TT1基因在提高植物和微生物抗重金属能力中的用途

摘要

本发明属于生物技术领域，具体涉及TT1基因在提高植物和微生物抗重金属能力中的用途。本发明要解决的技术问题是为提高植物和微生物抗重金属能力的转基因技术领域提供一种新的有效选择。本发明解决技术问题的技术方案是提供了TT1基因在提高植物和微生物抗重金属能力方面的用途，经实验证明转入了TT1基因并过表达的植物和微生物对重金属离子浓度高的逆境表现出了良好的抗性。本发明培育出抗重金属植物和微生物的方法也简便而有效，在本领域有很好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及TT1基因在提高植物和微生物抗重金属能力中的用途。

技术背景

土壤是人类赖以生存的主要资源之一，它是生态环境的重要组成部分，也是地球化学循环的储存库，对环境变化具有高度的敏感性，所以土壤污染是环境污染的重要环节。近年来，随着现代工业的发展和农业生产的现代化，工业三废的排放，农业化肥与有机农药的大量施用，生活污水的不断排放，城市污泥，矿床的开采等大量的污染物进入土壤环境，土壤污染日益严重。其中重金属污染是当今面积最广，危害最大的环境问题之一。

重金属是在工业生产和生物学效应方面均具有重要意义的一大类元素，在化学概念上，还没有明确的的定义，但是目前还是有了广为接受的概念，那就是元素的密度大于6g/cm3，具有金属性质(延展性、导电性、稳定性、配位特性等，且原子数目大于20的元素)。环境污染方面所涉及的重金属主要是指生物毒性显著的汞、镉、铅、铬以及类金属砷，还包括具有毒性的重金属锌、铜、钴、镍、锡、钒等。

当土壤中的重金属含量积累到一定程度，会对土壤植物系统产生毒害作用，导致土壤退化、农作物的产量和品质下降，每年因重金属污染带来的粮食减产达1000多万吨，被重金属污染的粮食每年达1200万吨，直接年经济损失在200多亿元。另外，重金属可以通过植物的吸附作用进入植物体内，另外还可以通过径流和淋洗等作用污染地表水和地下水，最终能通过接触和食物链等途径危害人们的生命健康。由于重金属污染毒性机制和生物效应的复杂性，重金属污染一直是被当做研究的热点。因此，土壤重金属污染的治理对于环境质量的改善十分重要，土壤重金属污染的修复也是环境可持续发展的必然要求。

目前，治理土壤重金属污染的途径主要有2种：一是利用物理的、化学的方法试图清除土壤或水体的重金属污染。二是利用植物、微生物自身，结合现代生物技术来治理污染。后者已成为环境科学的热点和前沿领域，该技术普遍被认为具有物理、化学修复方法所无法比拟的费用低廉、不破坏场地结构、不造成地下水二次污染、可以美化环境的作用、易为社会接受等优点，发展前途十分广阔。

植物修复技术：

1983年，Chaney提出利用超富集植物清除土壤重金属污染的思想，该思想于九十年代逐步被应用于锌、铜、镍、镉、砷等重金属污染土壤的修复。自此，植物修复研究逐渐发展成一门新兴的环境技术，即利用自然生长的或通过遗传工程培育的植物种植于污染环境中，通过植物系统及其根际微生物群落将污染物移除、挥发或转变的技术。

微生物修复技术：

土壤微生物作为地球化学物质循环和能量转换的主要参与者，土壤微生物对重金属等污染物胁迫的响应要比同一环境中的动物和植物更加灵敏。重金属污染的微生物修复是利用微生物的生物活性对重金属的亲合吸附或转化为低毒产物，从而降低重金属的污染程度。目前应用微生物的高效降解、转化能力在治理重金属污染方面已经取得了良好效果。

然而，利用植物、微生物修复技术还存在一定的局限性：超富集植物虽具有较强的重金属吸收能力，但植物种类少，通常植株矮小、生物量低、生长缓慢，因而修复效率低；另外，微生物对环境变化较为敏感，某些环境中物质会对微生物产生毒性，降解转化过程所涉及的生化反应受到抑制而影响处理效果。解决这些问题的根本途径在于研究这类生物的耐受重金属的分子机制，克隆各类重金属耐受的相关基因，通过基因工程手段获得可直接用于修复污染的转基因生物。在申请人之前递交的中国专利申请200810045667.8中记载了分离自油菜的新基因，命名为TT1。

综上可知，重金属污染已成为世界各国共同关注的问题。对于植物抗重金属机制的研究和抗重金属基因工程方面的工作已有表明通过生物技术手段，将抗重金属机制中相关基因导入植物体内得到抗重金属转基因植株将会成为植物抗重金属改良的一种新的育种途径，对于作物的生产和抗重金属种质的筛选具有重要的意义。但是目前本领域很少有可供选用的抗重金属基因。

发明内容

本发明要解决的技术问题是为提高植物和微生物抗重金属能力的转基因技术领域提供一种新的有效选择。

本发明解决该技术问题的技术方案是提供了TT1基因在提高植物或微生物抗重金属能力中的用途。

其中，上述TT1基因的核苷酸序列：

(1)：如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

或(2)：在(1)限定的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加至少一个核苷酸衍生所得的核苷酸序列，且与SEQ ID NO.1的序列编码功能相同或相似的多肽。也能提高植物或微生物的抗重金属能力。

本发明同时提供了TT1基因编码的多肽在提高植物或微生物的抗重金属能力中的用途。

上述TT1基因具有如下核苷酸序列：

(1)：如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

或(2)：在(1)限定的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加至少一个核苷酸衍生所得的核苷酸序列，且与SEQ ID NO.1的序列编码功能相同或相似的多肽。

本发明还提供了一种培育具有更强抗重金属能力的植物或微生物的方法。该方法包括以下步骤：

(1)将TT1基因可操作地连于载体上的表达调控序列后，形成所述TT1基因的重组载体；

(2)将步骤(1)中的重组载体转入植物细胞或微生物中；

(3)经筛选获得转化细胞，然后将转化细胞培育成转基因抗重金属植株或抗重金属微生物株系及其后代，所述植物的后代包括植物种子及植物组织。

其中，上述植物可为一般的各种农作物，如常见禾本科或十字花科植物。

其中，上述微生物可为一般的各种微生物，如大肠杆菌或酵母菌。

本发明中所述的TT1基因，其基本核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，该基因来源于十字花科(Brassicaceae，也名Cruciferae)中芥属(Brassica)的植物油菜(Brassicanapus)。

在本发明中，“在SEQ ID NO.1中的核苷酸序列经过取代、缺失或添加至少一个核苷酸衍生序列”的TT1基因序列一般是指编码具有SEQ ID NO.1所编码的蛋白活性的多肽的核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指所述序列中有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.1同源性低至约89％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.1所述的序列。另外，“在SEQ ID NO.1中的核苷酸序列经过取代、缺失或添加至少一个核苷酸衍生序列”的含义还包括能在中度严谨条件下，更佳的在高度严谨条件下与SEQ ID NO.1核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ IDNO.1中的核苷酸序列的同源性至少80％，较佳地至少89％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。在本发明中的相同功能是指提高植物或微生物的抗重金属能力。

该术语还包括能编码具有与天然的SEQ ID NO.2相同功能的蛋白的SEQ ID NO.1中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1～90个，较佳地1～60个，更佳地1～20个，最佳地1～10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。比如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，其编码的多肽也能提高植物或微生物的抗重金属能力。

本发明所述重组载体，是将TT1基因插入到载体中获得，上述载体可选用本领域已知的各种载体，尤其是真核表达载体(如pBI121或pCAMBIA2301)。本发明用上述重组载体转化宿主植物细胞或微生物细胞，筛选获得转化细胞。然后将转化细胞培育成转基因抗重金属植株或抗重金属微生物株系及其后代，所述植物后代包括植物种子及植物组织。

本发明中所述的“可操作地连于”表示如下情况：即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。

本发明的有益效果在于：本发明提供了TT1基因在提高植物和微生物抗重金属能力方面的用途，在本发明的实施例中也通过实验证明转入了TT1基因并过表达的植物和微生物对重金属的抵抗能力有了显著的提高。本发明培育出抗重金属植物和微生物的方法也简便而有效，为提高植物和微生物抗的重金属能力提供了新的有效选择，具有好的应用前景。

附图说明

图1为TT1基因过量表达甘蓝型油菜的检测结果，1、2、3、4为TT1基因过量表达甘蓝型油菜，M：marker。

图2为转TT1基因大肠杆菌抗重金属实验结果，横坐标为时间，纵坐标为OD600值。

具体实施方式

下面通过实施例并结合附图，进一步说明而不限定本发明。

下述实施例中，凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，例如Sambrook，Russell的分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。下述实施例中，所用农杆菌(Agrobacterium tumefaciensp)采用章鱼碱型菌系的LBA4404菌株；大肠杆菌(E.coli)采用大肠杆菌JM109菌株、BL21菌株，菌株均购自于Qiagen公司。载体pBI121、pET28均购自于Clontech公司。其余化学实际均为市售分析纯。下述实施例中，“SEQ IDNO：1”单独出现时，本领域技术人员可理解1其为“SEQ ID NO：1所示核苷酸序列”的简称

实施例一、TT1基因的克隆及获取

以油菜中的atp6(genebank gi：89279377)基因为诱饵蛋白，根据酵母双杂交方法(见Clontech公司所公开的资料)，筛选到油菜中的一个EST序列(SEQ ID NO：2所示)，再根据这段筛选到的序列，通过5’RACE(见Takara公司所公开的资料)的方法获得本发明所述提高植物抗重金属能力的基因，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。根据SEQ IDNO.1所示核苷酸序列设计引物，

上游引物(SEQ ID NO.5)：5’-ATGTCGGATGATTTGAGTTTATG-3’；

下游引物(SEQ ID NO.6)：5’-TCAGACTGGTGTTGGGTTGGATAT-3’。

然后经PCR从油菜cDNA中扩增SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。对PCR产物纯化(见Qiagen公司所公开的PCR产物纯化资料)，经测序验证，得到SEQ ID NO.1的基因序列。

实施例二、转TT1基因油菜的制备及其对重金属抗性的测定

1、目的基因过量表达重组质粒构建

根据SEQ ID NO：1所示核苷酸序列设计引物，

上游引物(SEQ ID NO.7)：5’-CGC GGATCCATGTCGGATGATTTGAGTTTATG-3’；

下游引物(SEQ ID NO.8)：5’-CCGGAGC TCTCAGACTGGTGTTGGGTTGGATAT-3’。

经PCR，从油菜cDNA中扩增完整的SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，对PCR产物纯化(见Qiagen公司所公开的资料)，然后用BamH1与Sac1酶切，胶回收，与载体pBI121连接(连接位点：BamH1与Sac1)，获含SEQ ID NO：1的过量表达重组质粒。将含SEQ ID NO：1的过量表达重组质粒转入农杆菌中，利用下胚轴浸染的方法转化甘蓝型油菜(见步骤2)。

2、胚轴浸染的方法转化甘蓝型油菜

2.1、无菌苗的获取

选取籽粒饱满的甘蓝型油菜种子，4℃过夜春化(保持种子发芽同步)，然后取出，用70％乙醇浸泡30s，0.1％的升汞(HgCl2)溶液浸泡8-10min，无菌水冲洗5次，滤纸吸干，接种于MS固体培养基上。置培养室中24℃，暗培养2-3天，然后取出光照16h/d继续萌发。取5～7cm(约7-8天)无菌苗下胚轴作为转化受体。

2.2、下胚轴的预培养

将油菜下胚轴切成7mm左右小段，分散均匀置于预培养基(MS+2mg/L 6-BA，1mg/L2，4-D，2.5mg/L AgNO3，19.62mg/L乙酰丁香酮)中进行2～3天的预培养(可见下胚轴变粗)。

2.3、下胚轴的浸染及共培养

挑取含SEQ ID NO：1的过量表达重组质粒的农杆菌，接种于含20mg/L链霉素，50mg/L卡那霉素，40mg/L利福平的LB液体培养基中，28℃摇菌过夜后收集菌体，重悬于含100mg/L乙酰丁香酮的MS液体培养基中至OD600＝0.4-0.6，28℃摇菌1-2h。

将经预培养的健壮的油菜下胚轴分别浸入含SEQ ID NO：1的过量表达重组质粒的农杆菌菌液中30s-1min，此期间不断振荡使菌液与油菜下胚轴充分接触。用无菌滤纸迅速吸干多余的菌液，将油菜下胚轴平放于共培养基(MS+2mg/L 6-BA，1mg/L 2，4-D，2.5mg/LAgNO3，19.62mg/L乙酰丁香酮)上，共培养2d。

2.4、筛选培养与芽的诱导

将共培养后的两种油菜下胚轴分别接入分化培养基(MS+2mg/L 6-BA，1mg/L2，4-D，2.5mg/L AgNO3，19.62mg/L乙酰丁香酮)中继续培养。每2周更新培养基一次，培养4周，得到愈伤芽。

2.5、生根

在筛选培养基(MS+2mg/L 6-BA，2.5mg/L AgNO3，500mg/L羧苄青霉素，10mg/L卡那霉素)上待两种愈伤芽长至有4-6片真叶时，将芽从愈伤组织中切下，移入生根培养基(1/2MS，0.15mg/L NAA，250mg/L头孢霉素)中。待再生苗根系生长发达时，将培养罐移至室外2-3d，然后将培养罐盖揭开，在培养室中炼苗2-3d。

2.6、盆栽培养

将含SEQ ID NO：1的过量表达转基因植株分别在生根培养基上发育出完整根系，将其转入盆栽。

3、转基因油菜的PCR检测

待土壤中两种再生植株长大后，各取叶片少量抽提总DNA，以提取的DNA做模板，分别进行PCR检测。目的基因过量表达甘蓝型油菜转基因株系检测：

上游引物(SEQ ID NO.9)：5’-ATTTCATTTGGAGAGAACACGG-3’；

下游引物(SEQ ID NO.10)：5’-TCAGACTGGTGTTGGGTTGGATAT-3’。

然后琼脂糖电泳检测，检测结果见图1，若有目标条带出现则代表目的基因已转入甘蓝型油菜。所检测出目的条带的大小和预期SEQ ID NO：1大小一致，约为860bp。制得SEQ IDNO：1核苷酸序列过量表达甘蓝型油菜植株和种子备用。

供试土壤取自四川凉山州甘洛县铅锌矿区附近种植区的土壤，取转TT1基因和非转基因甘蓝型油菜种子，播种于重金属污染土壤中，进行温室培养(光照强度10000Lx，光照时间14h/d)。观察其生长状况，待长至5-6片真叶时，进行各项生理指标的检测。

4、重金属抗性测定

4.1、电导率测定

取干净试管，加入10ml去离子水，测定本底电导率值E0，记录数据。取2g植物材料，每组10个重复，分别放入加有去离子水的试管中，在室温条件下置于恒温振荡培养箱中匀速振荡浸泡过夜。

振荡完毕，摇匀试管中的浸泡液，测定电导率值，记录电导率E1。再将各个试管(浸泡液及材料)加盖，沸水浴8min，冷却至室温后，测定浸泡液的电导率E2。

相对电导率计算公式为：相对电导率(％)＝(E1-E0)/(E2-E0)×100％。

实验结果得知，野生型油菜相对电导率平均45.38％，而转TT1基因油菜相对电导率平均21.03％。相对电导率低，表明受外界逆境的影响小，抵抗逆境的能力强。转基因植株的电导率均比野生型低，说明TT1基因具有改变细胞透性的功能，提高细胞膜在有害重金属胁迫下的稳定性，减少重金属离子的吸收。

4.2、原子吸收分光光度法测定油菜叶片中Pb、Cd、Cr、Zn含量

选取转TT1基因型及野生型油菜叶片，自来水洗涤干净，蒸馏水润洗，洁净纱布擦干，置于恒温干燥箱内于杀青30min，然后烘干，置于干燥器中待用。

将样品置于玻璃研钵反复研磨，直至全部通过40目尼龙筛孔，贮存于牛皮纸袋内，再置于干燥器中备用。

准确称取上述已制备样品2～3g，放入150ml三角瓶中，加浓硝酸15ml、高氯酸5ml，放置于电热板(150℃)上加热，当溶液清澈无色时，降低温度并加热至近干，离开电热板于室温下冷却，用去离子水溶解并定容到100ml容量瓶中，上机分析(AA-6800原子吸收分光光度计)。植物样品中重金属含量(mg/kg)＝CX×(V/m)，其中CX：从标准曲线上查找的浓度mg/kg，V：定容体积ml，m：样品质量g。结果如表1：

表1油菜叶片中重金属含量测定结果

  铅Pb含量  镉Cd含量  铬Cr含量  锌Zn含量 TT1(转基因)  2.014mg/kg  0.113mg/kg  9.281mg/kg  28.333mg/kg WT(野生型)  4.615mg/kg  0.658mg/kg  15.074mg/kg  65.156mg/kg

试验结果表明，对照叶片中Pb、Cd、Cr、Zn含量较高，而转基因油菜叶片中四项重金属含量普遍下降。表明TT1基因可以提高降低对重金属的吸收。

4.3、油菜生物量的测定

取在重金属土壤中生长的转基因型及野生型油菜植株整株，放于烘箱中4h后，测定其干物质重量。结果发现，野生型油菜干物质含量平均仅有0.059g，而转基因油菜干物质含量平均0.097g。说明，TT1基因可使植物在重金属逆境中保持良好物质积累，使植株正常生长。

实施例三、转TT1基因大肠杆菌的制备及其对重金属抗性的测定

1、根据SEQ ID NO：1所示核苷酸序列设计引物，

上游引物(SEQ ID NO.7)：5’-CGC GGATCCATGTCGGATGATTTGAGTTTATG-3’，

下游引物(SEQ ID NO.8)：5’-CCGGAGC TCTCAGACTGGTGTTGGGTTGGATAT-3’。

经PCR，扩增出带酶切位点的表达序列。纯化PCR产物(见Qiagen公司所公开的资料)，然后用BamH1与Sac1酶切，胶回收片段后分别与载体pET28连接，获得重组质粒。将重组质粒转入大肠杆菌JM109中，涂布于含卡那霉素的LB固体培养基上，经测序验证，得到含重组质粒的大肠杆菌JM109菌株。

2、重组质粒在大肠杆菌JM109菌株中繁殖后，提取质粒(见Qiagen公司所公开的资料)，将重组质粒转化大肠杆菌BL21Rosset细胞里，涂布于含卡那霉素和氯霉素的LB固体培养基上，挑取单菌落，放入含100mg/L卡那霉素和氯霉素的LB培养基中37℃、225rpm过夜活化培养。

3、活化培养后，按1：250的比例将菌液加入含重金属元素的新鲜LB培养基中(含100mg/L卡那霉素和氯霉素，0.01mM Cd²⁺、1mM Zn²⁺、0.05mM Pb²⁺)，测定OD600值(北京普析通仪器公司TU-1800型紫外分光光度计)，将初始OD调一致，振荡培养(37℃，225rpm)48h，每4时一次测OD值。

结果发现，转TT1基因的大肠杆菌比非转基因的大肠杆菌对重金属有较高的耐受性。OD值越大，表明菌液浓度越大，即生长情况越好，如图2可见，随时间变化，转TT1基因的大肠杆菌(TT1)的生长曲线斜率明显大于非转基因大肠杆菌(对照)，说明转TT1基因的大肠杆菌的生长速度和生长状况明显优于非转基因大肠杆菌。

SEQUENCE LISTING

<110>四川贝安迪生物基因工程有限公司

<120>TT1基因在提高植物和微生物抗重金属能力中的用途

<130>A100009k

<160>10

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>861

<212>DNA

<213>Brassica napus

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(858)

<223>TT1基因cDNA序列

<400>1

atg tcg gat gat ttg agt tta tgt acc gat cgt ctg ata acg gcc gag     48

Met Ser Asp Asp Leu Ser Leu Cys Thr Asp Arg Leu Ile Thr Ala Glu

1               5                   10                  15

agc ttg gaa tca gaa aag gat tct gga gaa agt tcc agg ctt caa ggc     96

Ser Leu Glu Ser Glu Lys Asp Ser Gly Glu Ser Ser Arg Leu Gln Gly

            20                  25                  30

aaa gat gtg gct tct tct tca tct gcg gat gaa gct gaa gat gct agg    144

Lys Asp Val Ala Ser Ser Ser Ser Ala Asp Glu Ala Glu Asp Ala Arg

        35                  40                  45

aag tac tat gct gtt gtt gca gaa gag gag ccg ctt ctg caa tct gtt    192

Lys Tyr Tyr Ala Val Val Ala Glu Glu Glu Pro Leu Leu Gln Ser Val

    50                  55                  60

gag tgc cgt att tgc cag gag gaa gat atc act aag aac ttg gag act    240

Glu Cys Arg Ile Cys Gln Glu Glu Asp Ile Thr Lys Asn Leu Glu Thr

65                  70                  75                  80

cct tgt gct tgc aat ggc agt ttg aag tat gct cac cgc aag tgt gtt    288

Pro Cys Ala Cys Asn Gly Ser Leu Lys Tyr Ala His Arg Lys Cys Val

                85                  90                  95

cag cgt tgg tgt aat gag aaa ggc gac ata atc tgc gaa ata tgc cac    336

Gln Arg Trp Cys Asn Glu Lys Gly Asp Ile Ile Cys Glu Ile Cys His

            100                 105                 110

cag cct tat caa tct gga tat aca gca cct cca cct cct cct cct gat    384

Gln Pro Tyr Gln Ser Gly Tyr Thr Ala Pro Pro Pro Pro Pro Pro Asp

        115                 120                 125

gaa act ata att cac att ggt gac gac tgg gag gat gga gtt cac ttg    432

Glu Thr Ile Ile His Ile Gly Asp Asp Trp Glu Asp Gly Val His Leu

    130                 135                 140

gac tcg agc gac ccg cgc att cta gca atg gct gcg gcg gaa cga cat    480

Asp Ser Ser Asp Pro Arg Ile Leu Ala Met Ala Ala Ala Glu Arg His

145                 150                 155                 160

ttc ttg gaa gct gac tat gac gag tac tct gag tct aac tct agc ggt    528

Phe Leu Glu Ala Asp Tyr Asp Glu Tyr Ser Glu Ser Asn Ser Ser Gly

                165                 170                 175

gct gcc ttc tgt cgc tct gct gct ctc atc ctg atg gca ctt tta ctg    576

Ala Ala Phe Cys Arg Ser Ala Ala Leu Ile Leu Met Ala Leu Leu Leu

            180                 185                 190

tta cgt gat gca cta aac ctc aca act aac cca gat gac gag gac gat    624

Leu Arg Asp Ala Leu Asn Leu Thr Thr Asn Pro Asp Asp Glu Asp Asp

        195                 200                 205

ccc act gcc ttc ttc tct ctt ttc ctt ctt cgt gct gct ggt ttt ctc    672

Pro Thr Ala Phe Phe Ser Leu Phe Leu Leu Arg Ala Ala Gly Phe Leu

    210                 215                 220

ctc cca tgt tat atc atg gca tgg gcc atc ggt att ctc cag cgc cgg    720

Leu Pro Cys Tyr Ile Met Ala Trp Ala Ile Gly Ile Leu Gln Arg Arg

225                 230                 235                 240

agg caa aga cag gaa gca gct gcg cta gct gcg gcg gaa gtt gcc ttc    768

Arg Gln Arg Gln Glu Ala Ala Ala Leu Ala Ala Ala Glu Val Ala Phe

                245                 250                 255

atg ata cac ggt ggt gtg cca caa cgc agg gga cta cac ttt gct gta    816

Met Ile His Gly Gly Val Pro Gln Arg Arg Gly Leu His Phe Ala Val

            260                 265                 270

gca cca gag cag ccg ccg cca ata tcc aac cca aca cca gtc tga        861

Ala Pro Glu Gln Pro Pro Pro Ile Ser Asn Pro Thr Pro Val

        275                 280                 285

<210>2

<211>286

<212>PRT

<213>Brassica napus

<400>2

Met Ser Asp Asp Leu Ser Leu Cys Thr Asp Arg Leu Ile Thr Ala Glu

1               5                   10                  15

Ser Leu Glu Ser Glu Lys Asp Ser Gly Glu Ser Ser Arg Leu Gln Gly

            20                  25                  30

Lys Asp Val Ala Ser Ser Ser Ser Ala Asp Glu Ala Glu Asp Ala Arg

        35                  40                  45

Lys Tyr Tyr Ala Val Val Ala Glu Glu Glu Pro Leu Leu Gln Ser Val

    50                  55                  60

Glu Cys Arg Ile Cys Gln Glu Glu Asp Ile Thr Lys Asn Leu Glu Thr

65                  70                  75                  80

Pro Cys Ala Cys Asn Gly Ser Leu Lys Tyr Ala His Arg Lys Cys Val

                85                  90                  95

Gln Arg Trp Cys Asn Glu Lys Gly Asp Ile Ile Cys Glu Ile Cys His

            100                 105                 110

Gln Pro Tyr Gln Ser Gly Tyr Thr Ala Pro Pro Pro Pro Pro Pro Asp

        115                 120                 125

Glu Thr Ile Ile His Ile Gly Asp Asp Trp Glu Asp Gly Val His Leu

    130                 135                 140

Asp Ser Ser Asp Pro Arg Ile Leu Ala Met Ala Ala Ala Glu Arg His

145                 150                 155                 160

Phe Leu Glu Ala Asp Tyr Asp Glu Tyr Ser Glu Ser Asn Ser Ser Gly

                165                 170                 175

Ala Ala Phe Cys Arg Ser Ala Ala Leu Ile Leu Met Ala Leu Leu Leu

            180                 185                 190

Leu Arg Asp Ala Leu Asn Leu Thr Thr Asn Pro Asp Asp Glu Asp Asp

        195                 200                 205

Pro Thr Ala Phe Phe Ser Leu Phe Leu Leu Arg Ala Ala Gly Phe Leu

    210                 215                 220

Leu Pro Cys Tyr Ile Met Ala Trp Ala Ile Gly Ile Leu Gln Arg Arg

225                 230                 235                 240

Arg Gln Arg Gln Glu Ala Ala Ala Leu Ala Ala Ala Glu Val Ala Phe

                245                 250                 255

Met Ile His Gly Gly Val Pro Gln Arg Arg Gly Leu His Phe Ala Val

            260                 265                 270

Ala Pro Glu Gln Pro Pro ProIle Ser Asn Pro Thr Pro Val

        275                 280                 285

<210>3

<211>696

<212>DNA

<213>Brassica napus

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(693)

<223>筛选到的编码与atp6相互作用蛋白的核苷酸序列

<400>3

gaa gag gag ccg ctt ctg caa tct gtt gag tgc cgt att tgc cag gag     48

Glu Glu Glu Pro Leu Leu Gln Ser Val Glu Cys Arg Ile Cys Gln Glu

1               5                   10                  15

gaa gat atc act aag aac ttg gag act cct tgt gct tgc aat ggc agt     96

Glu Asp Ile Thr Lys Asn Leu Glu Thr Pro Cys Ala Cys Asn Gly Ser

            20                  25                  30

ttg aag tat gct cac cgc aag tgt gtt cag cgt tgg tgt aat gag aaa    144

Leu Lys Tyr Ala His Arg Lys Cys Val Gln Arg Trp Cys Asn Glu Lys

        35                  40                  45

ggc gac ata atc tgc gaa ata tgc cac cag cct tat caa tct gga tat    192

Gly Asp Ile Ile Cys Glu Ile Cys His Gln Pro Tyr Gln Ser Gly Tyr

    50                  55                  60

aca gca cct cca cct cct cct cct gat gaa act ata att cac att ggt    240

Thr Ala Pro Pro Pro Pro Pro Pro Asp Glu Thr Ile Ile His Ile Gly

65                  70                  75                  80

gac gac tgg gag gat gga gtt cac ttg gac tcg agc gac ccg cgc att    288

Asp Asp Trp Glu Asp Gly Val His Leu Asp Ser Ser Asp Pro Arg Ile

                85                  90                  95

cta gca atg gct gcg gcg gaa cga cat ttc ttg gaa gct gac tat gac    336

Leu Ala Met Ala Ala Ala Glu Arg His Phe Leu Glu Ala Asp Tyr Asp

            100                 105                 110

gag tac tct gag tct aac tct agc ggt gct gcc ttc tgt cgc tct gct    384

Glu Tyr Ser Glu Ser Asn Ser Ser Gly Ala Ala Phe Cys Arg Ser Ala

        115                 120                 125

gct ctc atc ctg atg gca ctt tta ctg tta cgt gat gca cta aac ctc    432

Ala Leu Ile Leu Met Ala Leu Leu Leu Leu Arg Asp Ala Leu Asn Leu

    130                 135                 140

aca act aac cca gat gac gag gac gat ccc act gcc ttc ttc tct ctt    480

Thr Thr Asn Pro Asp Asp Glu Asp Asp Pro Thr Ala Phe Phe Ser Leu

145                 150                 155                 160

ttc ctt ctt cgt gct gct ggt ttt ctc ctc cca tgt tat atc atg gca    528

Phe Leu Leu Arg Ala Ala Gly Phe Leu Leu Pro Cys Tyr Ile Met Ala

                165                 170                 175

tgg gcc atc ggt att ctc cag cgc cgg agg caa aga cag gaa gca gct    576

Trp Ala Ile Gly Ile Leu Gln Arg Arg Arg Gln Arg Gln Glu Ala Ala

            180                 185                 190

gcg cta gct gcg gcg gaa gtt gcc ttc atg ata cac ggt ggt gtg cca    624

Ala Leu Ala Ala Ala Glu Val Ala Phe Met Ile His Gly Gly Val Pro

        195                 200                 205

caa cgc agg gga cta cac ttt gct gta gca cca gag cag ccg ccg cca    672

Gln Arg Arg Gly Leu His Phe Ala Val Ala Pro Glu Gln Pro Pro Pro

    210                 215                 220

ata tcc aac cca aca cca gtc tga                                    696

Ile Ser Asn Pro Thr Pro Val

225                 230

<210>4

<211>231

<212>PRT

<213>Brassica napus

<400>4

Glu Glu Glu Pro Leu Leu Gln Ser Val Glu Cys Arg Ile Cys Gln Glu

1               5                   10                  15

Glu Asp Ile Thr Lys Asn Leu Glu Thr Pro Cys Ala Cys Asn Gly Ser

            20                  25                  30

Leu Lys Tyr Ala His Arg Lys Cys Val Gln Arg Trp Cys Asn Glu Lys

        35                  40                  45

Gly Asp Ile Ile Cys Glu Ile Cys His Gln Pro Tyr Gln Ser Gly Tyr

    50                  55                  60

Thr Ala Pro Pro Pro Pro Pro Pro Asp Glu Thr Ile Ile His Ile Gly

65                  70                  75                  80

Asp Asp Trp Glu Asp Gly Val His Leu Asp Ser Ser Asp Pro Arg Ile

                85                  90                  95

Leu Ala Met Ala Ala Ala Glu Arg His Phe Leu Glu Ala Asp Tyr Asp

            100                 105                 110

Glu Tyr Ser Glu Ser Asn Ser Ser Gly Ala Ala Phe Cys Arg Ser Ala

        115                 120                 125

Ala Leu Ile Leu Met Ala Leu Leu Leu Leu Arg Asp Ala Leu Asn Leu

    130                 135                 140

Thr Thr Asn Pro Asp Asp Glu Asp Asp Pro Thr Ala Phe Phe Ser Leu

145                 150                 155                 160

Phe Leu Leu Arg Ala Ala Gly Phe Leu Leu Pro Cys Tyr Ile Met Ala

                165                 170                 175

Trp Ala Ile Gly Ile Leu Gln Arg Arg Arg Gln Arg Gln Glu Ala Ala

            180                 185                 190

Ala Leu Ala Ala Ala Glu Val Ala Phe Met Ile His Gly Gly Val Pro

        195                 200                 205

Gln Arg Arg Gly Leu His Phe Ala Val Ala Pro Glu Gln Pro Pro Pro

    210                 215                 220

Ile Ser Asn Pro Thr Pro Val

225                 230

<210>5

<211>23

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>5

atgtcggatg atttgagttt atg            23

<210>6

<211>24

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>6

tcagactggt gttgggttgg atat           24

<210>7

<211>32

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>7

cgcggatcca tgtcggatga tttgagttta tg    32

<210>8

<211>33

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>8

ccggagctct cagactggtg ttgggttgga tat    33

<210>9

<211>22

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>9

atttcatttg gagagaacac gg           22

<210>10

<211>24

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>10

tcagactggt  gttgggttgg atat        24