狗鱼幼鱼弹状病毒反转录环酶恒温扩增检测方法和试剂盒

摘要

本发明公开了狗鱼幼鱼弹状病毒(PFRV)的反转录环媒恒温扩增(RT-LAMP)检测方法和试剂盒，其中所用的外引物分别含有Seq ID No.1和Seq ID No.2所示的序列。本发明的方法和试剂盒能够特异性地检测出PFRV病毒；灵敏度高，对病毒悬液中抽提核酸的检测灵敏度为10

说明书

技术领域

本发明涉及病毒的检测方法和检测试剂盒，特别是涉及狗鱼幼鱼弹状病毒反转录环酶恒温扩增检测方法和试剂盒。

背景技术

根据国际病毒学分类委员会(International comittee on taxonomy ofviruses，ICTV)第8次报告，弹状病毒科(Rhabdoviridae)分为6个属，包括感染植物的质型弹状病毒属(Cytorhabdovirus)和核型弹状病毒属(Nucleorhabdovirus)，以及感染脊椎动物的水疱性口膜炎病毒属(Vesiculovirus)、狂犬病毒属(Lyssavirus)、短暂热病毒属(Ephemerovirus)和粒外弹状病毒属(也称非毒粒蛋白弹状病毒属)(Novirhabdovirus)，还有部分弹状病毒尚未分类，如Sigma virus，Flanders virus等。迄今报道感染鱼类的弹状病毒已有十几种，包括传染性造血器官坏死病毒(Infetioushematopoietic necrosis virus，IHNV)、病毒性出血性败血症病毒(Viralhaemorrhagic septicemia virus，VHSV)、牙鲆弹状病毒(Hirame rhabdovirus，HRV)、蛇头鱼弹状病毒(Snakehead rhabdovirus，SHRV)、鲤春病毒血症病毒(Spring viraemia of carp virus，SVCV)、狗鱼幼鱼弹状病毒(Pike fryrhabdovirus，PFRV)、弹状病毒903/87(Rhabdovirus 903/87，903/87)、鳜鱼弹状病毒(Siniperca chuatsi rhabdovirus，SCRV)、胭脂鱼弹状病毒(Chinesesucker rhabdovirus)及海鲑弹状病毒28/97(Sea trout rhabdovirus 28/97，STRV)等(Granoff and Webster，1999；张奇亚和李正秋，1999；Zhang et al.，2000；Johansson et al.，2001，2002)。在ICTV第6次报告上，SVCV，PFRV被列为水疱性口膜炎病毒属暂定种(Wunner et al.，1995)。在ICTV第7次报告中，正式把IHNV、VHSV、HRV、SHRV列为粒外弹状病毒属，SVCV、PFRV等仍归为水疱性口膜炎病毒属的暂定种(Walker et al.，2000)。其他鱼类弹状病毒的分类地位尚未确定。

随着鱼类养殖业的快速发展，鱼类病毒病已成为养殖鱼类的最大病害。由于缺乏有效的治疗方法，鱼类病毒性疾病的控制以预防为主，因而病毒的诊断与检测技术研究成了鱼类病毒研究中非常活跃的领域。鱼类弹状病毒有很强的致病性，特别是VHSV、IHNV、HRV、SHRV和SVCV在世界各地广泛流行，给水产养殖业造成重大的经济损失。因而这些病毒的流行病学备受科研工作者的关注。

狗鱼幼鱼弹状病毒(PFRV)是一种与鲤春病毒血症病毒(SVCV)同源性很高的病毒，目前还未引起人们高度重视。PFRV主要在欧洲狗鱼幼鱼中流行(Wolf，1988)。1972年该病毒在荷兰感染狗鱼幼鱼，引起大规模死亡，第一株PFRV从此批患病的狗鱼幼鱼中分离出来(De Kinkelin，1973)。PFRV与SVCV亲缘关系最近，G蛋白的同源性＞70％。对PFRV、SVCV及与它们血清学相关的鱼类弹状病毒G蛋白部分核苷酸序列进行系统进化分析，结果显示它们形成4个基因型，PFRV和SVCV分别形成一个基因型，分别为基因型III和I，其他病毒形成基因型II和IV(Stone et al.，2003)。SVC主要感染鲤科鱼类，被世界动物卫生组织列为必须申报的疾病，中国农业部将SVC列为二级动物疫病。随着对SVC的日益重视，对SVCV监控力度的加大，这些与SVCV亲缘关系高的病毒也将会越来越引起人们的重视。因而寻找特异、灵敏快速的检测方法，对于防控疾病的发生和发展十分关键。

在中国，鱼类病毒SVCV已经引起人们高度的重视，并于每年春秋两季对全国鲤鱼进行SVCV监测。但是与SVCV亲缘关系很高的鱼类病毒PFRV目前还没有引起人们的重视，没有纳入检测的范围。随着与这2种病毒血清学相关的病毒相继分离(Ahne，1975；Ahne et al.，1982；Fijan et al.，1984；Ahne and Thomsen，1986；Haenen and Davidse，1989；Jorgensen et al.，1989；Rowley et al.，2001；Stone et al.，2003；Way et al.，2003)，人们对这些病毒的关注会越来越多。因而需要建立切实可行的检测方法。

目前，鉴定PFRV及与其血清学相关的病毒一般采取先用敏感细胞分离，然后用血清学方法鉴定的方式(De Kinkelin，1973；Ahne，1975；Ahne etal.，1982；Fijan et al.，1984；Ahne and Thomsen，1986；Haenen and Dayidse，1989；Jorgensen et al.，1989；Rowley et al.，2001；Stone et al.，2003；Way et al.，2003)。采用这种检测方式不仅周期长，而且使用免疫学方法，如间接荧光抗体试验或酶联免疫吸附试验，PFRV与SVCV之间存在交叉反应(et al.，1989；Way，1991)，检测结果不准确。

环媒恒温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是2000年报导的一种新颖核酸扩增技术(Notomi et al.，2000)。该技术针对DNA靶序列的6个区域设计4条特异引物，包含1对内引物和1对外引物，内引物包括前内引物FIP(Forward inner primer)和后内引物BIP(Backward inner primer)，外引物包括F3和B3，如图1A所示。FIP由2条引物组成，分别是F1C(靶基因F1序列的互补序列)和F2(与靶序列序列相同)，TTTT链接F1C和F2，同理BIP由B1C-TTTT-B2构成，TTTT作为连接核苷酸可有可无，当形成的环不够30个核苷酸时，增加4个核苷酸可增加环的长度。外引物B3和F3识别区域位于内引物外侧，分别与靶序列B3C、F3C互补。设计引物时还注意一个原则，扩增区段F2-R2最好控制在200个核苷酸以内。LAMP法扩增的机制(如图1B所示)：1、引物BIP中的B2(B2c的互补序列)与模板DNA中B2c结合，起始互补链的合成；2、B3(B3c的互补序列)与B3c结合，启动链置换反应；3、链置换反应产生1对双链和1条单链，单链两端有互补核苷酸，形成哑铃状；4、引物BIP中的B2与双链茎环结构DNA的环上的B2c合成一种有缺口的过渡性茎环结构DNA；5、在过渡性茎环结构的茎上含有1对反向互补序列，在对面的末端，通过FIP形成1个环状结构。在随后的自我引物置换延伸合成过程中，在内引物作用下，开始循环反应，茎的长度和环的个数都逐渐增加，最后的产物为不同长度的茎环DNA组成的混合物。

扩增产物可以通过3种方法来判断：1、琼脂糖凝胶电泳；2、扩增产物中加双链DNA染料SYBR Green I；3、肉眼观察扩增负产物焦磷酸镁白色沉淀。LAMP法具有许多其他PCR方法无法比拟的优点。1、只需要保持60℃-65℃的恒定温度就能进行扩增反应，因此无需昂贵的设备，一般的恒温装置如水浴锅或恒温箱就能满足扩增要求；2、针对靶序列的6个区段设计4条引物，扩增的特异性比其他的PCR方法进一步提高；3、整个扩增在1h左右即可完成，且产率可达到0.15mg/mL，扩增效率大大提高。4、进行RT-LAMP时，在增加反转录酶和RNA酶抑制剂后，不需要专门设计反转录的时间，整个反应的时间也不需要增加，进一步提高检测的效率；5、在核酸大量合成时，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg²⁺结合，产生副产物——焦磷酸镁沉淀，由于扩增效率高，产生的焦磷酸镁沉淀多，用肉眼观察或浊度仪检测浊度就能够判断是否扩增。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种狗鱼幼鱼弹状病毒的反转录环媒恒温扩增(RT-LAMP)检测方法。

本发明的另一目的在于提供一种狗鱼幼鱼弹状病毒的检测试剂盒。

为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明公开了狗鱼幼鱼弹状病毒(Pike fry rhabdovirus，PFRV)的反转录环媒恒温扩增检测方法，所述方法包括利用特异性引物，以病毒基因组RNA为模板进行反转录环媒恒温扩增反应，所述特异性引物包括一对内引物和一对外引物，所述外引物分别含有Seq ID No.1和Seq ID No.2所示的序列，

Seq ID No.1：5’---CAATTTGGCTAACAGATCATATCCT---3’

Seq ID No.2：5’---TTCTCGATCCAGTCTCCACG---3’。

所述内引物包括前内引物FIP和后内引物BIP，

所述前内引物FIP优选含有Seq ID No.3和Seq ID No.4所示的序列，Seq ID No.3和Seq ID No.4之间通过0～4个碱基相连；

所述后内引物BIP优选含有Seq ID No.5和Seq ID No.6所示的序列，Seq ID No.5和Seq ID No.6之间通过0～4个碱基相连；

Seq ID No.3：5’---GAGCATTTCCATACATGGTCCC---3’

Seq ID No.4：5’---GAGGAATGCGACCAACACATC---3’

Seq ID No.5：5’---CAAGTTCCAAGATGCCTGTCG---3’

Seq ID No.6：5’---CTTGATTCCATCCATCCCAC---3’。

在本发明优选的实施方式中，所述外引物分别具有Seq ID No.1和SeqID No.2所示的序列，

所述前内引物FIP的序列为：

GAGCATTTCCATACATGGTCCCGAGGAATGCGACCAACACATC

Seq ID No.3       Seq ID No.4

所述后内引物BIP的序列为：

CAAGTTCCAAGATGCCTGTCGTTTTCTTGATTCCATCCATCCCAC

Seq ID No.5       Seq ID No.6

所述反转录环媒恒温扩增反应的恒温温度优选为59℃～65℃，更优选63℃，反应的时间优选为30min-120min，更优选60min。

本发明还公开了一种狗鱼幼鱼弹状病毒(Pike fry rhabdovirus，PFRV)的检测试剂盒，所述试剂盒包括分别含有Seq ID No.1和Seq ID No.2所示序列的一对引物，

Seq ID No.1：5’---CAATTTGGCTAACAGATCATATCCT---3’

Seq ID No.2：5’---TTCTCGATCCAGTCTCCACG---3’。

所述检测试剂盒优选用于反转录环媒恒温扩增反应，且所述引物为外引物。

所述检测试剂盒优选还含有一对内引物，所述内引物包括前内引物FIP和后内引物BIP，

所述前内引物FIP优选含有Seq ID No.3和Seq ID No.4所示的序列，Seq ID No.3和Seq ID No.4之间通过0～4个碱基相连；

所述后内引物BIP优选含有Seq ID No.5和Seq ID No.6所示的序列，Seq ID No.5和Seq ID No.6之间通过0～4个碱基相连；

Seq ID No.3：5’---GAGCATTTCCATACATGGTCCC---3’

Seq ID No.4：5’---GAGGAATGCGACCAACACATC---3’

Seq ID No.5：5’---CAAGTTCCAAGATGCCTGTCG---3’

Seq ID No.6：5’---CTTGATTCCATCCATCCCAC---3’。

上述0～4个碱基作为连接核苷酸可有可无，当形成的环不够30个核苷酸时，所增加的0～4个核苷酸可增加环的长度，所述0～4个碱基优选为TTTT。

在本发明优选的实施方式中，所述外引物分别具有Seq ID No.1和SeqID No.2所示的序列，

所述前内引物FIP的序列为：

GAGCATTTCCATACATGGTCCCGAGGAATGCGACCAACACATC

Seq ID No.3            Seq ID No.4

所述后内引物BIP的序列为：

CAAGTTCCAAGATGCCTGTCGTTTTCTTGATTCCATCCATCCCAC

Seq ID No.5            Seq ID No.6

由于采用了以上技术方案，使本发明具备的有益效果在于：

本发明的反转录环媒恒温扩增(RT-LAMP)检测方法和试剂盒用于检测PFRV时，由于独特的引物设计使得检测方法拥有很好的特异性，用于检测IHNV、SVCV、VHSV、VNNV、IPNV、HRV和PFRV时，只有PFRV的检测结果为阳性。本发明的方法和试剂盒灵敏度高，对病毒悬液中抽提核酸的检测灵敏度为10^0.5TCID_50’比RT-PCR的灵敏度高100倍，比实时荧光RT-PCR的灵敏度高10倍。本发明的方法和试剂盒检测时间短，RT-LAMP反应时间只需要1h，比实时荧光(1.5h-2h)和RT-PCR(2h-3h)耗时更短。应用LAMP技术需要的仪器也不高，一般的PCR仪或恒温设备如水浴锅或恒温箱就可以进行反应。

附图说明

图1为LAMP反应过程原理图，其中A为LAMP引物位置示意图，B为LAMP反应过程示意图。

图2为本发明的一种RT-LAMP引物在PFRV基因组中的位置示意图。

图3A为本发明的RT-LAMP的温度优化试验结果电泳图像；1：MarkerDL2000；2：59℃；3：60℃；4：61℃；5：62℃；6：63℃；7：64℃；8：65℃。

图3B为本发明RT-LAMP温度优化扩增产物在ABI7500的溶解曲线。

图4A为本发明RT-LAMP的时间优化试验结果电泳图像；1：MarkerDL2000；2：30min；3：45min；4：60min；5：90min；6：120min。

图4B为本发明RT-LAMP时间优化扩增产物在ABI7500的溶解曲线。

图5为不同RT-LAMP结果观察方法的比较，A、凝胶电泳，B、PicoGreen染色(1为翠绿色)，C溶解曲线。

图6为本发明PFRV RT-LAMP检测的特异性试验结果电泳图像；1：PFRV；2：HRV；3：IHNV；4：VHSV；5：SVCV；6：IPNV；7：VNNV；8：Negativecontrol；9：Marker DL2000。

图7为本发明PFRV RT-LAMP灵敏度试验结果电泳图像；1：MarkerDL2000，2：10⁰；3：10^-1；4：10^-2；5：10^-3；6：10^-4；7：10^-5；8：10^-6；9：Negativecontrol。

图8为PFRV引物F2/R2RT-PCR灵敏度实验结果电泳图像；1：DNAMarker；2：10⁰；3：10^-1；4：10^-2；5：10^-3；6：10^-4；7：10^-5；8：10^-6；9：Negativecontrol。

图9为PFRV实时荧光RT-PCR检测的灵敏度实验结果图。

具体实施方式

实施例1

1材料和方法

1.1病毒及细胞

PFRV为F4株，由中国科学院水生生物研究所赠送，SVCV和IHNV参考株由英国CEFAS的OIE参考实验室B.Hill教授惠赠；VHSV参考株由挪威国家兽医研究所OIE参考实验室Roar Gudding博士惠赠、IPNV、HRV、VNNV由本室分离。

IHNV、SVCV、VHSV、VNNV、IPNV、HRV和PFRV分别用EPC、CO、RTG-2、SSN-1、CHSE-214、FHM和BF-2细胞扩增。SSN-1细胞购自泰国Kasetsart大学水生动物健康研究所，RTG-2细胞由水生生物研究所赠送，BF-2细胞由检疫研究所(布雷西亚)细胞保藏中心赠送，CHSE-214细胞、EPC细胞由英国环境、渔业和水产养殖科学研究中心赠送、FHM细胞由德国慕尼黑大学和中国科学院水生生物研究所赠送，CO细胞由中国科学院水生生物研究所赠送。

EPC、CO、CHSE-214、FHM、BF-2和RTG-2细胞均用含10％胎牛血清的199培养液培养，SSN-1细胞用含10％FBS的L-15培养液培养。接种病毒后，用加抗生素(100IU/mL青霉素；100μg/mL链霉素)的相应培养液培养。

1.2设备与试剂

设备：ABI7500荧光定量PCR，Eppendorf PCR仪，BDA TI1型凝胶成像仪(Biometra)。

试剂：MgSO₄、Betaine、荧光染料PicoGreen购于美国Invitrogen公司；Bst DNA聚合酶大片段及10×ThermoPol反应缓冲液(100mmol/L KCl，200mmol/L Tris-HCl，100mmol/L(NH4)₂SO₄，20mmol/L MgSO₄，1％TritonX-100，pH 8.8，25℃)购于纽英伦生物技术有限公司(NEB)；反转录酶、核酸抑制剂购自大连宝生物公司；实验所用水均为DEPC处理水；实验器皿均经过高温灭菌2次。

1.3RT-LAMP引物的设计

根据Genbank中PFRV G基因(AJ538069)，使用Primer Explore V3和Primer Premier 5.0软件针对其中的6个区域设计2对引物，即1对外引物，1对内引物。由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物序列见表1。引物在PFRV基因组中的位置及扩增原理示意图见图2。

表1PFRV RT-LAMP检测引物

 引物  序列5’-------3’ PFRV F3  CAATTTGGCTAACAGATCATATCCT    (Seq ID No.1) PFRV B3  TTCTCGATCCAGTCTCCACG         (Seq ID No.2) PFRV FIP  GAGCATTTCCATACATGGTCCC GAGGAATGCGACCAACACATC  F1c(Seq ID No.3)           F2(Seq ID No.4) PFRV BIP  CAAGTTCCAAGATGCCTGTCGTTTTCTTGATTCCATCCATCCCAC  B1c(Seq ID No.5)           B2(Seq ID No.6)

内引物FIP和BIP分别含有2条不同的序列，分别为F1c+F2和B1c+TTTT+B2。

1.4病毒核酸的提取

参照TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit的说明书进行操作。

1.5病毒滴度的测定

病毒滴度测定采用终点稀释法，参考Reed和Muench(1938)的方法。具体方法如下：

1)传BF-2细胞入96孔板，置于25℃培养箱培养(＜24h)；

2)10倍系列稀释待测病毒；

3)将各稀释度的病毒悬液接种到细胞长成单成的96孔板中，每稀释度加3孔，每孔加100μL，对照组加100μL培养液；

4)将96孔板置于适宜温度培养箱中培养，直至CPE完全；

5)倒置显微镜下观察，计算病毒滴度(TCID₅₀/0.1mL)。

1.6 RT-LAMP反应条件的优化

RT-LAMP采用25μL反应体系，加入的组分剂量如下：

  10×Bst Buffer  2.5μL  dNTP(10mM/L each)  3.5μL  MgSO₄(25μmol/μL)  0.6μL  PFRV F3(5pmol/μL)  1μL  PFRV B3(5pmol/μL)  1μL  PFRV FIP(40pmol/μL)  1μL  PFRV BIP(40pmol/μL)  1μL  Betaine(5M)  5μL

  RNasin(40U/μL)  1μL  AMV RTase XL(5U/μL)  1μL  Bst DNA polymerase(8U/μL)  1μL  RNA  1μL  DEPC dH₂O  5.4μL  Total  25μL

对RT-LAMP的扩增条件进行优化，采用相同模板、相同的组份配置，分别在不同的温度下(59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃和65℃)恒温反应1h，以确定最佳反应温度；采用相同模板、相同的组份配置，在优化的温度下分别恒温反应30min、45min、60min、90min和120min，以确定最佳反应时间。

在温度优化和时间优化试验的RT-LAMP产物中加入PicoGreen后放到ABI7500实时荧光PCR仪上作溶解曲线，以帮助判断扩增产物的相对量。

1.7RT-LAMP结果观察

扩增结果使用3种方法进行观察。

方法1：取扩增产物8μL进行凝胶电泳，然后溴化乙锭染色，紫外投射灯下观察，靠近点样孔出现拖尾，远离点样孔出现梯度条带的样品判为阳性；

方法2：在反应管中加入双链DNA(dsDNA)染料PicoGreen，出现翠绿颜色的样品判为阳性；

方法3：将PicoGreen染色的样品放到ABI7500上作溶解曲线，呈现平直线的样品为阴性，出现单峰的样品为阳性，本文引入此方法显示扩增产物的相对量。

1.8RT-LAMP的特异性试验

提取PFRV、HRV、IHNV、VHSV、SVCV、IPNV和VNNV核酸作为模板进行PFRV RT-LAMP检测，观察结果确定引物的特异性。

1.9RT-LAMP的灵敏度试验及与RT-PCR、实时荧光RT-PCR灵敏度的比较

取PFRV病毒液250μL，提取病毒RNA，作10倍系列稀释，取每个梯度稀释液1μL作为模板进行RT-LAMP，确定建立RT-LAMP检测方法的灵敏度。同时进行RT-PCR和实时荧光RT-PCR，比较PFRV 3种检测方法的灵敏度。

2结果

2.1病毒滴度测定结果

采用Reed-Muench氏方法计算PFRV的病毒滴度为10^5.5TCID₅₀/0.1mL。

2.2RT-LAMP反应条件优化

对RT-LAMP反应温度进行优化，在反应完成的反应管中加入染料PicoGreen后放到ABI7500作溶解曲线分析，并进行凝胶电泳，电泳结果表明，在59℃-65℃的温度范围内，特征电泳条带均很亮，达到检测的要求(图3A)；溶解曲线结果表明，从59℃到63℃随反应温度的升高，扩增产物逐渐增多，而63℃到65℃随反应温度的升高，扩增的产物反而逐渐减少(图3B)。因而可以确定63℃为最佳反应温度。在63℃恒温条件下进行RT-LAMP优化反应时间，将扩增产物进行溶解曲线和凝胶电泳分析，电泳结果表明，在30min-120min时间范围内，均能看到特征条带，反应时间为30min和45min时，产生引物二聚体，表明有引物剩余，反应不充分、反应时间为60min、90min和120min时，均未发现引物二聚体(图4A)；从溶解曲线的结果看出，反应时间为30min-60min，随着时间的增加，扩增产物大幅度增加，但是在60min之后产物的增加有限(图4B)。为了节省时间，选择60min为反应时间。因此确定RT-LAMP反应的最佳条件为63℃恒温反应60min。

2.3不同的结果观察方法比较

将1个阳性样品和1个阴性样品按优化后的RT-LAMP反应程序进行反应，通过凝胶电泳(图5A)、染料PicoGreen染色(图5B)及PicoGreen染色后到ABI7500上作溶解曲线(图5C)的结果比较来判定这些方法的可行性。结果表明，用这些方法判定RT-LAMP的扩增产物，获得一致的结果，阳性和阴性之间的区别十分明显，可以把这些方法作为RT-LAMP扩增结果判定的可信方法。

2.4 RT-LAMP的特异性试验

提取PFRV、HRV、IHNV、VHSV、SVCV、IPNV和VNNV核酸作为模板进行PFRV RT-LAMP反应，验证建立的RT-LAMP方法检测PFRV的特异性，结果表明，本文建立的RT-LAMP方法只能对PFRV进行特异的扩增，见图6。

2.5 RT-LAMP的灵敏度试验及与RT-PCR、实时荧光RT-PCR灵敏度的比较

取滴度为10^5.5TCID₅₀/0.1mL的PFRV病毒悬液250μL抽提，加25μLDEPC水溶解，取10μL核酸10倍系列稀释，每稀释度取1μL采用优化后的反应条件进行RT-LAMP，检测结果为阳性的最大稀释度为10^-4(图7)，相应的灵敏度为10^0.5TCID₅₀。同时进行RT-PCR和实时荧光RT-PCR，结果发现取样10μL进行RT-PCR和实时荧光RT-PCR，检测结果为阳性的最大稀释度分别为10^-3(图8)和10^-4(图9)，相应的灵敏度分别为10^2.5TCID₅₀和10^1.5TCID₅₀。

3讨论

在中国，鱼类病毒SVCV已经引起人们高度的重视，并于每年春秋两季对全国鲤鱼进行SVCV监测。但是与SVCV亲缘关系很高的鱼类病毒PFRV目前还没有引起人们的重视，没有纳入检测的范围。随着与这2种病毒血清学相关的病毒相继分离(Ahne，1975；Ahne et al.，1982；Fijan et al.，1984；Ahne and Thomsen，1986；Haenen and Davidse，1989；Jorgensen et a1.，1989；Rowley et al.，2001；Stone et al.，2003；Way et al.，2003)，人们对这些病毒的关注会越来越多。因而需要建立切实可行的检测方法。

本发明针对PFRV G基因200bp以内的6个区域设计了2对引物，独特的引物设计使得这种检测方法拥有很好的特异性，特异性试验也验证了这一点。应用建立的RT-LAMP方法检测PFRV，灵敏度比RT-PCR高100倍，比实时荧光RT-PCR高10倍，可以用于鱼类潜在感染PFRV的检测。RT-LAMP反应时间只需要1h，比实时荧光(1.5h-2h)和RT-PCR(2h-3h)耗时更短。应用LAMP技术需要的仪器也不高，一般的PCR仪或恒温设备如水浴锅或恒温箱就可以进行反应，因而该技术有很好的应用前景。

从电泳图片我们不难看出使用LAMP技术进行扩增，产物量比一般的PCR产物量多出许多倍，因而如何观察扩增结果，避免气溶胶污染显得非常重要。目前有3种方法观察扩增结果，肉眼观察焦磷酸镁白色沉淀；双链DNA染料染色和凝胶电泳。这3种方法在临床使用时均有缺点。肉眼观察焦磷酸镁白色沉淀有主观的误差，可能出现误判，使用仪器测定浊度会比较准确。已有文献报道使用能观察浊度的恒温仪器进行LAMP，对扩增过程产生的沉淀进行实时观察(Parida et al.，2004，2006，2007；Fukuda etal.，2006)。采用染料染色和凝胶电泳的结果判定方式，均需要打开试管盖，容易形成气溶胶，加上这种方法的灵敏度也很高，很容易使此后的检测出现假阳性。因而LAMP成为临床检测方法的前提是观察扩增结果时不需要打开试管盖，另外，最好采用仪器观测浊度或加入染料后的颜色变化，避开人为因素导致的误判。在临床应用中不推荐使用凝胶电泳的产物观察方法。

4小结

依据PFRV G基因6个区域，设计了1套LAMP引物(2条内引物，2条外引物)；对反应温度及时间进行优化，确定最优反应条件为63℃反应60min。按照优化好的RT-LAMP条件进行特异性试验和灵敏度试验，结果显示：检测IHNV、SVCV、VHSV、VNNV、IPNV、HRV和PFRV时，只有PFRV的检测结果为阳性；对病毒悬液中抽提核酸的检测灵敏度为10^0.5TCID₅₀，比RT-PCR的灵敏度高100倍，比实时荧光RT-PCR的灵敏度高10倍。

实施例2

一种狗鱼幼鱼弹状病毒(Pike fry rhabdovirus，PFRV)的检测试剂盒，该试剂盒包括以下两对引物：

  引物  序列5’-------3’  PFRV F3  CAATTTGGCTAACAGATCATATCCT    (Seq ID No.1)  PFRV B3  TTCTCGATCCAGTCTCCACG         (Seq ID No.2)  PFRV  FIP  GAGCATTTCCATACATGGTCCC GAGGAATGCGACCAACACATC  Flc(Seq ID No.3)           F2(Seq ID No.4)  PFRV  BIP  CAAGTTCCAAGATGCCTGTCGTTTTCTTGATTCCATCCATCCCAC  B1c(Seq ID No.5)           B2(Seq ID No.6)

内引物FIP和BIP分别含有2条不同的序列，分别为F1c+F2和B1c+TTTT+B2。该试剂盒还包括使用说明书。该试剂盒可用于狗鱼幼鱼弹状病毒的RT-LAMP检测。

以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

附1病毒缩略语表

  缩略词  英文名  中文名  PFRV  Pike fry rhabdovirus  狗鱼幼鱼弹状病毒

  IHNV  Infetious hematopoietic necrosis  传染性造血器官坏死病毒  IPNV  Infectious pancreatic necrosis virus  传染性胰脏坏死病毒  SVCV  Spring viraemia of carp virus  鲤春病毒血症病毒  VHSV  Viral haemorrhagic septicemia virus  病毒性出血败血症病毒  VNNV  Viral nervous necrosis virus  病毒性神经坏死病毒  HRV  Hirame rhabdovirus  牙鲆弹状病毒

附2细胞及其他缩略语表

  缩略词  英文名  中文名  BF-2  Blue gill fry  铜吻磷鳃太阳鱼成纤维细胞  CO  Overy of grass carp  草鱼性腺细胞  CHSE-214  Chinook salmon embryo  大鳞大麻哈鱼胚胎细胞  EPC  Epithelioma papulosum cyprini  鲤鱼上皮瘤细胞  FHM  Fathead minnow  海水鲤科鱼类细胞  GCF  Grass carp fin  草鱼鳍条细胞  PG  Pike gonad  狗鱼性腺细胞  SSN-1  Stripped snakehead  纹醴细胞  N  Nucleoprotein  核蛋白  P  Phosphoprotein  磷酸化蛋白  M  Matrix protein  基质蛋白  G  Glycoprotein  糖蛋白  L  RNA-dependent RNA polymerase  RNA依赖的RNA聚合酶  NV  Non-virion  非毒粒蛋白  ELISA  Enzyme-linked immunosorbent assay  酶联免疫吸附试验

  RT-PCR  Reverse transcription polymerase chain  反转录聚合酶链式反应  LAMP  Loop-mediated isothermal amplification  环媒恒温扩增  FIP  Forward inner primer  前内引物  BIP  Backward inner primer  后内引物  RACE  Rapid-amplification of cDNA ends  cDNA末端快速扩增  IUdR  5-iodo-2’-deoxyuridine  5’-碘-2’-去氧尿嘧啶

序列表

<110>深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心

<120>狗鱼幼鱼弹状病毒反转录环酶恒温扩增检测方法和试剂盒

<130>DHC0910507

<160>6

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

caatttggct aacagatcat atcct    25

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

ttctcgatcc agtctccacg          20

<210>3

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

gagcatttcc atacatggtc cc       22

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

gaggaatgcg accaacacat c        21

<210>5

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

caagttccaa gatgcctgtc g        21

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

cttgattcca tccatcccac          20