海藻酸盐/ε-聚赖氨酸/海藻酸盐生物微胶囊的制备

摘要

本发明涉及生物微胶囊，特别是涉及一种海藻酸盐/ε-聚赖氨酸/海藻酸盐生物微胶囊(ε-APA微胶囊)的制备方法。高聚合多价阳离子态的ε-聚赖氨酸，可与带有阴离子的物质有强的静电作用力，基于这一特性，将ε-聚赖氨酸用作微囊膜材料，在海藻酸盐微胶囊外做成缓释性能的包被膜，来改变生物微胶囊的通透性、免疫隔离性，将ε-APA微胶囊用于细胞移植、细胞培养、药物释放等生物医学领域。

说明书

技术领域

本发明涉及生物微胶囊，特别是涉及一种海藻酸盐/ε-聚赖氨酸/海藻酸盐生物微胶囊的制备方法。

背景技术

20世纪60年代，Chang报道了半透膜微胶囊，指出用其包埋蛋白质、酶等生物活性物质和细胞，可保持生物物质活性[Chang TMS.Semipermeablemicrocapsules，Science，1964，146：524-525]。20世纪80年代初，Lim和Sun针对组织/细胞功能缺损性疾病(如糖尿病)，成功制备了海藻酸钠/α-聚赖氨酸(alginate/α-polylysine)半透膜微胶囊(简称α-APA微胶囊)，包封Wistar大鼠胰岛细胞并移植入糖尿病WistarLewis大鼠体内，分泌释放胰岛素以调控血糖量[Lim F，Sun A M.Microencapsulated islets bioartificialendocrine pancreas，Science，1980，210：908-910]。由此推动了微囊化技术相关材料和制备方法研究的快速发展，在细胞移植、药物释放和基因治疗等生物医学领域的临床前研究中得到广泛应用[Wang W， Liu XD，Ma XJ，et al.Microencapsulation using natural polysaccharides for drug delivery and cellimplantation，J.Mater.Chem.，2006，16：3252-3267]。在众多的生物微胶囊中，海藻酸钠/聚赖氨酸微胶囊使用较多，其微胶囊膜材料为化学法合成α-聚赖氨酸(赖氨酸残基之间的酰胺键是由α-氨基和α-羧基缩合而成)，但由于α-聚赖氨酸价格昂贵(300-400US$/g)，加之材料固有的生物相容性差，具有一定毒性，这极大地限制了海藻酸钠/α-聚赖氨酸微胶囊在临床上的应用[Strand B L，Ryan TL，Veld P I，et al.Cell Transplant.，2001，10：263-275]。1977年日本学者Shima和Sakai经发酵白色链霉菌制备出一种由多个赖氨酸残基同型单体组成的聚合物，酰胺键是通过α-羧基和ε-氨基连接而成，故称为ε-聚赖氨酸(ε-PLL)[Shoji shima.，Polylysineproduced by Streptomyces.Agric Biol Chem.，1977，41：1807-1809]。作为一种天然微生物代谢产品，其成本低，环境友好，在体内可分解为赖氨酸而被完全被消化吸收，没有任何毒副作用[Hiraki J，Ichikawa T， Ninomiya S，et al.Use of ADME studies to confirm the safety of epsilon-polylysine as apreservative in food.Regulatory Toxicology and Pharmacology，2003，37：328-340]，在2004年已通过美国FDA认证(CAS登记号为28211-04-3)。ε-聚赖氨酸在聚合度n为25～35，相对分子量在3.5KDa～4.5KDa具有较高抑菌活性，目前广泛用于食品防腐剂、乳化剂，医药工业的药物载体、抗癌增强剂以及生物芯片包埋剂等领域[Shih IL，Shen MH，Van YT.Microbialsynthesis of poly(epsilon-lysine)and its various applications，BioresourceTechnology.2006，97：1148-1159]，而聚合度n大于35，分子量大于5KDa的ε-聚赖氨酸具有高分子的特性，分子链中存在大量伯氨基，在溶液中氨基质子化，带有大量正电荷成为阳离子聚合物，可与聚阴离子海藻酸钠在静电作用下形成海藻酸钠/ε-聚赖氨酸复合物。用ε-聚赖氨酸替代α-聚赖氨酸制备蛋白质、酶等生物活性物质和细胞的微胶囊，用于细胞移植、细胞培养、药物释放等在生物医学领域仍属空白。

发明内容

针对上述问题，本发明提出将微生物发酵合成的ε-聚赖氨酸替代化学合成的α-聚赖氨酸用于生物微胶囊的制备，达到α-聚赖氨酸生物微胶囊的同等性能。

海藻酸盐/ε-聚赖氨酸/海藻酸盐生物微胶囊(ε-APA微胶囊)的制备方法包括：将包埋有细胞/蛋白质/酶/核酸等生物质的海藻酸盐凝胶微球与高聚合多价阳离子态的ε-聚赖氨酸(ε-PLL)溶液反应，在海藻酸盐凝胶微球表面，通过静电络合反应形成ε-聚赖氨酸微胶囊膜，再用低浓度海藻酸盐溶液中和微胶囊表面正电荷，最后用有机金属螯合剂液化微胶囊内部的海藻酸盐凝胶，制备成具有免疫隔离性能、药物控释性能的ε-APA微胶囊，可用于细胞移植、细胞培养或药物释放等生物医学领域。

ε-APA微胶囊制备的具体步骤包括：

1)制备包埋有细胞/蛋白质/酶/核酸等生物质的海藻酸盐凝胶微球(简称A微胶囊)；

2)将步骤1)中的A微胶囊浸入ε-聚赖氨酸(ε-PLL)溶液中，将ε-聚赖氨酸用于海藻酸盐胶囊的缓释的包被膜，A微胶囊与ε-PLL溶液体积比范围为1∶5～1∶40，反应1-20分钟，反应温度在4-37℃，此时得到ε-APA微胶囊取出用生理盐水洗涤；

3)将步骤2)中的ε-AP微胶囊浸入碱金属海藻酸盐溶液中，碱金属海藻酸盐阴离子与ε-AP微囊膜表面残余未反应的氨基阳离子反应完全，ε-AP微胶囊与碱金属海藻酸盐溶液体积比范围为1∶5～1∶40，反应1-20分钟，反应温度在4-37℃，此时得到ε-APA微胶囊，取出用生理盐水洗涤；

4)将步骤3)中的ε-APA微胶囊浸入有机金属螯合剂溶液中，液化微胶囊内部的海藻酸盐凝胶，ε-APA微胶囊与有机金属螯合剂溶液体积比范围为1∶5～1∶20，反应1-20分钟，反应温度在4-37℃，取出用生理盐水洗涤，此时得到内部液态核心的ε-APA微胶囊。

2、其中，用于成膜反应的ε-聚赖氨酸为微生物发酵合成的，高聚合多价阳离子均聚物，分子量分布为5KDa～100KDa，酰胺键是通过α-羧基和ε-氨基连接而成，其结构式为：

参与成膜反应的ε-聚赖氨酸溶液的配制方法是：ε-聚赖氨酸溶于pH为5.5-7.4的生理盐水、HEPES缓冲液、PBS缓冲液等生理缓冲体系中，ε-聚赖氨酸浓度为0.01-0.5％(w/v)；

3、制备包埋有细胞/蛋白质/酶/核酸等生物质的海藻酸盐凝胶微球(A微胶囊)为二价金属钙、钡、锌等海藻酸盐水凝胶。

4、用于中和表面电荷的碱金属海藻酸盐为钾盐或钠盐，分子量分布为100KDa-500KDa，海藻酸盐溶液的配制方法是：海藻酸盐溶于0.3-0.9％(w/v)NaCl溶液中，海藻酸盐浓度为0.01-0.5％(w/v)；

5、参与液化反应的有机金属螯合剂有55mmol/L的柠檬酸钠、100mmol/L的EDTA等。

6、该方法制备的ε-APA微胶囊可以作为细胞移植的固定化载体或蛋白/酶/核酸等生物药物的控释载体。

本发明的有益效果是：

1、本发明所用的海藻酸盐微胶囊与ε-聚赖氨酸溶液及海藻酸盐溶液是通过静电相互作用进行自组装的，反应条件温和，有利于细胞/蛋白质/酶/核酸等生命活性物质的活性保持。

2、与传统的海藻酸钠/α-聚赖氨酸/海藻酸钠微胶囊(α-APA微胶囊)相比，本发明所采用的ε-聚赖氨酸(ε-PLL)为天然微生物发酵，生物合成产品，其成本低，环境友好，在体内分解为赖氨酸而被完全被消化吸收，没有任何毒副作用，使用安全。

附图说明

图1为实施例1中ε-APA微胶囊内培养CHO细胞时的细胞形态光学照片；(图中标尺为100μm)；

图2为实施例为比较例1中α-APA微胶囊内培养CHO细胞时的细胞形态光学照片；(图中标尺为100μm)。

具体实施方式

ε-聚赖氨酸可通过市售获得，或按下述文献制备；

1977年日本学者Shima和Sakai经发酵白色链霉菌制备出一种由多个赖氨酸残基同型单体组成的聚合物，酰胺键是通过α-羧基和ε-氨基连接而成，故称为ε-聚赖氨酸(ε-PLL)[Shoji shima.，Polylysine produced byStreptomyces.Agric Biol Chem.，1977，41：1807-1809]。

实施例1

1)利用高压静电法制备[曲蓓蓓，于炜婷，刘袖洞等，高压静电法制备单分散性的海藻酸钙微胶珠，化工学报，2005，56(8)：1547]包埋有CHO细胞的海藻酸钙凝胶微球，细胞初始接种密度为1×10⁶/mL海藻酸钠溶液。

2)37℃条件下，将上述制得的海藻酸钙凝胶微球浸入0.05％(w/v)，pH5.5，ε-聚赖氨酸(Mw10KDa)/生理盐水溶液中，CHO/海藻酸钙凝胶微球与ε-PLL溶液体积比为1∶40，反应10分钟，制得ε-AP微胶囊，然后用生理盐水洗涤3遍。

3)37℃温度条件下，将上述制得的ε-AP微胶囊浸入浓度为0.05％(w/v)的海藻酸钠(Mw200KDa)/0.9％(w/v)NaCl溶液中，CH0/ε-AP微胶囊与海藻酸钠溶液体积比为1∶40，反应10分钟，得到ε-APA微胶囊，生理盐水洗涤3遍。

4)37℃温度条件下，将上述制得的ε-APA微胶囊浸入55mmol/L的柠檬酸钠溶液中，CHO/ε-APA微胶囊与柠檬酸钠溶液体积比为1∶10，反应5分钟，液化微胶囊内部的海藻酸钙凝胶，制备成内部液态核心的ε-APA微囊化CHO细胞(图1)。

5)将微囊化细胞在CO2培养箱中培养，培养条件参考文献[Optimizationof the Seeding Density in Microencapsulated Recombinant CHO Cell Culture.Ying Zhang，Jing Zhou，Xulang Zhang，et al.，Chemical and BiochemicalEngineering Quarterly，2008，22(1)：105-111]。

6)用MTT法检测ε-APA微胶囊内CHO细胞生长情况，发现细胞生长良好，与比较例1效果相当。

实施例2

1)利用高压静电法[曲蓓蓓，于炜婷，刘袖洞等，高压静电法制备单分散性的海藻酸钙微胶珠，化工学报，2005，56(8)：1547]制备包埋有肝细胞-HepG2细胞的海藻酸钙凝胶微球，细胞初始接种密度为1×10⁶/mL海藻酸钠溶液。

2)37℃条件下，将上述制得的海藻酸钙凝胶微球浸入0.1％(w/v)，pH6.5，ε-聚赖氨酸(Mw30KDa)/生理盐水溶液中，HepG2/海藻酸钙凝胶微球与ε-PLL溶液体积比为1∶20，反应15分钟，制得ε-AP微胶囊，然后用生理盐水洗涤3遍。

3)37℃温度条件下，将上述制得的ε-AP微胶囊浸入浓度为0.1％(w/v)的海藻酸钠(Mw300KDa)/0.9％(w/v)NaCl溶液中，HepG2/ε-AP微胶囊与海藻酸钠溶液体积比为1∶20，反应15分钟，得到ε-APA微胶囊，生理盐水洗涤3遍。

4)37℃温度条件下，将上述制得的ε-APA微胶囊浸入55mmol/L的柠檬酸钠溶液中，HepG2/ε-APA微胶囊与柠檬酸钠溶液体积比为1∶10，反应5分钟，液化微胶囊内部的海藻酸钙凝胶，制备成内部液态核心的ε-APA微囊化HepG2细胞。

5)培养条件参考文献[微囊化人肝细胞移植对小鼠急性肝衰竭的治疗作用，王秋艳，李双月，刘婧，杨静娴，王为，马小军，袁权，中国临床康复，2006，10：54-57]。

实施例3

1)利用高压静电法[曲蓓蓓，于炜婷，刘袖洞等，高压静电法制备单分散性的海藻酸钙微胶珠，化工学报，2005，56(8)：1547]制备包埋有胚胎干细胞(ES)的海藻酸钙凝胶微球，细胞初始接种密度为1×10⁶/mL海藻酸钠溶液。

2)37℃条件下，将上述制得的海藻酸钙凝胶微球浸入0.2％(w/v)，pH6.5，ε-聚赖氨酸(Mw50KDa)/生理盐水溶液中，ES/海藻酸钙凝胶微球与ε-PLL溶液体积比为1∶10，反应15分钟，制得ε-AP微胶囊，然后用生理盐水洗涤3遍。

3)37℃温度条件下，将上述制得的ε-AP微胶囊浸入浓度为0.2％(w/v)的海藻酸钠(Mw400KDa)/0.9％(w/v)NaCl溶液中，ES/ε-AP微胶囊与海藻酸钠溶液体积比为1∶10，反应15分钟，得到ε-APA微胶囊，生理盐水洗涤3遍。

4)37℃温度条件下，将上述制得的ε-APA微胶囊浸入55mmol/L的柠檬酸钠溶液中，ES/ε-APA微胶囊与柠檬酸钠溶液体积比为1∶10，反应5分钟，液化微胶囊内部的海藻酸钙凝胶，制备成内部液态核心的ε-APA微囊化ES细胞。

5)培养条件参照文献[Proliferation and Differentiation of MouseEmbryonic Stem Cells in APA Microcapsule：a model for studying theinteraction between Stem cells and their niche，Xiuli Wang，Wei Wang，JuanMa，et al.，Biotechnology Progress，2006，22(3)：791-800]

实施例4

1)利用高压静电法[曲蓓蓓，于炜婷，刘袖洞等，高压静电法制备单分散性的海藻酸钙微胶珠，化工学报，2005，56(8)：1547]制备包埋有大肠杆菌DH5α的海藻酸钙凝胶微球，细胞初始接种密度为1×10⁶/mL海藻酸钠溶液。2)37℃条件下，将上述制得的海藻酸钙凝胶微球浸入0.2％(w/v)，pH7.0，ε-聚赖氨酸(Mw100KDa)/HEPES溶液中，大肠杆菌/海藻酸钙凝胶微球与ε-PLL溶液体积比为1∶10，反应15分钟，制得ε-AP微胶囊，然后用生理盐水洗涤3遍。

3)37℃温度条件下，将上述制得的ε-AP微胶囊浸入浓度为0.2％(w/v)的海藻酸钠(Mw500KDa)/0.9％(w/v)NaCl溶液中，大肠杆菌/ε-AP微胶囊与海藻酸钠溶液体积比为1∶10，反应15分钟，得到ε-APA微胶囊，生理盐水洗涤3遍。

4)37℃温度条件下，将上述制得的ε-APA微胶囊浸入55mmol/L的EDTA溶液中，大肠杆菌/ε-APA微胶囊与柠檬酸钠溶液体积比为1∶10，反应5分钟，液化微胶囊内部的海藻酸钙凝胶，制备成内部液态核心的ε-APA微囊化大肠杆菌。

5)将微囊化大肠杆菌培养条件参考文献[海藻酸钠/壳聚糖微胶囊固定化大肠杆菌的研究，付颖丽，雄鹰，刘袖洞，于炜婷，王一力，虞星炬，马小军，生物工程学报，2002，18：239-241]

实施例5

1)利用高压静电法[曲蓓蓓，于炜婷，刘袖洞等，高压静电法制备单分散性的海藻酸钙微胶珠，化工学报，2005，56(8)：1547]制备包埋有植物细胞-栀子细胞的海藻酸钙凝胶微球，细胞初始接种密度为1×10⁶/mL海藻酸钠溶液。

2)37℃条件下，将上述制得的海藻酸钙凝胶微球浸入0.5％(w/v)，Ph7.4，ε-聚赖氨酸(Mw5KDa)/PBS溶液中，大肠杆菌/海藻酸钙凝胶微球与ε-PLL溶液体积比为1∶5，反应1分钟，制得ε-AP微胶囊，然后用生理盐水洗涤3遍。

3)37℃温度条件下，将上述制得的ε-AP微胶囊浸入浓度为0.5％(w/v)的海藻酸钠(Mw500KDa)/0.9％(w/v)NaCl溶液中，大肠杆菌/ε-AP微胶囊与海藻酸钠溶液体积比为1∶5，反应1分钟，得到ε-APA微胶囊，生理盐水洗涤3遍。

4)37℃温度条件下，将上述制得的ε-APA微胶囊浸入55mmol/L的EDTA溶液中，大肠杆菌/ε-APA微胶囊与柠檬酸钠溶液体积比为1∶10，反应5分钟，液化微胶囊内部的海藻酸钙凝胶，制备成内部液态核心的ε-APA微囊化大肠杆菌。

5)微囊化栀子细胞培养条件参考文献[微囊化植物细胞培养的研究，中科院博士论文，谢玉冰，1995]

实施例6

1)利用乳化法[X.D.Liu，D.C.Bao，W.M.Xue，et al.，Preparation ofuniform calcium alginate gel beads by membrane emulsification coupled withinternal

2)25℃温度条件下，将上述制得的海藻酸钙凝胶微球浸入0.1％(w/v)，pH6.5，ε-聚赖氨酸(Mw50KDa)/HEPES溶液中，BSA/海藻酸钙凝胶微球与ε-PLL溶液体积比为1∶10，反应10分钟，制得ε-AP微胶囊，然后用生理盐水洗涤3遍。

3)25℃温度条件下，将上述制得的ε-AP微胶囊浸入浓度0.1％(w/v)的海藻酸钾(Mw300KDa)/0.45％(w/v)NaCl溶液中，BSA/ε-AP微胶囊与海藻酸钾溶液体积比为1∶10，反应10分钟，得到ε-APA微胶囊，生理盐水洗涤3遍。

4)BSA/ε-APA微胶囊的载药率可达4％，包封率接近70％，体外释放速率与载药量呈正相关，与ε-PLL的交联固化度呈负相关，与比较例2效果相当。

实施例7

1)利用乳化法[X.D.Liu，D.C.Bao，W.M.Xue，et al.，Preparation ofuniform calcium alginate gel beads by membrane emulsification coupled withinternal gelation，Journal of Applied Polymer Science，2003，87(5)：848-852]制备包埋有DNA疫苗的海藻酸锌凝胶微球，DNA疫苗/PBS溶液与海藻酸钠溶液(1.5％w/v)体积比为1∶5，混合均匀作为水相；玉米油为油相，10％ZnAc₂为胶联剂，进行凝胶化反应10分钟。

2)15℃温度条件下，将上述制得的海藻酸锌凝胶微球浸入0.25％(w/v)，pH7.4，ε-聚赖氨酸(Mw30KDa)/PBS溶液中，DNA/海藻酸锌凝胶微球与ε-PLL溶液体积比为1∶15，反应5分钟，制得ε-AP微胶囊，然后用生理盐水洗涤3遍。

3)15℃温度条件下，将上述制得的ε-AP微胶囊浸入浓度0.25％(w/v)的海藻酸钠(Mw200KDa)/0.25％(w/v)NaCl溶液中，DNA/ε-AP微胶囊与海藻酸钠溶液体积比为1∶15，反应5分钟，得到ε-APA微胶囊，生理盐水洗涤3遍。

4)DNA/ε-APA微胶囊载药量可达5％，包封率可达56.0％；体外释放速率与载药量呈正相关，与ε-PLL的交联固化度呈负相关，与比较里3效果相当。

实施例8

1)在液滴法[matsumoto S.，Kobayashi H.，Takahima Y.，Prodution ofmonodispersed capsules.J.Microencapsulation，1986，3，25-31]制备包埋有β-葡萄糖苷酶的海藻酸钡凝胶微球，并进行凝胶化反应30分钟。(葡萄糖苷酶与海藻酸盐质量比1∶6)

2)4℃温度条件下，将上述制得的海藻酸钡凝胶微球浸入0.5％(w/v)，pH5.5，ε-聚赖氨酸(Mw5KDa)/HEPES溶液中，β-葡萄糖苷酶/海藻酸钡凝胶微球与ε-PLL溶液体积比为1∶5，反应1分钟，制得ε-AP微胶囊，然后用生理盐水洗涤3遍。

3)4℃温度条件下，将上述制得的ε-AP微胶囊浸入浓度0.5％(w/v)的海藻酸钾(Mw100KDa)/0.1％(w/v)NaCl溶液中，β-葡萄糖苷酶/ε-AP微胶囊与海藻酸钾溶液体积比为1∶5，反应1分钟，得到ε-APA微胶囊，生理盐水洗涤3遍。

4)ε-APA微囊化β-葡萄糖苷酶催化合成烷基糖苷的反应中催化能力与比较例4中效果相当。

比较例1

1)利用高压静电法[曲蓓蓓，于炜婷，刘袖洞等，高压静电法制备单分散性的海藻酸钙微胶珠，化工学报，2005，56(8)：1547]制备包埋有CHO细胞的海藻酸钙凝胶微球，并进行凝胶化反应30分钟。(细胞的浓度为1×10⁶/mL)

2)37℃温度条件下，将上述制得的海藻酸钙凝胶微球浸入0.01％(w/v)，pH7.0，α-聚赖氨酸(Mw100KDa)/生理盐水溶液中，CHO/海藻酸钙凝胶微球与α-PLL溶液体积比为1∶20，反应20分钟，制得α-AP微胶囊，然后用生理盐水洗涤3遍。

3)37℃温度条件下，将上述制得的α-AP微胶囊浸入浓度为0.01％(w/v)的海藻酸钠(Mw500KDa)/0.9％(w/v)NaCl溶液中，CHO/α-AP微胶囊与海藻酸钠溶液体积比为1∶20，反应20分钟，得到α-APA微胶囊，生理盐水洗涤3遍(图1)。

4)37℃温度条件下，将上述制得的α-APA微胶囊浸入55mmol/L的柠檬酸钠溶液中，CHO/α-APA微胶囊与柠檬酸钠溶液体积比为1∶5，反应5分钟，液化微胶囊内部的海藻酸钙凝胶，制备成内部液态核心的α-APA微胶囊(图2)。

5)将微囊化细胞按照实施例1条件培养，用MTT法检测α-APA微胶囊内CHO细胞生长情况，发现细胞生长良好。

比较例2

1)利用乳化法[X.D.Liu，D.C.Bao，W.M.Xue，et al.，Preparation ofuniform calcium alginate gel beads by membrane emulsification coupled withinternal gelation，Journal of Applied Polymer Science，2003，87(5)：848-852]制备包埋有牛血清白蛋白(BSA)的海藻酸钙凝胶微球，(牛血清白蛋白与海藻酸盐溶液混合均匀(质量比1∶6)作为水相；玉米油为油相，15％CaAc₂为胶联剂，进行凝胶化反应10分钟。

2)25℃温度条件下，将上述制得的海藻酸钙凝胶微球浸入0.1％(w/v)，pH6.5，α-聚赖氨酸(Mw50KDa)/HEPES溶液中，BSA/海藻酸钙凝胶微球与α-PLL溶液体积比为1∶10，反应10分钟，制得α-AP微胶囊，然后用生理盐水洗涤3遍。

3)25℃温度条件下，将上述制得的α-AP微胶囊浸入浓度0.1％(w/v)的海藻酸钾(Mw300KDa)/0.45％(w/v)NaCl溶液中，BSA/α-AP微胶囊与海藻酸钾溶液体积比为1∶10，反应10分钟，得到α-APA微胶囊，生理盐水洗涤3遍。

4)BSA/α-APA微胶囊的体外释放速率与载药量呈正相关，与α-PLL的交联固化度呈负相关，符合一级释放动力学方程。

比较例3

1)利用乳化法[X.D.Liu，D.C.Bao，W.M.Xue，et al.，Preparation ofuniform calcium alginate gel beads by membrane emulsification coupled withinternal gelation，Journal of Applied Polymer Science，2003，87(5)：848-852]制备包埋有DNA疫苗的海藻酸锌微胶囊，DNA疫苗PBS溶液与海藻酸钠溶液(1.5％w/v)体积比为1∶5，混合均匀，作为水相；玉米油为油相，10％ZnAc₂为胶联剂，进行凝胶化反应10分钟。

2)15℃温度条件下，将上述制得的海藻酸锌微胶囊浸入0.25％(w/v)，pH7.4，α-聚赖氨酸(Mw30KDa)/PBS溶液中，DNA/海藻酸锌凝胶微与α-PLL溶液体积比为1∶15，反应5分钟，制得α-AP微胶囊，然后用生理盐水洗涤3遍。

3)15℃温度条件下，将上述制得的α-AP微胶囊浸入浓度0.25％(w/v)的海藻酸钠(Mw200KDa)/0.25％(w/v)NaCl溶液中，DNA/α-AP微胶囊与海藻酸钠溶液体积比为1∶15，反应5分钟，得到α-APA微胶囊，生理盐水洗涤3遍。

4)DNA/α-APA微胶囊体外释放速率与载药量呈正相关，与α-PLL的交联固化度呈负相关，符合一级释放动力学方程。

比较例4

1)在液滴法[matsumoto S.，Kobayashi H.，Takahima Y.，Prodution ofmonodispersed capsules.J.Microencapsulation，1986，3，25-31]制备包埋有β-葡萄糖苷酶的海藻酸钡凝胶微球，并进行凝胶化反应30分钟。(葡萄糖苷酶与海藻酸盐质量比1∶6)

2)4℃温度条件下，将上述制得的海藻酸钡凝胶微球浸入0.5％(w/v)，pH5.5，α-聚赖氨酸(Mw50KDa)/HEPES溶液中，β-葡萄糖苷酶/海藻酸钡凝胶微球与α-PLL溶液体积比为1∶5，反应1分钟，制得α-AP微胶囊，然后用生理盐水洗涤3遍。

3)4℃温度条件下，将上述制得的α-AP微胶囊浸入浓度0.5％(w/v)的海藻酸钾(Mw100KDa)/0.1％(w/v)NaCl溶液中，β-葡萄糖苷酶/α-AP微胶囊与海藻酸钾溶液体积比为1∶5，反应1分钟，得到α-APA微胶囊，生理盐水洗涤3遍。

4)催化合成烷基糖苷反应：反应底物为1g葡萄糖，10ml月桂醇，2ml醋酸缓冲液(pH＝5)；催化剂为α-APA微囊化β-葡萄糖苷酶(折合为纯酶0.01g)，置于50℃水浴可合成高纯度的十二烷基糖苷。提高了催化反应速率和酶的利用率，催化剂可回收。