

26只检品-幼稚猕猴从SNBL USA stock colony得到。动物在治疗开始时重2-6kg并且为2-5岁。动物在开始治疗前适应至少1周。仅仅看起来健康并且没有明显异常的动物用于研究。

研究设计

将动物随机化到三组的一组中并且接受四次每周静脉内剂量的测试物质。组1中的动物(5只雄性和5只雌性)接受rhuMAb β7载体。组2(3只雄性和3只雌性)和组3(5只雄性和5只雌性)中的动物分别接受5和25mg/kg的rhuMAb β7。来自每组的3只雄性和3只雌性在最后剂量后7天进行终点尸检。来自施用载体或25mg/kg rhuMAb β7的组的2只雄性和2只雌性接着进行约23周的恢复期，然后进行恢复尸检。研究设计在表2_1中概述。

表2_1

研究设计

Conc.＝浓度；IV＝静脉内.

注释：来自每组的3只雄性和3只雌性被指定为终点尸检动物。来自组1和3的剩余动物被指定为恢复尸检动物。

^a基于最近体重计算剂量体积。

剂量制备

每组的检品由Genentech以适当浓度提供。

剂量施用

基于在药物施用当天记录的体重计算个体剂量体积。动物经由隐静脉静脉内给予测试物质。剂量施用后，但是在从动物取出针头前，立即用约1mL 0.9％NaCl冲洗给药装置。

血样收集

通过隐静脉、股静脉或头静脉用针和注射器收集所有血样。

PK分析

从每只动物收集血液(约1.2mL)并在下面的时间点收集血清用于PK分析：

·在研究第1天预剂量和剂量后15分钟和6、24和72小时

·研究第8和15天预剂量

·研究第22天预剂量和最后一次剂量后15分钟和6、24和72小时

·研究第36，43，50，57，64，71，78，85，92，99，106，113，120，127，134，141，148，155，162，169，176，和183天

·结束和恢复尸检当天(研究第29和191天)

然而，对于PK分析，将时间点转换为在第0天开始并且在该报告中称作第0，0.0104，0.25，1，3，7，14，21，21.0104，21.25，22，24，28，35，42，49，56，63，70，77，84，91，98，105，112，119，126，133，140，147，154，161，168，175，182，和190天。

抗治疗抗体分析

用于PK分析的相同血清样品用于抗治疗抗体(ATA)分析。在下面的时间点分析ATA应答：

·在研究第1、8、15和22天预剂量

·在研究第50，71，92，113，134，155，和176天

·在结束和恢复尸检当天(研究第29和191天)

然而，对于ATA分析，将时间点转换为在第0天开始并且在该报告中称作第0，7，14，21，28，49，70，91，112，133，154，175，和190天。

流式细胞术分析

对于总的淋巴细胞(B细胞、T细胞和自然杀伤[NK]细胞)流式细胞术测定法，在下面的时间点为每只动物收集血液(约1.5mL)：

·第8天(预剂量)

·第一天预剂量和第一次剂量后24小时

·第15天预剂量和第二次剂量后24小时

·第22天预剂量和第三次剂量后24小时

·第43，57，71，85，99，113，127，141，155，169，和183天

·结束和恢复尸检当天(研究第29和191天)

在下面的时间点从每只动物收集血液(约1.5mL)用于占据流式细胞术测定法：

·第一天预剂量和第一次剂量后24小时

·第15天预剂量和第二次剂量后24小时

·第22天预剂量和第三次剂量后24小时

·第57，85，99，113，127，141，155，169，和183天

·结束和恢复尸检当天(研究第29和191天)

对于总的占据的和未占据的表达β7的CD4⁺和CD8⁺T-细胞分析，在下面的时间点从每只动物收集血液(约1.5mL)：

·第一天预剂量和第一次剂量后24小时

·第15天预剂量和第二次剂量后24小时

·第22天预剂量和第三次剂量后24小时

·第57，99，113，127，141，155，169，和183天

·结束和恢复尸检当天(研究第29和191天)

血样处理

PK和ATA分析

收集后，立即将样品转移到血清分离管中并允许在室温下凝固30-80分钟。样品在2000μg下室温下离心15分钟。收集血清并转移到经标记的1.5-mL Eppendorf管中。

流式细胞术分析

收集后，根据研究方案立即将用于流式细胞术分析的全血样品转移到SNBL的肝素钠化的管中，并运输到Genentech用于分析。将样品立即置于湿润冰上或者保存在2℃到8℃的温度范围下直到通过流式细胞术分析。

测定法

血清浓度

通过定量ELISA分析血清样品以测量总的rhuMAb β7水平。对于所有的样品，该测定法根据Notebook 47886-27草案测定法开发概要和Notebook 47886-22草案标准操作程序(SOP)运行。首先，将96孔微量滴定板用预先用猴血清吸收的绵羊抗人IgG重链和轻链(H&L)包被。该抗体从Binding Site(Birmingham，UK；Catalog AU003.CUS01；批号086001)得到并且在0.05M碳酸钠(pH 9.6)中稀释到1μg/mL。重组人rhuMAb β7(批号46994-8，Genentech生产)用作标准。标准曲线为0.781到50.0ng/mL的范围。抗体用于确定标准曲线，基质对照，并且样品在测定稀释剂(磷酸缓冲盐水[PBS]，0.5％，牛血清白蛋白[BSA]，0.05％聚山梨醇20，0.05％Proclin 300，0.25％CHAPS缓冲液，5mM乙二胺四乙酸[EDTA]，0.35M NaCl)中稀释。将样品稀释至少20倍。辣根过氧化物酶(HRP)标记的绵羊抗人IgG(H&L，预先用猴血清吸收)得自Binding Site(CatalogCUS1684.H；批号11245)并且用作缀合物。使用四甲基联苯胺过氧化物酶作为HRP的底物产生信号。收集对照和样品的数据用于稀释；将每次稀释的值平均。基于1ng/mL的测定极限和1/20的最小稀释度将纯净猕猴血清的最小可定量浓度测定为20ng/mL。

测定ATA应答

通过桥接电化学发光测定法来测定针对rhuMAb β7的抗体应答的水平来分析来自猕猴的血清样品。该测定法根据Notebook 47886-48草案测定开发概述为针对rhuMAb β7的抗体运行。针对人IgG(H&L，用猴血清预先吸收)的多克隆抗体得自The Binding Site并且用作替代品阳性对照。将对照和样品稀释到样品稀释液(HEPES缓冲液，2％鱼明胶，0.05％聚山梨醇20，0.05 ProClin300，0.15M NaCl，10％胎牛血清)中并加入到96孔圆底聚丙烯板中。将样品稀释至少10倍。生物素化的rhuMAb β7和BV-标记的rhuMAb β7用作缀合物。第二天，将链霉抗生物素蛋白包被的DynabeadsM280(Invitrogen Corp.；Carlsbad，CA)用测定稀释剂(HEPES buffer，2％鱼明胶，0.5％聚山梨醇20，0.05％ProClin300，0.15M NaCl)稀释并加入平板中。以电化学发光单位测量测定法应答。基于阴性对照值设置割点，并用于计算样品和阳性对照的滴定度。rhuMAb β7抗体测定法的最小报告滴定度为1.0。

流式细胞术分析

外周血中总的表达β7的CD4⁺和CD8⁺T-细胞亚型

使用9D8——一种靶定不同于rhuMAb β7所靶定的表位的抗β7抗体，测量总的表达β7的CD4⁺和CD8⁺T细胞。用于全血样品分析的小组配置在表2-2中给出。

表2-2全血小组配置

FSC＝前向散射；SA＝链霉抗生物素蛋白；SSC＝侧向散射，

^a在加入SA-APC前首先温育9D8-生物素

对于所有全血样品，根据程序48038-29和48038-84进行流式细胞术测定。将每个样品的管2和3首先与饱和浓度的9D8-生物素温育，9D8-生物素是一种在rhuMAbβ7存在下结合β7的抗β7抗体。手工准备仪器装置对照管(同种型对照和单一染料)和测定管(1、2和3号)。首次温育后，将2mL裂解液加入裂解的红细胞，接着进行一轮细胞洗涤。对于第二次温育，将样品(管2和3)与饱和浓度的针对CD4(克隆M-T477)，CD8(克隆SK1)，CD45RA(克隆5H9)，和CD49d(克隆9F10)的荧光缀合的单克隆抗体温育，已知所述抗体与猕猴白细胞交叉反应，或者与同种型对照抗体温育(管1)。也向管1、2和3加入链霉抗生物素蛋白-APC(SA-APC)以检测生物素化的抗体。两个温育都在黑暗中湿润冰上进行60±5分钟。进行一系列洗涤步骤，最后一步是将细胞重悬浮在固定缓冲液中。将样品在2℃到4℃保持最少30分钟并在同一天获取。

在序列号为E3982的FACSCalibur^TM(BD Biosciences；San Jose，CA)上进行流式细胞术获取。用前向散射(FSC)/侧向散射(SSC)图获取25000个淋巴细胞事件。数据分析是基于FSC/SSC门控的淋巴细胞，并且取决于混合物组合，基于CD4⁺/SSC^低-或CD8⁺/SSC^低-门控的T细胞，使用CellQuestPro软件(BD CellQuest Pro，版本5.2)。产生流式细胞术图以建立每种细胞表面标记阳性细胞的分数。

将β7亚群作为门控T细胞的百分比分析，并且单独地，作为几何平均荧光强度(GMFI)分析。对于每个时间点的每个样品，通过将每个群体的GMFI乘以用SpheroTech Beads标准产生的标准曲线计算等同可溶荧光的分子(MOEF)。在整个研究中监测表达CD49d⁺9D8^inf，CD45RA^-9D8^高，CD45RA^-9D8^低，CD45RA⁺，和CD45RA^-的CD4⁺或CD8⁺T-淋巴细胞群体门控细胞的GMFI和百分比，以检查药物在每个亚型上的效果。对于每个淋巴细胞亚型在每个时间点的每个样品，基于每μL SNBL提供的外周血的淋巴细胞计数计算绝对细胞数。

将β7亚群作为门控T细胞的百分比分析，并且单独地，作为几何平均荧光强度(GMFI)分析。对于每个时间点的每个样品，通过将每个群体的GMFI乘以用SpheroTech Beads标准产生的标准曲线计算等同可溶荧光的分子(MOEF)。在整个研究中监测表达CD49d⁺9D8^inf，CD45RA^-9D8^高，CD45RA^-9D8^低，CD45RA⁺，和CD45RA^-的CD4⁺或CD8⁺T-淋巴细胞群体门控细胞的GMFI和百分比，以检查药物在每个亚型上的效果。对于每个淋巴细胞亚型在每个时间点的每个样品，基于每μL SNBL提供的外周血的淋巴细胞计数计算绝对细胞数。

外周血中CD4⁺和CD8⁺T-细胞亚型上β7的占据

在表2-3中给出了用于全血样品分析的小组配置。

表2-3全血小组配置

根据实验室手册47237第48页的方案对样品染色，使用饱和浓度的下面的抗体缀合物：缀合到FITC的CD4(克隆M-T477)，缀合到藻红蛋白(PE)的CD45RA(克隆5H9)，缀合到PerCP的CD8(克隆SK1)，和缀合到Alexa-647的或缀合到Alexa 647的rhuMAb β7。对于管3，将检品rhuMAb β7(PRO145223)稀释到饱和浓度(10μg/mL)并加入到血样中。

所有温育都在冰上黑暗中进行30±5分钟。染色后，裂解血红细胞，洗涤样品并用Lyse Wash Assistant(BD Biosciences)在固定缓冲液中重悬浮细胞。用BD FACSCalibur(BD Biosciences)上的前向散射/侧向散射门获取25000个门控的淋巴细胞事件。

从SSC/FSC点图鉴定淋巴细胞。然后分别使用SSC/CD4FITC图和SSC/CD8 PerCP图鉴定CD4⁺和CD8⁺细胞。管1用作门控的阴性对照。为具有和没有饱和浓度的rhuMAb β7的管鉴定显示出β7^高/CD45RA^-，β7^低/CD45RA^-的淋巴细胞和β7^中/CD45RA⁺细胞。记录门控细胞的GMFI和百分比并且使用APC通道的斜率将GMFI表达为MOEF，其中FL4通道的GMFI斜率。

所有温育在冰上黑暗中进行30±5分钟。染色后，裂解血红细胞，洗涤样品并用Lyse Wash Assistant(BD Biosciences)在固定缓冲液中重悬浮细胞。用BD FACSCalibur(BD Biosciences)上的前向散射/侧向散射门获取25000个门控的淋巴细胞事件。

从SSC/FSC点图鉴定淋巴细胞。然后分别使用SSC/CD4FITC图和SSC/CD8 PerCP图鉴定CD4⁺和CD8⁺细胞。管1用作门控的阴性对照。为具有和没有饱和浓度的rhuMAb β7的管鉴定显示出β7^高/CD45RA^-，β7^低/CD45RA^-的淋巴细胞和β7^中/CD45RA⁺细胞。记录门控细胞的GMFI和百分比并且使用APC通道的斜率将GMFI表达为MOEF，其中：FL4通道的GMFI斜率。

外周血淋巴细胞亚群(总的B细胞，T细胞，和NK细胞)的流式细胞术分析

在表2-4中给出了用于分析全血样品的小组配置。

表2-4全血小组配置

FSC＝前向散射；SSC＝侧向散射。

对于所有全血样品，根据程序48038-36进行流式细胞术测定。将样品与饱和浓度的荧光缀合的单克隆抗体CD4(克隆M-T477)，CD45(克隆TU116)，CD3(克隆SP34-2)，和CD20(克隆L27)(已知它们与猕猴白细胞反应)，以及合适的同种型对照温育。手工准备仪器装置对照管和测定管。在黑暗中室温下进行所有温育30±5分钟。

PK数据分析

标样收集时间用于数据分析，具有与时间表的最小偏差。使用MS(Microsoft Corp.；Redmond，WA)软件为每个血清样品计算rhuMAbβ7的平均(±SD)浓度，并使用KaleidaGraph^TM(Synergy Software；Reading，PA)将数据点作图。除了预剂量时间点，将测定不值得报告的(LTR)的血清浓度作为缺少处理并且不用于PK数据的显示或分析中。对于PK数据计算，将研究第1天转换为PK第0天以指出给药的开始(见血样收集)。

非区划PK分析

使用静脉内推注输入模型(模型201，WinNonlin-Pro，版本5.0.1；Pharsight Corporation；Mountain View，CA)分析第一次剂量后直到第7天，在5mg/kg剂量组中来自每只动物的血清浓度-时间数据。没有分析5mg/kg剂量组中最后一次剂量后的数据，因为在第二次或第三次剂量后，ATA影响了血清浓度。也使用静脉内推注输入模型(模型201)分析了第一次和最后一次剂量后7天内25mg/kg剂量组中每只动物的血清浓度-时间数据。用下面的方法估计特定PK参数：

C_max：IV推注剂量后最大血清浓度。

AUC_0-7：使用线性梯形法计算从时间＝0到PD第7天的血清浓度-时间曲线下面积。

AUC_21-28：使用线性梯形法计算从时间＝PK第21天到PD第28天的血清浓度-时间曲线下面积。

AUC_全部：使用线性梯形法计算从时间＝0到来自恢复动物数据的最后PK日的血清浓度-时间曲线下面积。

V₁：向中央隔室的分布体积(剂量/C_max)。

两隔室PK分析

用具有IV推注输入、第一级消除和微速率常数的两隔室模型(模型7，WinNonlin Pro，版本5.0.1)分析来自25mg/kg剂量组中4只恢复动物的平均浓度-时间数据。用下面的建模选项和方法估计特定PK参数：

通过WinNonlin图解确定A，B，α，和β的最初估值。

加权分析使用权重＝-2。

使用Nelder-Mead最小化算法。

模型选择是基于通过视力检查和通过Akaike’s Information Criterion(AIC)的模型间比较确定的拟合优度。

CL：清除(剂量/AUC)

t_1/2，β：β期的半寿期；终末半寿期(ln[2]/β)

V_ss：稳态的分布体积(MRT_inf·CL)

在表7中提供了与α和β期(分别为A和B)、宏速率常数(α和β)，和隔室间微速率常数(k₁₀，k₁₂，和k₂₁)相关的0时间截距。

流式细胞术分析

为载体和rhuMAb β7处理的动物计算在研究中的每个时间点上，CD4和CD8T-细胞亚型(CD45RA^-β7^高，CD45RA^-β7^低，和CD45RA⁺β7^中)和CD4⁺CD3⁺T细胞，CD4^-CD3⁺(CD8)T细胞，CD3^-CD20^-(NK)细胞，和CD20⁺B细胞每一种的绝对计数(作为基线的百分比)。为每个治疗组(载体，5mg/kg rhuMAb β7，和25mg/kg rhuMAb β7)平均各绝对计数(作为基线的百分比)以计算组平均值。通过流式细胞术分析测定的值的定义如下：

绝对计数：每个各自淋巴细胞亚型的绝对数；等于绝对淋巴细胞计数(从血液学测量得到的值，表示为每微升外周血的淋巴细胞)乘以每个亚型的门控淋巴细胞百分比(从流式细胞术分析得到)。

绝对计数(％BL)：作为基线绝对计数百分比的给药前获得的绝对计数；计算为绝对计数除以预剂量绝对计数的平均值。

MOEF：等同荧光的分子；使用FL4通道的斜率乘以几何平均荧光强度计算。

MOEF(％预剂量)：作为给药前MOEF百分比的MOEF；计算为给药后各时间点的MOEF除以给药前平均MOEF。

结果和讨论

PK数据分析

对猕猴给药四次每周IV推注5mg/kg rhuMAb β7的剂量后，第一次剂量后15分钟平均血清浓度为173μg/mL(范围：125-207μg/mL)，相比，最后一次剂量后15分钟平均血清浓度为196μg/mL(范围：70.9-326μg/mL)。第二次、第三次和第四次预剂量平均波谷血清浓度分别为56.5μg/mL(范围：28.7-77.1μg/mL)，35.1μg/mL(范围：0.0401-97.1μg/mL)，和60.2g/mL(范围：4.29-137μg/mL)。第二次剂量后波谷血清浓度的变异性可以通过ATA的存在来解释，因为该5mg/kg剂量组中所有6只猴子都产生了在第二次剂量后检测到的ATA应答；1只猴子在第一次剂量的rhuMAbβ7前具有阳性抗人抗体效价。具有最低波谷浓度的4只猴子具有最高的ATA效价。

对猕猴四次每周IV推注25mg/kg rhuMAb β7的剂量后，第一次剂量后15分钟平均血清浓度为917μg/mL(范围：740-1070μg/mL)，相比，最后一次剂量后15分钟平均血清浓度为1690μg/mL(范围：1130-2250μg/mL)。第二次、第三次和第四次预剂量平均波谷血清浓度分别为325μg/mL(范围：243-677g/mL)，535μg/mL(范围：240-709μg/mL)，和594g/mL(范围：194-776μg/mL)。在25mg/kg剂量水平下也存在ATA应答，该剂量组中10只猴子的5只(4只恢复猴子的3只)发生了ATA应答，其与rhuMAb β7的降低的血清浓度相关。在一些猴子中第二次剂量后检测到ATA；该组中1只猴子在第一次rhuMAb β7预剂量也具有阳性抗人抗体效价。

在图23中给出了四次每周5或25mg/kg静脉内剂量后，在研究的活着部分期间的28天内的血清浓度。通过非区划分析比较了活着部分(直到最后剂量后7天)中的血清浓度，因为在用于比较的5mg/kg剂量组中没有恢复群体。结果表明第一次剂量后从第0天到第7天(AUC_0-7/剂量)血清浓度-时间图下的剂量归一化面积与5mg/kg和25mg/kg剂量组(分别是113±17.0和119±15.8天μg/mL/mg/kg；见表5)相似。这表明rhuMAbβ7在所研究的剂量范围内在猕猴中显示出与剂量成比例的药代动力学。在5或25mg/kg的第一次剂量后，在中心隔室(V₁)中的分布体积也是相似的(分别为29.0±4.30和27.7±3.54mL/kg，见表5)。施用25mg/kg后，最后剂量后AUC_21-28比第一次剂量后AUC_0-7大2倍(分别为7024±1958和2987±394天μg/mL；见表2-5)。最后一次剂量后与第一次剂量后相比，施用25mg/kg后C_max也增加了约2倍(分别为1710±302和916±111μg/mL；见表5)。这些发现都提示对猕猴施用四次每周25mg/kg IV剂量后存在rhuMAb β7的积累；然而，此类积累是在这些剂量下具有长半寿期的抗体中所预期的。在5mg/kg剂量组中最后剂量后的数据不能比较，因为第二次剂量后，ATA影响了rhuMAb β7CL。

将来自四次每周25mg/kg剂量后23周的恢复期的4只猴子的平均数据拟合二室模型(见图24)。最后剂量后血清浓度-时间图是两相的，快速的初始分布期后是较慢的清除期。在四次每周IV推注25mg/kg rhuMAbβ7剂量后，隔室分析估计了2.93mL/天/kg的慢CL和14.5天的相对长的t_1/2，β(见表2-6)。然而，4只猴子中的3只具有ATA，其可能是归因于rhuMAb β7的清除。估计V_ss为56.9mL/kg，其提示rhuMAb β7大部分保留在血管腔隙中(见表2-6)。四次每周IV25mg/kg剂量后，通过来自恢复动物的数据的非隔室分析，总的暴露(AUC_all)估计为33,400天·μg/mL(见表2-6)。

表2-5对猕猴给予首次或最后一次IV推注rhuMAbβ7剂量后个体数据(平均值±SD)的非隔室PK参数

AUC_0-7＝从时间＝0到PK第7天血清浓度-时间曲线下的面积；

AUC_21-28＝从时间＝PK第21天到PK第28天血清浓度-时间曲线下的面积；

C_max＝IV推注剂量后最大血清浓度；IV＝静脉内；NA＝不适用；PK＝药物代谢动力学；V₁＝分布到中心隔室的体积(剂量/C_max)。

表2-6对猕猴给予四次每周IV推注剂量25mg/kg rhuMAbβ7后来自四只恢复动物的平均值的两隔室PK参数(％CV)

AUC＝血清浓度-时间曲线下的面积；CL＝清除；IV＝静脉内；

PK＝药物代谢动力学；t_1/2，β＝β半寿期；V_ss＝作为稳态的分布体积。

表2-7对猕猴给予四次每周IV推注剂量25mg/kg rhuMAb β7后来自四只恢复动物的平均值(±SD)数据的两隔室模型参数(％CV)

A，B＝分别与α和β相相关的0-时间截距；α，β＝宏速率常数α和β；k₁₀＝从中央隔室的清除速率；k₁₂，k₂₁＝隔室间速率常数。

流式细胞术分析(免疫表型和药效学)

在图35-38中给出了外周血CD4和CD8T细胞亚型的组平均(±SD)计数。

图39-40显示了在个体猕猴中rhuMAbβ7的血清浓度和可用的表达β7的外周血β7^高CD45RA^-T细胞和β7^高CD45RA^-T细胞之间的关系。在附录E中给出了个体和组平均(±SD)绝对计数、β7表达和CD4和CD8T细胞亚型上可用的β7表达。

通过流式细胞术分析了该研究中β7受体的占据作为定义为或CD45RA^-的外周血CD4或CD8T细胞亚型上可用的β7。与人类中幼稚的和记忆/效应T细胞在表型上相似的CD45RA⁺和CD45RA^-T细胞分别表达中和高水平的β7(T细胞亚型的代表性FACS点图见图25)。CD45RA^-β7^高CD4T细胞优先归巢到肠位点。来自该测定法的数据表明在5和25mg/kg下第一次剂量后β7的饱和，和游离β7的返回，其与rhuMAbβ7的血清浓度的降低相关(见上面PK/PD关系部分中的图32-33)。该饱和数据提示高于1-10μg/mL的rhuMAbβ7血清浓度将可能保持外周血T细胞上完全的β7受体饱和。

通过流式细胞术，使用用于检测β7的非竞争性抗体检查了施用rhuMAbβ7后外周血T细胞上的总β7表达水平。没有证据证明5或25mg/kg的IV剂量后猕猴中外周血T细胞上β7的下调(数据未显示)。还使用用于检测β7的相同的非竞争性抗体检查了施用rhuMAbβ7后外周血中总的β7表达细胞。

四次每周25mg/kg剂量后，CD45RA^-β7^高CD4⁺T细胞(表型类似于人和小鼠中的肠归巢CD4⁺细胞)相对于基线水平增加了约5倍(见图26)。类似地，四次每周25mg/kg剂量后，CD45RA⁺β7^中CD4⁺T细胞(表型类似于人幼稚T细胞)也增加了(相对于基线水平约2.5倍)(见图27)。载体-对照动物的CD45RA^-β7^低T细胞或T细胞亚型中没有实质改变(见图26和27)。用CD45RA^-β7^高和CD45RA⁺β7^中CD8⁺T细胞观察到相似结果。这些结果与表达β7的淋巴细胞向肠的运输的抑制一致，其是该治疗抗体的所建议的作用机理。

为支持该假说，外周血中CD45RA^-β7^高T细胞的增加的百分比与rhuMAbβ7对血液T细胞上β7受体的占据相关。类似地，rhuMAbβ7对β7占据的损失(可用β7受体的检测)与外周血中CD45RA^-β7^高T细胞基线的返回相关。例如，在研究的第99天，动物24和25的血液中CD45RA^-β7^高CD4⁺T细胞的百分比降低到基线水平(见图6)。该降低与这些具体的猴子中在研究第99天时rhuMAbβ7对β7的占据的损失相关(见上面PK/PD关系章节中的图32和33)。相反，在研究第99天，动物23和26显示出外周血T细胞上饱和的β7受体(见图32和33)，并且血液中CD45RA^-β7^高CD4⁺T细胞的绝对数目与预剂量水平相比保持升高(见图28)。用CD8⁺T细胞亚型观察到相似结果。从而，β7受体的占据与血液中CD45RA^-β7^高CD4⁺T细胞的增加的百分比相关，与向肠位点运输的抑制相一致。CD45RA^-和CD45RA⁺外周血T细胞亚型中的增加可能促进下面所述的循环淋巴细胞中所观察的增加。

每周施用25mg/kg rhuMAbβ7诱导了猕猴中循环淋巴细胞的轻微增加，其在第一次剂量后是明显的并且在最后剂量后似乎增加。25mg/kg剂量组中猕猴具有在基线上约2.2倍的平均增加，相比，载体对照组的为1.3倍的平均增加(见图29)。随着rhuMAbβ7的血清浓度降低，25mg/kg剂量组中绝对淋巴数返回到预剂量或载体水平，这是与rhuMAbβ7对淋巴细胞β7受体占据的损失相关的一种效果。因此，该研究中明显的循环淋巴细胞的轻微增加似乎是暂时的，与rhuMAbβ7的施用相关，并且最可能是由于如上述的表达β7的淋巴细胞向肠的运输的抑制。外周血淋巴细胞数的增加在T细胞和B细胞中是明显的，然而与B细胞相比，T细胞中的增加是更显著的并且显示出增加的持续时间(见图30和31)。

PK/PD相关性

将整联蛋白β-受体饱和和循环β7⁺T细胞的水平用作PD标记。

对猕猴施用四次每周5或25mg/kg rhuMAbβ7剂量后，没有观察到外周血T细胞上β7表达的下调证据。然而，5或25mg/kg rhuMAbβ7的第一次剂量后观察到外周血T细胞上β7的饱和，并且减饱和(可用β7的检测)似乎与低于约10μg/mL的rhuMAbβ7水平的降低相关(分别地，对于来自动物23-26的图谱见图32A-D，和图33)。施用rhuMAbβ7后也观察到外周血CD45RA^-β7^hi CD4T细胞上β7的占据和这些细胞的升高的绝对数目之间的相关性(见图34A-D)。这些发现提示rhuMAbβ7的高于1-10μg/mL的血清浓度保持了肠归巢CD4⁺细胞上β7的占据并且阻断这些T细胞向肠的归巢，其又可以引起外周中这些细胞的积累。

结论

对猕猴施用四次每周5或25mg/kg rhuMAb β7的IV推注剂量后，第二次剂量后波谷血清浓度增加，只是此时形成ATA。第一次剂量后AUC_0-7/剂量对于5mg/kg和25mg/kg剂量组是相似的，提示rhuMAb β7在所研究的剂量范围下在猕猴中显示出剂量成比例的药代动力学。对于25mg/kg剂量组，与第一次剂量相比，最后剂量后AUC_0-7和C_max增加了约2倍。如所预期的，这些发现提示对猕猴施用四次每周25mg/kg的IV剂量后发生了rhuMAb β7的积累。来自25mg/kg恢复动物的数据的隔室分析估计出2.93mL/天/kg的慢CL和14.5天的相对长t_1/2，β。

整联蛋白β7受体占据测定法提示对猕猴施用四次每周5或25mg/kgrhuMAbβ7剂量的第一次施用后，外周血T-细胞亚型上β7受体被完全饱和。可用β7的检测与rhuMAbβ7的血清浓度的降低相关，并且提示高于约10μg/mL的血清浓度将保持外周血T细胞上β7受体的占据。对猕猴给予四次每周25mg/kg剂量后，CD45RA^-β7^高T细胞(表型类似于人和小鼠中肠归巢T细胞)在基线水平上增加了约5倍。类似地，在四次每周25mg/kg剂量后CD45RA⁺β7^中T细胞(表型类似于人幼稚T细胞)也增加了(在基线水平上约2.5倍)。这些发现与rhuMAbβ7的作用机理相一致——即，通过抑制α4β7结合其配体而抑制了β7阳性淋巴细胞向肠的运输，其然后导致这些细胞在外周循环中的积累。这些现象将在猕猴中的将来研究中进一步探索。

附录2F研究概述表