一种来源于拟南芥的抗盐、抗干旱的CPK蛋白激酶基因

摘要

本发明公开了一种来源于拟南芥的抗盐、抗干旱的CPK蛋白激酶基因。所述CPK蛋白激酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No 1所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No 2所示。该基因长1635bp，含544个氨基酸，是AtCPK6基因。本发明的CPK蛋白激酶基因用于植物转化，以提高植物对盐、干旱的耐受性。

说明书

技术领域

本发明属作物遗传育种领域，具体涉及一种来源于拟南芥的抗盐、抗干旱的CPK蛋白激酶基因。

背景技术

高等植物与动物不同，其中最重要的一点是它们更容易受到外界环境的影响。在长期的进化与驯养中，植物渐渐形成了一套适应环境变化的机制。这些机制涉及到解剖学、生理学、生化学、遗传学、发育学、进化学、分子生物学等许多范畴，其中分子生物学在植物应对环境变化的机制中是最重要的，这个多维的网络调控系统涉及到基因表达与调控的各个水平，包括环境信号的识别、信号转导、信号输出、信号响应和表型变化等。生物体内普遍存在的信号转导调节方式是蛋白激酶(protein kinase)和蛋白磷酸酶(proteinphosphatase)催化蛋白质磷酸化与去磷酸化，这一过程几乎涉及所有的生理及病理过程，如糖代谢、光合作用、细胞的生长发育、基因表达、神经递质的合成与释放，甚至癌变等等，在细胞信号转导过程中占有极其重要的位置。

拟南芥(Arabidopsis thaliana)，十字花科植物。因其植株小、生长发育周期短、种子多、基因组小、自花授粉、基因高度纯合等优点，被选作模式植物，是植物生理研究中的重要试才。常用的生态型有三种：Landsberg erecta(Ler)，Columbia(Col)，Wassilewak(Ws)，其中Col的全基因组测序已经完成，所以，对它的各种宏观生理研究都可以十分方便地与微观的分子水平的研究相联系。

钙依赖型蛋白激酶(Ca²⁺-dependent Protein Kinase，CPK)是植物蛋白激酶的研究热点，它广泛分布于植物、藻类和一些原生动物中，但在细菌、真菌和高等动物中尚未发现。CPKs在植物体内分布广泛：在器官水平上，根、茎、叶、花、果实和种子中无处不在；在细胞水平上，分生细胞、木质部细胞、花粉细胞、保卫细胞和胚细胞中均有发现；在亚细胞水平上，质膜、液泡膜、线粒体外膜、叶绿体类囊体膜、内质网膜等膜系统和胞质、核质中均有踪迹。CPKs在植物钙信号转导过程中具有非常重要的作用。植物细胞在外界(非生物和生物)刺激下，细胞内Ca²⁺浓度发生瞬间、持续或振荡变化。细胞内Ca²⁺浓度的变化通过Ca²⁺结合蛋白(CPK)进行识别、放大和向下游传导。通过一系列的级联传导，从而出现细胞分裂、细胞伸长、气孔运动、各种胁迫反应以及生长发育等过程。参与环境胁迫信号的转导是CPKs的重要作用之一。干旱、冷害、盐害、营养饥饿、光、低渗透等多种环境因子都能引起CPKs基因的特异性表达和CPKs mRNA的特异性积累。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种来源于拟南芥的抗盐、抗干旱的CPK蛋白激酶基因，进一步将其应用于植物转化，以提高植物对盐、干旱的耐受性。

本发明采用以下技术方案来实现上述目的：

一种来源于拟南芥的抗盐、抗干旱的CPK蛋白激酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID No 1所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No 2所示。

所述CPK蛋白激酶基因的制备方法如下：

设计一对引物(AtCPK6-F：5’-AAGGATCCATGGGCAATTCATGTCGTGG-3’和AtCPK6-R：5’-AAGAGCTCTA CACATCTCTCATGCTG-3’)，为了克隆鉴定等构建需要，引物两端分别引入Bam H I和Sac I的酶切位点。

PCR反应体系：10×PCR buffer 5.0μl；dNTPs(各2.5mM)4μl；拟南芥cDNA模版1μl(20ng)；引物AtCPK6-F 0.5μl；引物AtCPK6-R 0.5μl；Ex-Taq0.4μl(预变性后加入)；加无菌水定容至50μl。

PCR反应程序：94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸2min，共扩增30个循环，再72℃延伸10min。

所得PCR产物经琼脂糖凝胶回收后，克隆到大连宝生物工程有限公司的pMD-18-Simple T载体上进行克隆鉴定和序列测定。结果发现：该基因为CPK蛋白激酶AtCPK6基因，长1635bp，编码的蛋白质含544个氨基酸。

转AtCPK6基因的拟南芥植株与野生型植株相比，前者对盐、干旱的耐受性明显提高。盐处理后，转AtCPK6基因的拟南芥植株平均成活率为78.8％，野生型植株为12.3％；干旱处理后，转AtCPK6基因的拟南芥植株平均成活率为70.8％，野生型植株为14.1％。

有益效果：

本发明克隆了拟南芥CPK蛋白激酶基因，即AtCPK6基因。对该转AtCPK6基因的拟南芥植株和野生型拟南芥植株盐、干旱胁迫的耐受性试验结果表明：野生型和转AtCPK6基因拟南芥植株在存活率上有明显的差异，转基因植株比野生型有明显的抗盐、抗干旱能力，这也表明本发明的AtCPK6基因的转入提高了拟南芥植株的抗盐、抗干旱的能力。

附图说明

图1为琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA产物的结果。

图2为PCR扩增所得序列为SEQ ID No 1的AtCPK6基因电泳图，其中1为PCR扩增得到的CPK蛋白激酶基因，2为DNA Marker。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但不限制本发明。

下述实施例中，所用的试验材料及其来源包括：

拟南芥(Arabidopsis thaliana ecotype Columbia)的种子经过5％(v/v)漂白粉消毒后种植在黑土∶珍珠岩∶蛭石(3∶1∶9)混合基质中，22℃、16h光照培养(16h光照，8h黑暗，冷光源)生长20d。

大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α由上海市农业科学院生物技术研究所植物基因工程研究室保存。植物RNA小量抽提试剂盒购自杭州维特洁生化技术有限公司。克隆载体Pmd-18-Simple T、各类限制性内切酶、Taq聚合酶、连接酶、dNTP、10×PCR buffer和DNA marker购自宝生物工程大连有限公司。所有的化学试剂都从美国西格玛化学公司和上海国药化学试剂公司购买。ABI PRIAM Bio-DyeTerminator DNA测序试剂盒购自美国应用系统公司。

下述实施例中常规的基因操作参照分子克隆文献进行【Sambook J，FretsE F，Mannsdes T et al.In：Molecular Cloning.2nd ed.Cold Spring HarborLaboratory Press，1989】。

实施例1

拟南芥幼苗RNA的抽提和cDNA合成

(一)试验方法：

1.RNA抽提及基因组DNA的去除

称取0.1g植物材料倒入液氮使材料保持冻结和易碎的状态，研磨。

研磨后的细粉转移至试剂盒中的缓冲液中，并按试剂盒操作说明提取RNA。

RNA沉淀用50μl DEPC处理的去离子水轻柔溶解，用氯仿-异戊醇混合液抽提，以除去残留的少量基因组DNA，4℃，12000g离心30min。

上清液转移至另一新的管子，加入2倍体积-20℃冰冷的无水乙醇，充分混合，放置在-20℃条件下2h，沉淀总RNA。

12000g，4℃离心30min，用75wt％乙醇漂洗两次，保留RNA，真空风干。

用20μlDEPC处理的去离子水重新熔解，取少量用于RNA质量和浓度的检测，其余储存与-70℃，备用。

2.cDNA合成

加入Oligo(dT)20(10pmol/μl)1μl；总RNA：10-100ng；补足RNase Free H₂O到12μl。

65℃，5min后，立即置于冰上。

再加入5×RT Buffer 4μl；dNTP Mixture(各10mM)2μl；RNase Inhibitor(10U/μl)1μl；反转录酶1μl。

反转录反应程序为：30℃10min；42℃20min；85℃5min；4℃5min。瞬间离心，保存。

(二)试验结果：

采用琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA产物的结果见图1，图中可见明显的RNA条带。

实施例2

PCR方法获得拟南芥抗盐、抗干旱的CPK蛋白激酶(AtCPK6)基因片段

(一)试验方法：

本发明设计一对引物(AtCPK6-F和AtCPK6-R)，为了克隆鉴定等构建需要，引物两端分别引入Bam H I和Sac I的酶切位点。

PCR反应体系：10×PCR buffer 5.0μl；dNTPs(各2.5mM)4μl；拟南芥cDNA模版1μl(20ng)；引物AtCPK6-F 0.5μl；引物AtCPK6-R 0.5μl；Ex-Taq0.4μl(预变性后加入)；加无菌水定容至50μl。

PCR反应程序：94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸2min，共扩增30个循环，再72℃延伸10min。

(二)试验结果：

经过1.0wt％的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物为一条约1600bp的片段(参见图2)。

实施例3

克隆鉴定、序列测定

(一)试验方法：

扩增片段采用杭州维特洁生化技术有限公司DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒回收后克隆到大连宝生物工程有限公司的pMD-18-Simple T载体上进行克隆鉴定和序列测定。

本发明通过核苷酸序列测定分析，最终获得拟南芥抗盐、抗干旱蛋白激酶AtCPK6基因，其碱基和氨基酸序列信息如SEQ ID No 1和SEQ ID No 2所示。

(二)试验结果：

测序分析结果显示：拟南芥抗盐、抗干旱的AtCPK6蛋白激酶基因编码阅读框长1635bp，编码的蛋白质含544个氨基酸。

实施例4

拟南芥转化

(一)试验方法：

1.农杆菌的准备：

1)挑取农杆菌单菌接种于5mL LB液体培养基(利福平50μg/mL，氯霉素100μg/mL)中，28℃，250转/分钟培养20h。

2)取1mL菌液转接入20-30mL LB液体培养基(利福平50μg/mL，氯霉素100μg/mL)中，28℃，250转/分钟培养约12h，测OD 600≈1.5。

3)8000转/分钟，4℃，10min离心收集菌体，重悬于农杆菌转化渗透液(5wt％蔗糖，0.05wt％Silwet L-77)并稀释至OD 600≈0.8。

2.拟南芥蘸花法转化：

1)将拟南芥的花薹浸入渗透液中，轻轻搅动约10s后取出，全部转化完毕后，托盘中加入水，用保鲜膜罩住拟南芥，以保持湿润环境，水平放置22℃避光培养，24h后去掉保鲜膜直立培养。

2)初次转化四天后，可再进行一次转化，重复两次，总共转化三次，这样可以对花序上发育的不同时期的花蕾进行转化，提高转化效率。

3)生长约两个月后，收集种子，4℃冰箱储存待用。

(二)试验结果：

经过蘸花法转化的拟南芥生长约两个月后，正常开花结子。

实施例5

拟南芥种子的筛选

(一)试验方法：

1)称25-30mg种子放入1.5ml离心管。

2)1ml 75wt％乙醇消毒1min(不停摇晃振荡)，8000转/分钟离心5s，去上清。

3)加入1ml过滤后的漂白粉(5wt％)消毒15min  (不停摇晃振荡，充分消毒)，8000转/分钟离心5s，去上清。

4)无菌水洗涤3-4次。

5)将种子均匀的播撒到1/2MS平板(潮霉素50μg/mL)上，Parafilm膜封口，4℃冰箱放置两天，22℃，16h光照培养6天。

将抗性植株移栽到盆中培养，苗稍大后，进行GUS活性检测，选出阳性植株(T₀)培养至开花结实，收集T₀植株上所结T₁种子。

实施例6

CPK蛋白激酶(AtCPK6)转化植株后的抗逆分析

(一)试验方法：

将转基因拟南芥自交纯和两代，获得3个纯化转化株系，收取种子。播种后，幼苗生长10-20天，分别用NaCl、PEG处理，观察植株的耐盐，耐干旱效果。

(二)试验结果：

结果表明：野生型和转AtCPK6基因拟南芥再存活率上有明显的差异，转基因植株比野生型拟南芥抗盐和干旱能力有明显提高。经过盐、干旱处理的转基因与野生型拟南芥的存活率如表1所示。

表1转基因与野生型拟南芥的盐、干旱处理后存活率

附：本发明所涉及到的核苷酸/氨基酸序列表：

<110>上海市农业科学院

<120>一种来源于拟南芥的抗盐、抗干旱的CPK蛋白激酶基因

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

<210>SEQ ID No 1

<211>1635

<212>DNA

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)

1   ATGGG CAATT CATGT CGTGG TTCTT TTAAG GACAA AATCT ACGAG GGCAA TCATA GTAGG

61  CCCGA GGAGA ATTCC AAATC CACCA CCACT ACTGT TTCCT CTGTT CATTC TCCTA CTACA

121 GACCA AGATT TCTCC AAACA GAACA CCAAT CCAGC TCTTG TGATT CCTGT TAAAG AACCC

181 ATTAT GCGGC GTAAC GTTGA CAATC AATCT TACTA TGTTC TTGGT CACAA GACTC CTAAC

241 ATTCG TGATC TTTAC ACGTT GAGTC GTAAG TTAGG ACAAG GACAA TTCGG GACAA CGTAT

301 TTGTG TACTG ATATT GCCAC AGGTG TTGAC TATGC TTGTA AGTCT ATATC CAAGA GGAAA

361 TTGAT ATCTA AAGAA GATGT TGAGG ATGTT AGGAG GGAGA TTCAG ATTAT GCATC ATTTA

421 GCTGG TCACA AGAAT ATTGT TACTA TTAAA GGAGC TTATG AGGAT CCTTT GTATG TTCAC

481    ATTGT GATGG AGCTT TGTGC TGGTG GTGAG TTGTT TGATA GGATT ATTCA TAGAG GTCAT

541    TACAG CGAGA GGAAA GCTGC TGAGT TGACC AAGAT CATTG TCGGT GTTGT TGAGG CGTGT

601    CATTC TCTTG GTGTT ATGCA TAGAG ATTTA AAGCC TGAGA ATTTC TTGTT GGTTA ATAAG

661    GATGA TGATT TCTCT CTTAA GGCCA TTGAT TTTGG TCTCT CTGTT TTCTT CAAAC CAGGC

721    CAAAT ATTCA AGGAT GTTGT TGGAA GTCCA TACTA TGTTG CTCCT GAGGT TCTTC TAAAA

781    CATTA TGGTC CAGAA GCTGA TGTGT GGACT GCTGG TGTTA TACTC TATAT CTTAC TAAGT

841    GGTGT CCCGC CTTTC TGGGC AGAAA CACAG CAAGG AATAT TTGAT GCTGT GTTGA AGGGA

901    TATAT TGACT TTGAT ACAGA CCCGT GGCCT GTCAT ATCCG ACAGT GCTAA AGATC TGATC

961    CGGAA GATGT TATGC TCTAG TCCTT CTGAA CGTTT GACTG CTCAT GAAGT CTTGC GTCAT

1021   CCATG GATCT GTGAG AATGG AGTTG CACCG GATAG AGCAC TTGAC CCGGC TGTTT TGTCT

1081   CGTCT AAAAC AGTTT TCTGC AATGA ATAAA TTAAA GAAGA TGGCT TTAAA GGTGA TAGCT

1141   GAGAG CCTCT CAGAA GAAGA GATTG CGGGT TTAAG AGCAA TGTTT GAGGC AATGG ATACT

1201   GATAA CAGCG GTGCA ATCAC TTTTG ATGAA CTCAA AGCTG GCTTG AGAAG ATATG GATCA

1261   ACCTT GAAAG ACACC GAGAT CCGAG ATCTT ATGGA AGCGG CTGAT GTGGA CAACA GCGGT

1321   ACAAT AGATT ACAGC GAGTT TATTG CAGCG ACGAT CCATC TGAAT AAACT AGAGA GAGAA

1381   GAGCA TCTTG TCTCT GCATT TCAGT ACTTT GACAA AGATG GAAGT GGTTA CATCA CCATT

1441   GATGA GCTGC AACAA TCTTG CATTG AACAT GGGAT GACCG ATGTT TTTCT TGAAG ACATA

1501   ATCAA AGAAG TAGAT CAAGA CAACG ATGGA CGGAT TGATT ACGAA GAATT TGTTG CGATG

1561   ATGCA AAAGG GAAAT GCTGG TGTAG GGAGA AGAAC AATGA AAAAT AGTCT AAACA TCAGC

1621   ATGAG AGATG TGTAG

<210>SEQ ID No 2

<211>544

<212>PRT

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)

1   MET Gly Asn Ser Cys Arg Gly Ser Phe Lys Asp Lys Ile Tyr Glu Gly Asn His Ser Arg

21  Pro Glu Glu Asn Ser Lys Ser Thr Thr Thr Thr Val Ser Ser Val His Ser Pro Thr Thr

41  Asp Gln Asp Phe Ser Lys Gln Asn Thr Asn Pro Ala Leu Val Ile Pro Val Lys Glu Pro

61  Ile MET Arg Arg Asn Val Asp Asn Gln Ser Tyr Tyr Val Leu Gly His Lys Thr Pro Asn

81  Ile Arg Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Arg Lys Leu Gly Gln Gly Gln Phe Gly Thr Thr Tyr

101 Leu Cys Thr Asp Ile Ala Thr Gly Val Asp Tyr Ala Cys Lys Ser Ile Ser Lys Arg Lys

121 Leu Ile Ser Lys Glu Asp Val Glu Asp Val Arg Arg Glu Ile Gln Ile MET His His Leu

141 Ala Gly His Lys Asn Ile Val Thr Ile Lys Gly Ala Tyr Glu Asp Pro Leu Tyr Val His

161 Ile Val MET Glu Leu Cys Ala Gly Gly Glu Leu Phe Asp Arg Ile Ile His Arg Gly His

181 Tyr Ser Glu Arg Lys Ala Ala Glu Leu Thr Lys Ile Ile Val Gly Val Val Glu Ala Cys

201 His Ser Leu Gly Val MET His Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asn Phe Leu Leu Val Asn Lys

221 Asp Asp Asp Phe Ser Leu Lys Ala Ile Asp Phe Gly Leu Ser Val Phe Phe Lys Pro Gly

241 Gln Ile Phe Lys Asp Val Val Gly Ser Pro Tyr Tyr Val Ala Pro Glu Val Leu Leu Lys

261 His Tyr Gly Pro Glu Ala Asp Val Trp Thr Ala Gly Val Ile Leu Tyr Ile Leu Leu Ser

281 Gly Val Pro Pro Phe Trp Ala Glu Thr Gln Gln Gly Ile Phe Asp Ala Val Leu Lys Gly

301 Tyr Ile Asp Phe Asp Thr Asp Pro Trp Pro Val Ile Ser Asp Ser Ala Lys Asp Leu Ile

321 Arg Lys MET Leu Cys Ser Ser Pro Ser Glu Arg Leu Thr Ala His Glu Val Leu Arg His

341 Pro Trp Ile Cys Glu Asn Gly Val Ala Pro Asp Arg Ala Leu Asp Pro Ala Val Leu Ser

361 Arg Leu Lys Gln Phe Ser Ala MET Asn Lys Leu Lys Lys MET Ala Leu Lys Val Ile Ala

381 Glu Ser Leu Ser Glu Glu Glu Ile Ala Gly Leu Arg Ala MET Phe Glu Ala MET Asp Thr

401 Asp Asn Ser Gly Ala Ile Thr Phe Asp Glu Leu Lys Ala Gly Leu Arg Arg Tyr Gly Ser

421 Thr Leu Lys Asp Thr Glu Ile Arg Asp Leu MET Glu Ala Ala Asp Val Asp Asn Ser Gly

441 Thr Ile Asp Tyr Ser Glu Phe Ile Ala Ala Thr Ile His Leu Asn Lys Leu Glu Arg Glu

461 Glu His Leu Val Ser Ala Phe Gln Tyr Phe Asp Lys Asp Gly Ser Gly Tyr Ile Thr Ile

481 Asp Glu Leu Gln Gln Ser Cys Ile Glu His Gly MET Thr Asp Val Phe Leu Glu Asp Ile

501 Ile Lys Glu Val Asp Gln Asp Asn Asp Gly Arg Ile Asp Tyr Glu Glu Phe Val Ala MET

521 MET Gln Lys Gly Asn Ala Gly Val Gly Arg Arg Thr MET Lys Asn Ser Leu Asn Ile Ser

541 MET Arg Asp Val ＊＊＊