用于治疗高同型半胱氨酸血症的益生细菌的用途

摘要

本发明涉及益生细菌用于治疗高同型半胱氨酸血症的用途。本发明还涉及用于治疗血浆高同型半胱氨酸血症的组合物，所述组合物包含与选自包含B组维生素的组的至少一种维生素联合的益生细菌。

说明书

技术领域

本发明涉及用于治疗高同型半胱氨酸血症的益生(probiotic)细菌的用途。本发明进一步涉及包含用于治疗血浆高同型半胱氨酸血症的组合物，所述组合物包含与选自包含B组维生素的组中的至少一种维生素联合的益生细菌。

背景技术

在意大利以及所有发达国家中，某些代谢疾病，如肥胖病、糖尿病、动脉高血压、心血管疾病和全身退行性和神经退行性疾病正在迅速增加。

除了遗传倾向性(genetic predisposition)外，在“发达”社会的饮食习惯和生活方式(饱和脂肪和精细食物的高消耗、可溶和不可溶纤维的低摄取、坐式习惯、吸烟、环境污染以及普遍的紧张生活条件)中还发现了触发因子。

统计学意义上，受代谢性疾病影响的人不仅预期寿命减少而且生活质量降低。

其中有些疾病，如阿尔茨海默氏和帕金森病注定随人口预期寿命的延长而进一步增加。这种现象不仅对患者家庭，而且对国家健康服务已经构成严重的社会和经济成本。

在心血管和神经退行性疾病的病例中，学术界已注意到了预警参数同型半胱氨酸的存在，其在血液中的高浓度构成中风、闭塞动脉病变(pathology)、静脉血栓症、动脉粥样硬化心血管疾病和可能地阿尔茨海默氏病和血管性痴呆的检验风险因素。高浓度的同型半胱氨酸在大多数病例中归因于由饮食失衡和/或饮食不足引起的营养缺乏。

因此，存在治疗由高浓度血浆同型半胱氨酸引起的病变以改善受代谢性疾病，如高同型半胱氨酸血症影响的患者的生活质量的需要。

特别地，存在降低导致严重疾病和病变状况的血浆同型半胱氨酸浓度的需要。

最后，存在具有设计用于降低血浆中同型半胱氨酸的高浓度的可用制剂的需要。

本申请人已挑选了大量能够提供对本领域病况中存在的需要有效响应的细菌菌株。

发明内容

本发明的一个目的涉及用于治疗血浆高同型半胱氨酸血症的细菌菌株，其选自由青春双歧杆菌(Bifidobacteriumadolescentis)DSM 16594、青春双歧杆菌DSM 16595、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)DSM 16596、假链状双歧杆菌(Bifidobacterium pseudocatenulatum)DSM 16597、假链状双歧杆菌DSM 16598、青春双歧杆菌DSM 18350、青春双歧杆菌DSM18352、青春双歧杆菌DSM 18353和假链状双歧杆菌DSM 21444组成的组。

本发明另外的目的涉及上述菌株中的至少一种用于制备治疗血浆高同型半胱氨酸血症的药物组合物的用途。

本申请人已发现至少一种特别挑选的细菌菌株与选自包含B组维生素的组中的至少一种维生素的组合能够使血浆高同型半胱氨酸血症的水平降低和正常化。

选自包含B组维生素(对有机体立即可用的维生素)的组中的维生素和由挑选的细菌菌株原位产生的叶酸的联合确保了在降低和正常化血浆同型半胱氨酸水平中效率更高。

因此，本发明的目的涉及包含与选自包含B组维生素的组中的至少一种维生素联合的至少一种上述细菌菌株的用于治疗血浆高同型半胱氨酸血症的组合物。

本发明另一目的涉及与选自包含B组维生素的组中的至少一种维生素联合的至少一种上述细菌菌株用于制备治疗血浆高同型半胱氨酸血症用药物组合物的用途。

以下引用本发明的其它优选实施方案并要求于所附的从属权利要求中。

在优选实施方案中，B组维生素选自包含维生素B₂(核黄素5-磷酸钠)、维生素B₆(盐酸吡哆醇)、维生素B₉(叶酸)和维生素B₁₂(氰钴胺素)的组。

具体实施方式

本发明的上下文中，叶酸(folic acid)和叶酸盐(folate)经常作为鉴定一系列化合物的同义词使用，叶酸和叶酸盐具有共同的维生素活性以及含有一分子蝶酸和一分子以上谷氨酸的相同基本化学式(蝶酰基-谷氨酸单酯叶酸(monoglutamate folic acid)或蝶酰基-谷氨酸多酯叶酸(polyglutamate folic acid))。本申请人已分离并表征了属于GRAS(公认安全)品种的产叶酸的菌株。本申请人已鉴定并表征了能够产生“体外”叶酸的双歧杆菌属的某些菌株。

“体外”研究

通过以下方法进行由检验下的菌株产生的叶酸的筛选和定量测定：通过微生物检测，通过比浊滴定评估其它细菌种类(如海氏肠球菌ATCC 8043)的发展，其它细菌种类的生长是存在于所用肉汤培养基中的叶酸量的函数。

从本工作的第一阶段中，鉴定了9株能够产叶酸的细菌，并由申请人保藏于德国的DSMZ国际保藏中心(DSMZInternational Collection)。

对于菌株DSM 21444，培养条件如下：TPY培养基-胰蛋白酶解酪蛋白10g/l、植胨5g/l、酵母提取物5g/l、葡萄糖10g/l、吐温(tween)801ml/l、K₂HPO₄2g/l、MgCl₂0.5g/l、ZnSO₄0.25g/l、CaCl₂0.15g/l、L-半胱氨酸盐酸1-水合物0.5g/l。在121℃初始pH 7.10±0.1和终pH 6.6下进行灭菌15分钟。在温度37℃下孵育17±1小时。长期储藏条件是在-25℃。在37℃下TPY肉汤培养基中，在强制厌氧状态下进行生长。革兰氏阳性菌株是厌氧的并以各种杆状存在。不消耗酸，无孢子形成和非移动的。存在于培养基中的葡萄糖专有地(exclusively)通过果糖-6-磷酸代谢途径(旁路)降解。

然后核对上述菌株的基因型和表型稳定性，获得的和/或可传染的抗生素抗性的缺失，对胃液、胰分泌物和胆盐的抗性以及在工业规模生产各菌株的可行性。

上述菌株是易于肠细胞吸收的叶酸的生产者，这是由于它由有限数量的谷氨酰残基(1，2和3分子谷氨酸)构成。

菌株在肉汤培养基中48小时内能够产生的叶酸平均量从约10至超过100ng/ml，优选从25至100ng/ml，更优选从40至85ng/ml。叶酸的产生也发生在混合的粪便培养物中，因此表明它在复合微生物群存在的结肠水平发生，所述复合微生物群通常由属于不同属和/或科的超过1,000种的不同种类组成：乳杆菌科、梭菌科、双歧杆菌科、拟杆菌属、肠球菌科、链球菌科、梭菌属、肠杆菌科、丙酸杆菌属、微球菌科、葡萄球菌科。

动物模型中的研究

申请人还用Wistar大鼠进行了体内研究。这些大鼠已在完全无叶酸盐的控制饮食下维持。体内研究的目的是诱导缺乏并同时检验给药上述产叶酸双歧杆菌菌株是否能够增加大鼠中叶酸/叶酸盐的量。

将动物分成4个组并如下表所示饲养：

整个研究期间对所有4个组饲养相同的无叶酸盐的饮食。组2(PRO)的饮食以每天每种菌株2×10⁸个细胞的速率补充有3种产叶酸的益生菌株(DSM 18350、DSM 18352和DSM 18353)的混合物；组3(PRE)饲养等于10克/升水的量的低聚果糖(FOS)；组4(SYM)饲养等于上述组2和组3的量的3种益生菌株和FOS。菌株以每天每种菌株2×10⁸个细胞的剂量以1∶1∶1的比率给药。

14天后处死大鼠并分析血液样品和活组织检查样本。基于利用试验微生物干酪乳杆菌鼠李糖亚种ATCC 7469，利用更为灵敏和精确的生物学方法测定叶酸。从文献中存在的数据，这种微生物能够仅在叶酸盐(特别是叶酸)的存在下生长，所述叶酸盐和叶酸以其天然状态和以各种还原形式如二氢叶酸(DHF)、四氢叶酸(THF)以及它们的甲基化或甲酰化衍生物。菌株有效利用谷氨酸单酯形式，和较少程度上还利用谷氨酸二酯和谷氨酸三酯形式。然而，证明对谷氨酸多酯形式有微小的灵敏度。将结果总结于下表：

区别营养14天后发现的叶酸浓度

报道的值表示由组成组的单个动物获得的那些的平均值。

叶酸的血浆浓度对于组(2)PRO增加了超过2倍，对于组(4)SYM增加了超过4倍。在后种情况中，益生元(prebiotic)纤维作为所用菌株的能源的重要性是明显的。

总之，用动物模型进行的研究表明菌株能够短时间定植(colonise)到大鼠肠内，并大量合成维生素B₉，由此引起其通过肠上皮细胞吸收和随后通过血浆路径分布，积累于肝以及在人类中具有该功能的器官。

本申请人还进行了“体内”研究以评价属于在人肠环境中产叶酸盐的青春双歧杆菌和假链状双歧杆菌两种的三种益生菌株的能力。评价是通过包括总共23个遵循平均多样化饮食(averagevaried diet)的健康受试者的随机性研究进行的。

特别地，将受试者分为三个组：组A(5个受试者)以5×10⁹CFU/天的量给药益生菌株青春双歧杆菌DSM 18350来治疗；组B(13个受试者)以5×10⁹CFU/天的量给药益生菌株青春双歧杆菌DSM 18352来治疗；和组C(5个受试者)以5×10⁹CFU/天的量摄入菌株假链状双歧杆菌DSM 18353。

菌株定植到肠和产叶酸能力通过比较用益生菌株治疗前后48小时内存在于排出粪便中的属于双歧杆菌属的微生物量和叶酸盐的量来评估。

首先，对参与研究的受试者进行饮食习惯的观查询问，特别涉及富含叶酸盐食物的消耗。然后测定叶酸浓度/g粪便的基值(base value)，并计算48小时内排出的维生素总量。在治疗开始时要求受试者保持其饮食方案尽可能不变，以便不改变外源性叶酸的摄入。

给药益生菌株30天后，分析粪便中叶酸的新浓度，再次计算48小时内排出的维生素总量。两个值之差(d₃₀-d₀)是由于通过定植到肠的双歧杆菌属菌株产生内源性叶酸所致。

利用在上述动物模型研究中采用的相同规程实现维生素的定量，其中将鼠李糖乳杆菌ATCC 7469用作试验微生物。下表示出三个组中在24小时内随粪便排出的叶酸平均量：

结果表明能够产叶酸的特定益生菌株的摄入调节甚至所有测试组粪便中的该维生素浓度，特别是属于组B的该维生素浓度在统计学上显著增加。粪便中存在的双歧杆菌数量评价证实了所有菌株定植到肠环境的可能性，特别是关于青春双歧杆菌DSM 18352。

进行的研究表明包含于人肠环境中的本发明的细菌菌株合成和分泌叶酸盐的有效能力，证实了基于这些菌株的制剂可代表维生素B₉的内源补充性来源，与口服时发生的情况相比，这对于结肠的粘膜肠细胞的体内平衡和对于确保维生素恒定的生物利用率特别有用。

本发明的另一目的是用于治疗血浆高同型半胱氨酸血症的包括益生成分和益生元成分的共生补充剂(symbioticsupplement)。

益生成分包含至少一种选自由青春双歧杆菌DSM 16594、青春双歧杆菌DSM 16595、短双歧杆菌DSM 16596、假链状双歧杆菌DSM 16597、假链状双歧杆菌DSM 16598、青春双歧杆菌DSM 18350、青春双歧杆菌DSM 18352、青春双歧杆菌DSM18353或假链状双歧杆菌DSM 21444组成的组的菌株。

益生元成分包括至少一种本领域技术人员已知的益生元纤维，如菊粉、低聚果糖、半乳寡糖、葡寡糖、木寡糖、阿拉伯半乳聚糖、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖和/或它们的组合。

本申请人已发现能够补充直接或间接支配(preside)同型半胱氨酸循环的所有维生素和成分的以立即可用形式存在的B组维生素复合物，能够治疗高同型半胱氨酸血症。

共生补充剂可以包含0.1至100×10⁹CFU/剂量的细菌和0.1至10CFU/剂量的益生元纤维。该补充剂还可包含一种或多种B组维生素，每种以RDA 5至100％的量存在。

由细菌产生的叶酸与存在于组合物中的B组维生素一起作用于同型半胱氨酸浓度的调节，所述同型半胱氨酸浓度导致众多严重病变发生风险的增加。

本发明的优选实施方案是饮食补充剂形式，其包含至少一种B组维生素，该B组维生素能够确保(以立即可用的形式)等于直接或间接支配同型半胱氨酸循环的所有维生素和成分的50％RDA(推荐饮食供给量(Recommended Dietary Allowance))的量。所述补充剂还包含至少一种能够在结肠水平合成叶酸的菌株，所述菌株选自包含青春双歧杆菌No.DSM 16594、青春双歧杆菌DSM 16595、短双歧杆菌DSM 16596、假链状双歧杆菌DSM 16597、假链状双歧杆菌DSM 16598、青春双歧杆菌DSM18350、青春双歧杆菌DSM 18352、青春双歧杆菌DSM 18353和假链状双歧杆菌DSM.21444的组。

在优选实施方案中所述补充剂包含三种菌株如青春双歧杆菌DSM 18350、青春双歧杆菌DSM 18352和青春双歧杆菌DSM18353的混合物。

在另外的实施方案中所述补充剂含有青春双歧杆菌DSM18352。

除了B组维生素和细菌菌株外，所述补充剂含有至少一种具有益生元双歧生成活性(bifidogenic activity)的纤维。该纤维选自包含聚合度(DP)在9至12之间的菊粉和聚合度(DP)在2至4之间的FOS(低聚果糖)的组，该纤维的量足以确保存在的细菌菌株迅速不断的定植。

上述两种纤维属于由在末端位置具有葡萄糖单元的、具有各种聚合度的果糖线性聚合物的混合物组成的果糖类，多糖类。

上述补充剂的效力在局部肠水平和全身水平均被证明，在所述局部肠水平是由于由菌株细菌，特别是在结肠肠细胞上的青春双歧杆菌DSM 18352分泌的叶酸诱导的营养作用而被证明，在所述全身水平是通过由5-甲基四氢叶酸引起的甲基化作用使血浆同型半胱氨酸浓度降低而被证明。

上述补充剂的配方具有以下优点。

1A)由于B维生素成分以适量(50％RDA)并以可直接生物利用的形式存在，使得血液中同型半胱氨酸浓度迅速降低。

特别地，5-甲基四氢叶酸代表一类甚至可被缺乏L-谷氨酰转移酶和叶酸/二氢叶酸还原酶的个体利用的叶酸。

1B)由于所存在的细菌菌株在结肠内发生叶酸合成，使得同型半胱氨酸基准血浆水平正常化，所述细菌菌株由于所存在的各种益生元纤维的双歧生成作用使得这些细菌菌株能够定植到各肠段。

合成机制使很高浓度的维生素B₉能够在肠腔内得到，该维生素B₉由具有有限个谷氨酰残基的形式组成，不仅能够通过主动运输，而且能够通过被动扩散通过基底膜进入肠细胞。

内源叶酸(通过与外源叶酸相同的通路代谢)的恒定输入保证了叶酸盐在全身水平的不断补充，因而使同型半胱氨酸的血浆浓度正常化。

结果，降低了严重病变如动脉硬化、中风、心肌梗塞和重大社会影响的神经退行性疾病，如脉管痴呆、老年抑郁症和阿尔茨海默氏疾病的发病风险。

本发明主题的补充剂的配方的非限制性实例。

维生素B₉(以等于50％RDA的量)的存在立即保证了有效降低严重病变发病风险的量。通过益生菌株产生生物意义(biologically significant)量的叶酸只有在10-15天后才开始，这是因为所述菌株需要这段时间增殖和定植到肠。只有当它们的菌数(population)通过特定阈值时，维生素的产生才变得有意义和重要，保证了不依赖于摄食量的不断输入。

因为它们的产叶酸能力而选择本发明的细菌菌株，特别是菌株DSM 18350、18352和18353。

  组合物1  Mg/包 ％RDA  菌株DSM 18352  250 -  菊粉  2,000 -  FOS  1,000 -  盐酸吡哆醇(维生素B₆)  1 50  核黄素5-磷酸钠(维生素B₂)  0.8 50  氰钴胺素(维生素B₁₂)  0.001 50  5-甲基四氢叶酸(叶酸-维生素B₉)  0.10 50

  葡萄糖酸锌  52 50  山梨糖醇E420  2,000 -  天然香草香料  300 -  不溶纤维  189 -  柠檬酸  20 -  三氯蔗糖(sucralose)E955  5 -  总计  5,818  组合物2  Mg/包 ％RDA  菌株DSM 18352  250  -  菊粉  2,000  -  FOS  1,000  -  盐酸吡哆醇(维生素B₆)  1  50  核黄素5-磷酸钠(维生素B₂)  0.8  50  氰钴胺素(维生素B₁₂)  0.001  50  5-甲基四氢叶酸(叶酸-维生素B₉)  0.10  50  葡萄糖酸锌  52  50  山梨糖醇E420  500  -  天然黑加仑香料  500  -  不溶纤维  139  -  柠檬酸  20  -  黑胡萝卜(Black carrot)  100  三氯蔗糖E955  10  -  总计  4,573  组合物3  Mg/包 ％RDA

  DSM 18350、DSM 18352、DSM 18353的混合物  300  -  菊粉  2,000  -  FOS  1,000  -  盐酸吡哆醇(维生素B₆)  1  50  核黄素5-磷酸钠(维生素B₂)  0.8  50  氰钴胺素(维生素B₁₂)  0.001  50  5-甲基四氢叶酸(叶酸-维生素B₉)  0.10  50  葡萄糖酸锌  52  50  山梨糖醇E420  500  -  不溶纤维  129  苹果香料  100  -  柠檬酸  20  -  三氯蔗糖E955  5  -  总计  5,008