一种川贝母培养物快速生产中的有效除菌方法

摘要

本发明公开了一种川贝母培养物快速生产中的有效除菌方法，该方法主要是依据抗生素对细菌生长的抑制作用，通过采用特定的步骤而对快速生产川贝母培养物中的染菌材料进行除菌的，所采用的步骤包括染菌材料的选取→预处理→液体除菌→第一次固体除菌→第二次固体除菌→除菌检测。本发明能在不伤害培养物的情况下有效地清除在川贝母培养物快速生产中出现的细菌污染，其最高除菌率达92.7％。

说明书

技术领域

本发明涉及一种川贝母培养物快速生产中的有效除菌方法。

背景技术

名贵药材川贝母是百合科多年生草本植物川贝母(Fritillaria cirrhosa D.Don)的干燥鳞茎，为最常用、最有效的止咳化痰药，常用于肺热燥咳，干咳少痰，阴虚劳嗽，咯痰带血，其有效成分主要为贝母生物碱和甾体皂甙类。随着各种止咳化痰药物的开发和大量的需求，川贝母的用量不断增加，而仅靠采挖野生川贝母已远远不能满足药材市场的需求。

植物组织培养技术不但可以有效的解决药用植物对温度、土质、气候等条件的依赖，还能快速、高效的生产药用植物有效成分。自1956年Routine和Nickel首次通过植物培养生产有用次级代谢产物以来，药用植物组织培养的研究工作取得了较大的进展，已有上百种植物代谢产物通过细胞培养技术获得，近半数次级代谢产物的含量超过原植物。因此，运用现代生物技术的组织培养手段获得川贝母药材的有效组份是解决当前川贝母药材供不应求的重要途径。

经研究发现：利用组织培养技术生产川贝母培养物25天生物量可增加约3.5倍，生物碱含量是野生川贝母的2倍左右。但是，在川贝母培养物快速无菌培养生产过程中，由于一些原因会造成培养材料出现染菌的情况。由于培养材料一旦出现染菌后会严重抑制其生长和有效组份的积累，并且最终导致培养材料的死亡，从而会对快速生产造成巨大的经济损失。因此如何有效地清除川贝母培养物快速生产中出现的染菌问题具有非常重要的意义。目前所采用的解决方法一般是将染菌的材料取出后，用酒精和升汞对材料进行二次消毒处理。由于川贝母培养材料细胞幼嫩，且长期生活在人工培育的优越环境条件下，细胞抵御外界环境的能力已降低，再次经酒精和升汞消毒处理后，会造成培养材料的大量褐化、死亡。因此，当前在川贝母培养物快速生产过程中，一旦出现培养材料染菌后一般都是采取终止培养，丢弃培养物，从而造成了大量的人力、物力和财力的浪费。

发明内容

本发明的目的在于提供一种川贝母培养物快速生产中的有效除菌方法，该方法既能有效除菌，又不会造成培养材料褐化、死亡。

为达到上述目的，本发明采用的解决方法包括下列步骤：

(1)染菌材料的选取：定期观察川贝母培养材料生长状况，一旦肉眼观察到材料或培养基中有细菌产生时，即将培养材料取出；

(2)预处理：将取出的培养材料先用无菌水冲洗2～5次，并用无菌滤纸反复吸干材料表面的水分，再放入头孢噻肟钠浓度为200～500mg·L^-1的抗生素水中浸泡6～12min，其间不停振荡，取出后用无菌滤纸反复吸干材料表面的水分；

(3)液体除菌：将预处理后的材料接入含有抗生素的MS+6-BA2.0mg·L^-1+NAA 0.3mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1液体培养基中培养1～2周，摇床转速100～120r·min^-1，培养条件为每天光照8～12小时，光照强度为1000～1600lx，温度18～22℃，所述抗生素的种类及浓度为头孢噻肟钠300mg·L^-1～800mg·L^-1或头孢噻肟钠150mg·L^-1～300mg·L^-1+头孢曲松钠150mg·L^-1～300mg·L^-1；

(4)第一次固体除菌：取出经液体除菌的材料，用无菌滤纸反复吸干材料表面的水分，再接入含有与(3)步骤相同种类和浓度的抗生素的MS+6-BA 2.0mg·L^-1+NAA 0.3mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂6.5g·L^-1固体培养基中进行第一次除菌培养，培养时间为25～30天，培养条件为每天光照8～12小时，光照强度为1000～1600lx，温度18～22℃；

(5)第二次固体除菌：取出经(4)步骤除菌后的材料，转接入含有与(4)步骤相同种类但浓度减半的抗生素的MS+6-BA 2.0mg·L^-1+NAA 0.3mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂6.5g·L^-1固体培养基中进行第二次除菌培养，培养时间为25～30天，培养条件为每天光照8～12小时，光照强度为1000～1600lx，温度18～22℃；

(6)除菌检测：取出经(5)步骤除菌后的材料，转接入无抗生素的MS+6-BA 2.0mg·L^-1+NAA 0.3mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂6.5g·L^-1的固体培养基中进行继代培养，在培养25～30天后观察材料除菌情况，并统计除菌率，除菌率＝(除菌后无菌材料数/除菌材料总数)×100％。

本发明是依据抗生素对细菌生长的抑制作用，通过采用特定的步骤而对快速生产川贝母培养物中的染菌材料进行除菌的，所采用的头孢噻肟钠属于非口服型的第三代头孢菌素，其作用机理是通过干扰细菌细胞壁的主要成分肽聚糖的合成来实现抑制细菌生长的。所采用的具体步骤是将染菌的川贝母培养材料先用无菌水冲洗后放入抗生素水中浸泡一定时间，并用滤纸吸干水份后接入含有特定种类和浓度的抗生素的液体培养中进行液体除菌培养一定时间后，取出吸干水份再转接入含有相同种类和浓度的抗生素的固体培养基中进行第一次固体除菌培养，最后再转接入含有相同种类但浓度减半的抗生素的固体培养基中完成第二次固体除菌培养。本发明能在不伤害培养物的情况下有效地清除川贝母培养物在快速生产中出现的细菌污染，其最高除菌率达92.7％，大大地降低了川贝母培养物因染菌而造成的重大经济损失。

具体实施方式

实施例1

(1)染菌材料的选取：定期观察川贝母培养材料生长状况，一旦肉眼观察到材料或培养基中有细菌产生时，即将培养材料取出；

(2)预处理：将取出的培养材料稍作修整，然后用无菌水冲洗2～5次，并用无菌滤纸反复吸干材料表面的水分，再放入头孢噻肟钠含量为400mg·L^-1的抗生素水中浸泡10min，其间不停振荡，取出后用无菌滤纸反复吸干材料表面的水分；

(3)液体除菌：将预处理后的材料接入含头孢噻肟钠300mg·L^-1和头孢曲松钠150mg·L^-1的MS+6-BA 2.0mg·L^-1+NAA 0.3mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1液体培养基中进行除菌培养10天，摇床转速100～120r·min^-1，培养条件为每天光照8～12小时，光照强度为1000～1600lx，温度18～22℃；

(4)第一次固体除菌：取出经液体除菌的材料，用无菌滤纸反复吸干材料表面的水分，再接入含头孢噻肟钠300mg·L^-1和头孢曲松钠150mg·L^-1的MS+6-BA 2.0mg·L^-1+NAA 0.3mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂6.5g·L^-1固体培养基中进行第一次除菌培养，培养时间为25～30天，培养条件为每天光照8～12小时，光照强度为1000～1600lx，温度18～22℃；

(5)第二次固体除菌：取出经(4)步骤除菌后的材料，转接入含头孢噻肟钠150mg·L^-1和头孢曲松钠75mg·L^-1的MS+6-BA 2.0mg·L^-1+NAA 0.3mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂6.5g·L^-1固体培养基中进行第二次除菌培养，培养时间为25～30天，培养条件为每天光照8～12小时，光照强度为1000～1600lx，温度18～22℃；

(6)除菌检测：取出经(5)步骤除菌后的材料，转接入无抗生素的MS+6-BA 2.0mg·L^-1+NAA 0.3mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂6.5g·L^-1的固体培养基中进行继代培养，培养25天后统计除菌率为92.7％。

实施例2

将实施例1中的液体培养基和第一次固体除菌的培养基中的抗生素改为头孢噻肟钠600mg·L^-1，第二次固体除菌的培养基中的抗生素改为头孢噻肟钠300mg·L^-1，其它步骤同实例1，除菌率为89.4％。说明单独使用恰当浓度的头孢噻肟钠，也能实现对川贝母培养物的有效除菌。

实施例3

将实例1中的液体培养基和第一次固体除菌的培养基中抗生素改为头孢噻肟钠800mg·L^-1，第二次固体除菌的培养基中抗生素改为头孢噻肟钠400mg·L^-1，其它步骤同实例1，除菌率为91.9％；但培养材料开始出现变黄、褐化现象，且生长明显受到抑制，这说明高浓度的抗生素在除菌的同时也对培养材料有一定的毒害作用。