在健康领域中使用的可溶的难消化纤维与具有多糖壁的真核生物的组合物

摘要

本发明的主题是使用分支麦芽糊精在包括肠内菌群的杂食或食肉动物的肠内腔内诱导具有多糖壁的真核生物的细胞壁的溶解，以及还用来协同性增加分支麦芽糊精在诱导杂食或食肉动物的肠内菌群的生长中的作用。本发明的主题还是旨在用于该用途的组合物以及旨在用于改善健康或食物补充的一种方法。

说明书

技术领域

本发明涉及在健康领域中、在食物补充中以及在改进非反刍动物的消化和健康中多种分支麦芽糊精与至少一种具有多糖壁的真核生物的组合使用。

背景技术

归因于它们通常的摄食习惯，非反刍动物(即食肉和杂食动物)的肠内菌群由相同属的细菌品系组成。除此以外，这个菌群根据宿主的年龄和日常饮食而变化。在人类中，胃肠道由复杂的微生物生态系统(10¹³到10¹⁵个细菌/克)构成，其中占优势的是类杆菌属、双歧杆菌属和真细菌。这些微生物形成了一个微生物丛，该微生物丛履行了多种生物化学和生理学功能，特别是(i)营养物发酵的一种补充，(i)为了保护消化系统对抗致病菌的一种屏障作用，(iii)在免疫系统的发育中是一种刺激。

这一微生物丛由超过500种不同的已知种类构成。在成人的肠内，类杆菌属的成员代表了从25％到60％的细菌群体(Moore W-E-C.，1978)(Finegold S-M.，1983)。

现有技术表明，聚糖酶活性似乎由聚居在肠内粘膜上的某些品系编码。

多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotamicron)似乎编码172个糖基水解酶，长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)仅具有它们中的39个。然而，在体外，仅仅描述过某些酶的表达。另外，这种表达似乎是可诱导的(Salyers AA et al.，1977，Kopecny J.，et al.，2004；Robert C.et al.，2007)。

因此，肠内菌群的诱导可以通过测量这些糖分解酶的活性(例如，特别是α-和β-葡糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、纤维二糖水解酶和β-木糖苷酶(Marteau Ph.et al.，1990))来证实。

根据本发明的分支麦芽糊精是可溶于水的难消化纤维。它们事实上不能被由非反刍动物(即食肉动物和杂食动物)合成的酶水解，并且是可发酵的；换言之，它们被宿主(即食肉和杂食动物)的肠内细菌群落发酵。该发酵在结肠内释放短链脂肪酸，这具有减小结肠内介质的pH值的作用，并且因此限制了致病菌的发育。

可以根据AOAC 2001.03方法来分析在这些分支麦芽糊精内包含的纤维。

植物具有一种果胶纤维素细胞壁，该细胞壁组成为：纤维素、半纤维素、木聚糖、甘露聚糖和蛋白质、以及在很多情况中还有木质素。藻类和特别是真核微藻类(它们代表了一个特定类别的植物)在它们的细胞壁中除了纤维素外还包括纤维素/甘露聚糖共聚物、壳聚糖和甲壳质。

真菌的细胞壁自身主要由甲壳质组成，而某些单细胞真菌(例如酵母)的细胞壁接近某些植物，因为它包括葡聚糖和甘露聚糖。

真核微藻类的多糖壁是不溶的，并且是相对地未由非反刍动物的肠内菌群发酵的。因此它们难以被杂食和食肉动物(例如哺乳动物，并且特别是人类)所消化。

真核细胞的多糖壁是与那些原核细胞(即细菌或蓝细菌)的细胞壁不同的，这些原核细胞的细胞壁自身由具有完全不同结构和特性的肽聚糖构成。

在植物中，可以描述以下各项：藻类、地衣和高等植物。术语“高等植物”旨在表示“具有茎的植物”或茎叶植物。真菌，例如酵母，并不被认为是植物，但是包括(以与植物相同的方式)多糖壁。

单细胞或多细胞植物或真菌同时构成了重要的营养潜在来源，并且还是植物的抗氧化剂(例如叶黄素、硒、类胡萝卜素或叶绿素)的一个来源。

然而，对于杂食、食肉动物并且特别是人来说，归因于它们的多糖壁的很差的消化性，这些营养物或抗氧化剂只有很小比例被释放到肠的内腔中。

因此，从植物和真菌摄入的营养物的实质性部分并不被释放，进而因此在消化期间不被吸收。在日常饮食的情况中，这一问题呈现完全不同的重要性，该日常饮食主要基于植物或者甚至专有地基于植物。

虽然构成了营养物的重要来源，但是一些植物非常难以耗尽，如藻类的情况下。在藻类中，在巨藻类和微藻类间找出区别

巨藻类，不管它们是绿藻类、杂色藻类或者红藻类，都因它们富含抗氧化剂和自由基清除剂(例如类胡萝卜素、多酚、维生素或多不饱和脂肪酸)而为人所名。关于多酚类，例如，一些巨藻(例如褐藻类(杂色藻类))，并且特别是墨角藻目(the order Fucales)的成员，含有的多酚含量可达干重15％。

微藻类，并且特别是绿色植物门(viridiplantae)、拟网黏菌类(labyrinthulids)、定鞭藻、红藻以及蜂窝状藻(alveolates)，代表潜在是以下化合物的供应者的一大组，这些化合物具有可利用的生物活性，例如蛋白质，它们的富集范围可高达微藻干重的70％。还可以提及维生素，具体是维生素A、B1、B2、B6、B12、C、E、叶酸或泛酸或在健康方面能够具有积极作用的色素，例如叶绿素、类胡萝卜素或藻胆蛋白的抗氧化作用。

藻胆蛋白是可溶于水的光合色素。它们被发现存在于红藻科植物的藻胆体中，并且还自由存在于隐藻的类囊体内腔中。

还可以提及藻蓝蛋白，它的抗氧化活性似乎比参照的抗氧化剂化合物(例如Trolox(6-羟基-2，5，7，8-四甲基色满-2-羧酸))大6倍，并且比抗坏血酸或维生素C大20倍。

因为以上原因，植物以及还有真菌被用作食品增补剂的选择组分。然而，为了使它们的代谢产物是可进入的并且可同化的，通常推荐通过细胞溶解的一种抽提物。

照惯例使用的技术是通过煮沸的物理技术，具有降解不耐热的组分(例如以维生素为例)的缺点的一种方法。

还有使用溶剂(例如苯酚、甲酸或脲)的化学技术。后一种方法的缺点是在细胞溶解后去除溶剂，并且需要确认所获得的溶解产物的无毒性质。这一毒性可以通过不想要的化学反应衍生的化合物的存在与该溶剂被诱导，或通过该溶剂被诱导。

可以想象这些真核生物的细胞壁的酶溶解，但是加上严格的条件，不管在这些活性酶的生产中还是在它们的纯化中，都要根据所选择的生产方法和最终产物的目的。最终，在获得能够重复该反应的条件之前，酶的选择和最适宜反应条件的确定可能要求艰巨的设定操作。

另外，这些细胞壁的溶解和消除会减少这些真核细胞的特性，就改进健康而言，特别是就防止导致肠道病原性疾病(enteropathogenic disease)而言。

确切地，某些单细胞植物或真菌(例如酵母或微藻类)被描述为具有关于肠健康的有益特性。因此，在多种肠道综合症(例如婴儿肠胃炎或腹泻等)的治疗中，它们被特别推荐。事实上，它们的多糖壁似乎允许由导致肠道病原性细菌合成的毒素的吸附。对于布拉氏酵母和酿酒酵母，这已经对由霍乱弧菌、艰难梭菌或肠道致病性大肠杆菌(EPEC)合成的毒素进行了描述。

另外，酵母(如同微藻类)似乎通常通过吸附外源性化合物(例如真菌毒素、二噁英或PCBs)而涉及健康保护。除了通过对于外源性化合物的肠屏障的通透性和使它进入血液的通路而诱导的毒性，这些毒素似乎还涉及归因于攻击肠粘膜和菌群这两者而引起的很多肠疾病。

没有经预先溶解的酵母或藻类的摄取诱导了关于肠道致病性细菌和外源性化合物的肠的保护。然而，在缺少这些生物的溶解的条件下，沿着消化道，比起它们真实的保护潜力，对于肠的健康的保护作用减少了。

这是因为，除了通过它们的细胞壁而诱导的作用，这些微生物，例如酵母，并且更具体的是布拉氏酵母或酿酒酵母，似乎能够表达直接针对导致肠道致病性因素(例如霍乱弧菌、艰难梭菌或肠道致病性大肠杆菌(EPEC))的抑制剂。这些抑制剂可以是溶解毒素的酶或通过结合到肠细胞受体上而诱导防卫机制的分子。其他微生物，例如微藻类普通小球藻、嗜糖小球藻(Chlorella saccharophila)、栅藻、莱茵衣藻或杜氏盐藻，似乎能够表达抗氧化剂，例如超氧化物歧化酶。

然而，现有技术并没有描述这些包含在药丸中的或作为一种添加物而提供的具有多糖壁的真核生物的给予方法，这些真核生物的给予同时具有以下特点：a)容易获得，即不需要特别的制备、纯化或抽提，b)构成可直接同化的营养剂的供应以及c)诱导对于食肉或杂食动物的健康的保护作用，并且该作用被伴随地改善并拓宽(i)归因于细胞壁的特性同时具有(ii)活性保护酶的或通过先前的穿过胃而未被变性的或未被降解的保护剂的大量释放。

发明内容

为了解决现有技术的这些不同问题，本发明涉及一种组合物，该组合物包括具有多糖壁和一种或多种分支麦芽糊精的一种或多种真核生物。

已经证实了这一混合物的协同作用(i)在肠内菌群的刺激中，(ii)在通过这一肠内菌群的多种酶的生产中，以及(iii)在通过活性剂(例如，具体是通过具有多糖壁的真核生物的溶解而释放的抗氧化剂或病原因子的抑制剂)的大量释放而实现的肠健康的保护中。

具有多糖壁的这些真核生物不能单独实现在该菌群中的这种增加，也不能单独实现它们的细胞内容物的这种释放。同样，该多种分支麦芽糊精也不能单独实现在肠内菌群中的这种增加。

分支麦芽糊精与具有多糖壁的真核生物的组合使用使可能获得肠健康的改善，通过比多种分支麦芽糊精或任何其他可溶难消化纤维(单独使用或作为混合物使用)的简单使用高一个程度来增加该菌群。另外，这一混合物使可能同时提供可以被该菌群利用的营养物，维持并增强它们的生长的诱导，同时提供可以被肠同化(归因于具有多糖壁的生物的细胞质内容物的释放)的活性剂和营养剂。

本申请已经证实这一混合物在该菌群的生长中和在具有多糖壁的生物的溶解中的协同作用。因此，根据所选择的该生物，它关于健康的作用可以被定向。这一作用可以是抗氧化剂(例如硒、超氧化物歧化酶、类胡萝卜素、多种维生素、叶绿素或藻胆蛋白)的供应的事实，或是解毒剂、抗炎剂或致病因子(细菌、病毒、寄生虫)的附着的抑制剂的供应的事实。所希望的作用可以简单地是归因于该菌群的增加的肠健康，所述增加大于观察到的多种分支麦芽糊精单独的简单吸收。

这一组合物的该特别有利的性质并不存在于一种可溶分支麦芽糊精与具有多糖壁的一种真核生物的简单相加中，并且因此并不存在于该混合物的每一种化合物的这些作用的简单相加中。事实上，在该混合物的这两种化合物间是一种真实的合作，具有在该菌群的生长和糖分解酶的表达这两者的诱导中获得的协同作用。这一作用是两种未预料的并且连续的作用的结果。第一是在能诱导第一细胞溶解的足够的量的条件下，被定向针对该真核细胞的细胞壁的糖分解酶的表达的诱导。第二作用是令人惊讶的，即在其中，通过细胞壁残余物和营养物的大量供应，该溶解的细胞同时增强了该菌群的生长和糖分解酶的表达的诱导。出人意料的是，通过诱导保持它们的完整性的细胞的大量溶解，这些相同的酶将会造成此现象的保持。

当单独吸收时，具有多糖壁的真核生物，例如微藻类、真菌或植物被现有技术认为对于人类以及还对于其他杂食或食肉动物来说是难消化的，并且因此几乎不能或完全不能被同化。因此，它们不能单独导致该菌群的糖分解酶的合成的刺激。另一方面，出人意料地，根据本发明的组合物解决了这一问题并且因此使它可以被用作一种食品增补剂，因为根据本发明，包含在具有多糖壁的真核生物中的营养物被释放进入肠的内腔，并且就该菌群或就肠粘膜而论，它们因此变得可以被同化或是具有活性的。一种用于保持或改善肠健康的方法(包括吸收根据本发明的组合物的一个步骤)特别是就肠综合症或就涉及致病因子、自由基或外源性化合物对该菌群或对肠粘膜的多种攻击的癌症而论是有效的。确切地，所观察到的菌群的生长大于使用只包括多种分支麦芽糊精的组合物引起的生长。这一组合物可以被单独显示，或作为肠综合症、肠癌或肠炎症的预防或治疗中的一种添加物。还可以设想，服用这一混合物以改善消化并且因此改善植物源的、经个体独立未消化的营养物的生物利用率。

根据一个有利的变体，根据本发明的组合物包括多种分支麦芽糊精，具有：

在15％和50％之间的1，6-糖苷键，优选地在22％和45％之间，更优选地在27％和34％之间，

小于20％、优选地在2％和20％之间、更优选地在3％和16％之间、甚至更优选地在3％和12％之间的还原糖含量，

小于5、优选地在0.5和4之间、更优选地在1和3.5之间的多分散性指数，以及

小于4500克/摩尔、优选地在600和4000克/摩尔之间、更优选地在1000和2700克/摩尔之间的数均分子量Mn。

包含在这些纤维中的连接似乎在结构上非常接近于在真核细胞的细胞壁中发现的那些，并且可以有助于该菌群在定向针对它们的细胞壁的酶的合成中的诱导。

有利地，具有多糖壁的真核生物选自真菌和植物，或选自它们的混合物。优选地，所选择的真菌是酵母。

通过该肠内菌群，已经证实，随着根据本发明的组合物的摄取，在以下物质的生产中出现增加：α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-半乳糖苷酶、酯酶、纤维二糖水解酶以及β-木糖苷酶。这些酶是与该菌群的量的增加有关的该菌群中的重要诱导的标志，也是所述菌群伴随生长的标志。因此，根据本发明的组合物的特异性是这些生物的存在，这些生物既作为所产生的酶的底物，也因此作为该菌群的生长的诱因，而且也作为与多种分支麦芽糊精组合的糖分解酶的生产中的诱因。根据本发明的组合物使可能特异性诱导能够水解植物和真菌的细胞壁、并且特别是能够水解藻类和酵母的细胞壁的糖分解酶。因此，这一应用的宽广范围使根据本发明的组合物能适应所希望的作用，并且缺点能被改造成良好。

甚至更有利地，具有多糖壁的真核生物是选自包括高等植物和藻类以及它们的混合物的组的植物。在这些植物中，可以提及以下，例如：绿花椰菜、胡椒、胡萝卜、菠菜、莴苣、番茄、甘薯、香瓜、西葫芦、杏或荷兰芹，或它们的果实，例如芒果或蓝莓。这些植物包含多种营养物。

优选地，具有多糖壁的真核生物是单细胞生物。在真菌中，优选的单细胞真核生物是酵母。在这些植物中，优选的单细胞真核生物是微藻类。有利地，这些微藻选自绿色植物门、拟网黏菌类、定鞭藻、红藻和蜂窝状藻，以及它们的组合，优选地是绿藻和拟网黏菌类，以及它们的组合，并且甚至更优选地是小球藻、栅藻、杜氏盐藻、红球藻、裂殖壶菌和破囊壶菌以及它们的组合。

这些微藻的有利作用是与它们的单细胞属性以及培养它们所需的相对简单的条件联系在一起的。因此，这些生物可以在未经预先处理的条件下使用，没有废物的产生，并且它们的全部都可以使用。不同于具有茎的植物，所有干物质都可以使用：归因于在细胞分化中，在器官特化中或在蛋白表达中的还原中固有的特征，不存在无用的部分。

根据本发明，微藻类的溶解使它们的细胞内容物大量释放，在单独使用微藻类的实例中没有观察到这一现象。这些微藻特别表现出它们与毒素结合的能力，并且还表现出它们富含抗氧化剂以及营养物。这一用途因此使可能优化在具有多糖壁的真核生物的单独吸收过程中观察到的作用。

因为比起陆生植物，它们富含蛋白质和长链ω-3多不饱和脂肪酸的优点，这些微藻是特别有营养的。

根据本发明的一个第二变体，具有多糖壁的真核生物是酵母，选自布拉氏酵母、酿酒酵母和毕赤酵母。

这些酵母是特别有益的，因为它们的蛋白含量和核酸含量特别丰富，并且因为它们与改善肠健康有关。

优选地，该组合物包括按重量比计范围从5/95到90/10、优选地从20/80到80/20、并且更优选地从25/75到75/25的具有多糖壁的真核生物/分支麦芽糊精。

有利地，这些分支麦芽糊精可以是在与以下物质的一种混合物中，这些物质是糊精类、低聚半乳糖类(GOSs)、低聚果糖类(FOSs)、油性或蛋白性的低聚糖、果聚糖、菊糖、聚右旋糖、低聚葡萄糖类、低聚乳果糖、以及它们的混合物。

优选地，根据本发明的组合物还包括选自以下组的一种化合物，该组包括：糊精类、低聚半乳糖类(GOSs)、低聚果糖类(FOSs)、油性或蛋白性的低聚糖、果聚糖、菊糖、聚右旋糖、低聚葡萄糖类、低聚乳果糖或它们的混合物。

这些分支麦芽糊精，甚至比其他可溶性难消化纤维更多地增强了该肠内菌群的多种水解酶的诱导，这是归因于它们的不规则的并且各式各样的连接。

在这些油性或蛋白性来源的可溶低聚糖中，可以提及大豆、油菜籽或豌豆，因为存在不同的低聚糖连接的优点，它们这些可溶的低聚糖是特别有利的。

在这些分支麦芽糊精/具有多糖壁的真核生物组合中，优选的具有多糖壁的真核生物是：在植物中：绿花椰菜、胡椒、胡萝卜、菠菜、莴苣、番茄、甘薯、香瓜、西葫芦、杏或荷兰芹，或者是它们的果实，例如芒果或蓝莓，微藻类例如小球藻、裂殖壶菌或破囊壶菌或它们的混合物；在真菌中，酵母例如布拉氏酵母(Saccaromyces boulardii)、酿酒酵母和毕赤酵母。

通过例证的方式，对于一个人，优选地每天服用约2克到100克的分支麦芽糊精与0.3克到20克的具有多糖壁的真核生物，优选地每天服用5克到20克的分支麦芽糊精与1.5克到6克的具有多糖壁的真核生物，按重量计，具有多糖壁的真核生物/分支麦芽糊精的比例范围从5/95到90/10，优选地从20/80到80/20，并且更优选地是从25/75到75/25。

根据本发明，该组合物包括0.5％到30％、优选地5％到15％按干重计的分支麦芽糊精/具有多糖壁的真核生物的组合。

该口服给药可以被分开，作为几天或几个星期的一种治疗，或者可以是长期的治疗。

根据本发明的组合物优选地处于一种选自以下的形式：固体的形式，以一种粉末、一种片剂或一种栓剂的形式，或液体的形式，以一种乳液或一种糖浆的形式。

有利地，根据本发明的组合物可以处于一种可立即使用的形式，以固体的形式例如以一种粉末、一种片剂或一种栓剂的形式，否则以液体的形式，以一种乳液或一种糖浆的形式，或者以一种饮料的形式，例如一种果汁或一种汤，否则以酸奶的形式存在或合并到早餐的谷物中。

该口服给药的制品可以包括任何常规的赋形剂或载体。它们可以由粉末、粒料、溶液等组成，并且任选地合并其他药用成分或活性成分。

有利地，根据本发明的组合物还可以包括至少一种活性剂或一种营养物，该活性剂或营养物旨在用于：预防和/或治疗肠综合症，例如肠道易激综合症或旅行性腹泻、肠炎症、慢性炎性肠病、肠癌或与饮食相关的疾病，预防与年龄相关的疾病，食物补充，诱导肠内菌群，增加对体力消耗的抗性，改善植物源营养物的消化，并且获得一种对杂食或食肉动物的肠健康的保护作用。

根据本发明的另一方面，根据本发明的组合物可以被用作一种药物。

有利地，根据本发明的组合物可以被用于预防和/或治疗肠综合症，例如肠道易激综合症或旅行性腹泻、肠炎症、慢性炎性肠病、肠癌或与饮食相关的疾病，还被用于预防与年龄相关的疾病，以及在杂食或食肉动物中的食物补充，特别是营养缺乏的情况中。

根据本发明的另一方面，在健康的杂食或食肉动物体内，根据本发明的组合物可以被非治疗地用于诱导肠内菌群，增加对体力消耗的抗性，改善植物源营养物的消化，获得对肠健康的保护作用，以及被用作食物补充。

有利地，本发明还涉及一种在包括肠内菌群的杂食或食肉动物的结肠中受控制地并且局域性地释放营养物或活性剂的方法，所述方法包括多种分支麦芽糊精和具有含有所述营养物或活性剂的多糖壁的真核生物的伴随的或同时发生的消化不良的一个步骤。这些分支麦芽糊精和具有多糖壁的真核生物的摄取在动物的肠腔(lumem of the intestine)内诱导了具有多糖壁的真核生物的细胞壁溶解。因此，这一方法使可能增加具有多糖壁的真核生物的消化率，并且以增强它们对健康的效果，同时增加它们的营养潜力。

优选地，具有多糖壁的真核生物被遗传上修饰或从选择中衍生而来。

术语“活性剂”旨在表示具有对健康有益作用的蛋白质、聚糖或生化试剂或核酸，例如抗氧化的酶或分子，具有抗炎作用或关于合成肠道致病性成分的某些微生物的抑制作用的酶或分子，或保护肠内菌群或肠粘膜的分子。

此外，本发明还涉及至少一种具有多糖壁的真核生物与多种分支麦芽糊精的组合的使用，用于诱导杂食或食肉动物的肠内菌群的生长和/或被用作食品增补剂。

本发明还涉及用于保持和/或改善杂食或食肉动物健康的方法，由以下组成：第一步，给予多种分支麦芽糊精，以及伴随的或分离的第二步，给予至少一种具有多糖壁的真核生物，该真核生物优选地选自植物、真菌以及它们的一种组合。优选地，真菌选自酵母。

本发明的一个主题还是对于一种杂食或食肉动物的食物补充的方法，包括第一步，给予多种分支麦芽糊精，以及伴随的或分离的第二步，给予具有多糖壁的真核生物，该真核生物优选地选自植物、真菌以及它们的一种组合。

本发明还涉及用于杂食或食肉动物的治疗性或预防性治疗的一种试剂盒，包括：

a)一种根据本发明的一种第一组合物；以及

b)包括至少一种活性剂或一种营养物的一种第二组合物；优选地，所述活性剂旨在用于在杂食或食肉动物中诱导肠内菌群，用于保持健康，用于食物补充或用于预防与年龄相关的疾病。

所述组合物可以用于人类，而且还可以用于动物，并且更特别地用于猫、狗、猪、兔子或其他易感染肠炎症的动物、表现出它们的免疫力减小的动物、或对体力消耗活性或抗性需要营养物供应的动物(例如赛马或赛狗)。所述组合物可以被设想作为在它们的自然环境外繁殖的动物的食品添加剂，这些动物例如鱼类。

这一组合物被建议用作与饮食相关或与年龄相关的疾病、代谢综合症、炎症性肠病(或IBDs)、或综合症(例如肠道易激综合症)的预防或补充治疗的食物补充，或用于预防或治疗遭受旅行性腹泻、病因通常不明的腹痛的个体、遭受或易患饮食缺陷(例如素食者或素食主义者)、或甚至老年个体、或健康脆弱或正在康复的个体。

最后，所述组合物特别适合用于承受压力的个体(其压力在肠内水平上表现出来)。

经阅读以下非限制性说明的实例将会更清晰地理解本发明。

具体实施方式

在实验室大鼠体内研究了不同的可溶或不溶纤维对肠内菌群的葡糖苷酶活性的影响。这些可溶纤维是根据本发明的分支麦芽糊精、FOSs以及聚右旋糖，并且这些不溶纤维是纤维素纤维。

在这一实例中所选择的分支麦芽糊精具有15％和35％之间的1→6糖苷键、2％和5％之间的还原糖含量、小于5的多分散性指数以及在2000和3000克/摩尔之间的数均分子量Mn：

  还原糖  2.3  Mn(克/摩尔)  2480  Mw(克/摩尔)  5160  1，2-连接：  10  1，3-连接：  12  1，4-连接：  49  1，6-连接：  29

它们还具有占干重90％的总纤维含量，根据AOAC方法(No.2001-03)测定。

40只斯普拉-道来(Sprague Dawley)来源的OFA大鼠被分为4组，用详情列于下表1的饮食喂养。

组4接受添加多种低聚果糖(FOSs)的饮食(Orafti公司销售的RaftiloseP95)。

组5和6分别接受添加聚右旋糖和纤维素的饮食。

表1

  组别  食物和检验的产品  1  AO4C食物  2  AO4C食物+10％葡萄糖  3  AO4C食物+10％多种分支麦芽糊精  4  AO4C食物+10％FOSs  5  AO4C食物+10％聚右旋糖  6  AO4C食物+10％纤维素

在一周的隔离后，在此期间大鼠接受标准饮食和饮用水，这些大鼠吃该食物36天。

在D₀，这些动物禁食24小时。它们被随意地给予饮用水。在D₁，收集它们的粪便。

给予这些动物表2中描述的饮食。

在D₂₈，这些动物禁食24小时。它们被随意地给予饮用水。

在D₂₉，再次收集它们的粪便。

在D₃₆，将这些动物处死。

完成这些器官的一次全面宏观观察。它们的盲肠被结扎并除去。将这些满的盲肠、盲肠内容物和空盲肠称重。

还评估了它们的粪便的酶的活性(α-葡糖苷酶和β-葡糖苷酶)。

表2给出了分别在D₀和D₂₉测定的它们的粪便的酶活性。

表2

  5  3.15±1.67  2.64±1.10  13.22±4.03  10.02±2.94  6  3.22±1.64  3.55±2.10  6.08±2.02  6.68±2.98

在D₀，这些组的活性对于对照组1来说是相同的。在D₂₉，通过给予10％的分支麦芽糊精，葡糖糖苷酶活性的增加非常大。另一方面，在接受10％FOSs或聚右旋糖的动物中观察到较小的增加。在纤维素的情况中，没有观察到显著增加。

确切地，在与对照组的比较中，接受多种分支麦芽糊精的组的α-葡糖苷酶和β-葡糖糖苷酶分别观察到增加了310％和298％，而接受FOS的组分别只增加了172％和63％，并且接受聚右旋糖的组分别增加了135％和64％。

这些分支麦芽糊精具有远比FOSs或聚右旋糖有利的特征，并且允许葡糖苷酶活性的非常更大诱导。另一方面，这些不溶的纤维(包括它们自身)在葡糖苷酶活性方面没有效果。

在与分支麦芽糊精(BMD)和聚右旋糖(POLY)长达28天的比较中，在大鼠体内研究了一种微藻(小球藻)和一种真菌(酵母)的新陈代谢。分支麦芽糊精和聚右旋糖对于那些以前的实例来说是相同的。在平行实验中，小球藻或酵母与分支麦芽糊精组合以研究具有多糖壁的真核生物和可溶难消化纤维的组合的作用。

根据以下给出的表3，将要检验的产品引入实验室大鼠的标准食物中，以固定剂量5％的比例，单独给予或作为与另一产品的混合物给予。

表3

 组别编号 要检验的产品 组1(对照) - 组2(C) 5％的小球藻(Chlorellae) 组3(分支麦芽糊精) 5％的分支麦芽糊精 组4(Y) 5％的酵母 组5(分支麦芽糊精+C) 5％的分支麦芽糊精+5％的小球藻 组6(分支麦芽糊精+Y) 5％的分支麦芽糊精+5％的酵母 组7(聚右旋糖) 5％的聚右旋糖 组8(聚右旋糖+C) 5％的聚右旋糖+5％的小球藻 组9(聚右旋糖+Y) 5％的聚右旋糖+5％的酵母

要检验的小球藻是一种普通小球藻。要检验的酵母是一种酿酒酵母。

在一周的隔离后，在此期间大鼠接受标准饮食和饮用水，这些大鼠在它们的体重的基础上随机化，并且被分配到研究组中。

参与这一研究的大鼠是斯普拉-道来来源的雄性OFA大鼠。它们的体重的接受区间是100和125克之间。它们被成对地养在Makrolon笼中。

在本研究中，不同的参数被评估：临床观察、体重变化、食物消耗、饮用水消耗。

在D-1和D20，这些动物被各自置于一个新陈代谢笼中24小时。在这一时段，它们没有接受食物，但是接受任意量的饮用水。

在D0和D21，收集它们24小时内的粪便。称量它们(粪便)的湿重，并且立刻在-20℃冷冻，它们随后被冷冻干燥一个时段(48到72小时)，在冷冻干燥后称量干重，并且被磨碎。在24小时内，多种对于这些磨碎的粪便的分析将被执行。

在D14，直接从这些动物的肛门收集粪便。每一动物收集的粪便最小量是3克。这些粪便被称量湿重并且接下来立刻在-20℃条件下冷冻，同时等待分析。

关于这些冷冻的干粪便(在D-1和D20收集的)，通过分光光度计测量的方法进行α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-半乳糖苷酶、酯酶、纤维二糖水解酶和β-木糖苷酶的酶活性的测量。使用的底物分别是：对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷、对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷、对硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷、对硝基苯基乙酸、对硝基苯基纤维二糖糖苷和对硝基苯基木吡喃糖苷。在给这些酶的活性定量之前，通过连续搅动、离心和洗涤步骤提取这些酶。这些酶活性结果表示为每分钟(或对于纤维二糖水解酶和β-木糖苷酶活性用每小时)以及每克干粪便吸光度的单位。

关于这些冷冻粪便(在D14收集)，抗氧化剂活性通过TEAC(Trolox Equivalent Antioxidant Capacity，Trolox等值抗氧化能力)分析方法测定。这一检验的目标是从无色的ABTS与过硫酸钾的溶液的混合物中产生自由基(ABTS·+颜色是蓝绿色的)。通过与这些待检验粪便中的抗氧化剂反应，该自由基种类的脱色使可能测定总抗氧化能力。通过分光光度计测量监控该脱色。这些结果表示为TEAC抑制百分比，并与并不引起脱色的阴性对照比较。

通过方差齐性检验(Bartlett检验)实现这些结果的统计分析，如果该结果是不显著的，随后进行通过ANOVA(方差分析)的方差分析，如果结果是显著的，就进行Kruskall和Wallis检验以及Mann-Whitney检验。这些组间进行互相比较并与对照组比较。只有如下比较会被呈现：

组1(对照)与所有这些组

组5(分支麦芽糊精+C)与组2(C)

组5(分支麦芽糊精+C)与组3(分支麦芽糊精)

组6(分支麦芽糊精+Y)与组4(Y)

组6(分支麦芽糊精+Y)与组3(分支麦芽糊精)

组8(聚右旋糖+C)与组2(C)

组8(聚右旋糖+C)与组7(聚右旋糖)

组9(聚右旋糖+Y)与组4(Y)

组9(聚右旋糖+Y)与组7(聚右旋糖)

在这些表中，数字被标记：它显示关于该组哪些结果是显著的。符号T、*、**、***显示显著性的程度，分别是：趋势、p＜0.05、p＜0.01、p＜0.001。

这些结果显示了体重变化、食物消耗和饮用水消耗在各组间相等地变化。在本研究期间，没有观察到特别的临床观察数据。

在D0测量的α-葡糖苷酶(α-Glc)、β-葡糖苷酶(β-Glc)、β-半乳糖苷酶(β-Gal)、酯酶、纤维二糖水解酶(CBH)以及β-木糖苷酶(β-Xyl)的酶活性结果总结在下表4中：

表4

这些数据的统计分析没有显示出在各组间有任何显著差异。在D0这天的本研究的开始，不同组的这些动物都具有以粪便酶活性的方式表示的相同基线。在D21测量的α-葡糖苷酶(α-Glc)、β-葡糖苷酶(β-Glc)、β-半乳糖苷酶(β-Gal)、酯酶、纤维二糖水解酶(CBH)以及β-木糖苷酶(β-Xyl)的酶活性结果总结在表5中：

表5

下表6表示与组1(对照)比较，不同组的酶活性的倍增因子。该值表示以下比率：(一个给出组的酶活性)/(对照组的酶活性)。

大于1的结果显示该给出组的酶活性大于对照组的酶活性。

表6

下表7表示与“分支麦芽糊精”和“小球藻”组相比，“分支麦芽糊精+小球藻”组的酶活性的倍增因子，或与“聚右旋糖”和“小球藻”组相比，“聚右旋糖+小球藻”的倍增因子。该值表示以下比率：(“待检验产品+小球藻”组的酶活性)/(“待检验产品”组的酶活性)或以下比率：(“待检验产品+小球藻”组的酶活性)/(“小球藻”组的酶活性)。

表7

下表8表示与“待检验产品”和“酵母”组比较，“待检验产品+酵母”组的酶活性的倍增因子。该值表示以下比率：(“待检验产品+酵母”组的的酶活性)/(“待检验产品组”的酶活性)或以下比率：(“待检验产品+酵母”组的酶活性)/(“酵母”组的酶活性)。

表8

对于α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶和纤维二糖水解酶活性来说，统计分析显示所有组的活性，除了“小球藻类”组，与对照组相比都显著增加。如果“小球藻类”组被排除，与对照组相比，这些活性的倍增因子在1.37和5.16(α-葡糖苷酶)之间，1.58和4.61(β-葡糖苷酶)之间以及在1.02和5.81(纤维二糖水解酶)之间。

与“分支麦芽糊精”组单独相比或与“小球藻”组单独相比，“分支麦芽糊精+小球藻”组的这些活性在统计上更大。倍增因子分别是，1.31-2.82(α-葡糖苷酶)，1.42-2.73(β-葡糖苷酶)以及1.45-4.14(纤维二糖水解酶)。

类似地，与“分支麦芽糊精”组单独相比或与“酵母”组单独相比，“分支麦芽糊精+酵母”组的这些活性在统计上更大。”倍增因子分别是，2.40-2.93(α-葡糖苷酶)，1.94-2.63(β-葡糖苷酶)以及1.81-3.01(纤维二糖水解酶)。

对于β-半乳糖苷酶、酯酶和β-木糖苷酶活性来说，与对照组相比，“分支麦芽糊精+小球藻”和“分支麦芽糊精+酵母”组在它们的活性方面都经历了统计上的增加。对于这两个组，与对照组相比，活性的倍增因子是2.04/2.05(β-半乳糖苷酶)，1.46/1.52(酯酶)以及1.78/1.94(β-木糖苷酶)。

与“分支麦芽糊精”组单独相比或与“小球藻”组单独相比，“分支麦芽糊精+小球藻”组的这些活性在统计上更大。”倍增因子分别是，1.98-2.48(β-半乳糖苷酶)，1.60-1.64(酯酶)以及1.51-2.41(β-木糖苷酶)。

类似地，与“分支麦芽糊精”组单独相比或与“酵母”组单独相比，“分支麦芽糊精+酵母”组的这些活性在统计上更大。倍增因子分别是，1.98-1.79(β-半乳糖苷酶)，1.67-1.38(酯酶)以及1.65-1.48(β-木糖苷酶)。对于单独检验聚右旋糖或作为与小球藻或酵母的一种混合物，所有这些结果的显著性都要降低。

为了证明本产品具有协同作用而不具有积累作用，下表9表示了在给出组与对照组间计算所得的酶活性中的差异。关于此同一表格也已经计算出“理论结果”：

组5的理论活性表示组2加上组3的活性所得的活性之和；

组6的理论活性表示组3加上组4的活性所得的活性之和；

组8的理论活性表示组2加上组7的活性所得的活性之和；

组9的理论活性表示组7加上组4的活性所得的活性之和。

表9清晰地显示，不管测量的酶活性，对于作为一种混合物检验的产品，所得酶活性远远大于计算所得的理论酶活性。这个作用因此是协同作用而不是累加作用。

表9

为了证实微生物的细胞溶解，执行一种细胞内标志的分析。和酵母相反，小球藻被描述为含有很多抗氧化剂，例如叶绿素和维生素。一项关于小球藻的溶解的特异性标志的研究，在食用摄取的小球藻(组2和5)以及食用摄取的酵母(组4和6)的大鼠的粪便中，使可能从任何其他对于真核生物(与纤维相关的小球藻或酵母)来说非特异的不真实作用中辨别出小球藻的溶解。

在D14测量的粪便的抗氧化活性的结果被总结在表10中。

表10

  组别  ％抑制  1对照  409.7±28.6

与对照组、“分支麦芽糊精”组和“小球藻类”组相比，“分支麦芽糊精+小球藻类”组的动物的粪便的抗氧化能力在统计上增加。

“分支麦芽糊精+小球藻类”组的倍增因子是：

与对照组相比是1.21

与“小球藻类”组相比是1.20

与“分支麦芽糊精”组相比是1.16

所得关于聚右旋糖的结果的被非常小地加重。

为了证明本产品具有协同作用而不是积累作用，下表11表示了在给出组与对照组间计算所得的抗氧化能力中的差异。关于此同一表格也已经计算出“理论结果”：

组5的理论活性表示组2加上组3的抗氧化能力所得的抗氧化能力之和；

组6的理论活性表示组3加上组4的抗氧化能力所得的抗氧化能力之和。

表11

这一表格清晰地显示所得分支麦芽糊精/小球藻混合物的抗氧化能力远远大于计算所得的理论抗氧化能力。这个作用因此是协同作用而不是累加作用。对于分支麦芽糊精+Y组来说这一观察数据是无效的。

这些结果清晰地显示小球藻细胞壁的水解使这些抗氧化剂能够释放，然而在只消耗小球藻的动物中没有观察到这一现象。

为了支持关于多种分支麦芽糊精所得的观察数据，也检验了其他多种分支麦芽糊精(表12)并且得到类似的结果。

表12

 分支麦芽糊精1 分支麦芽糊精2 分支麦芽糊精3  Mn(克/摩尔) 1189 1232 2504  Mw(克/摩尔) 3996 4004 4602  Mn/Mw 3.4 3.2 1.8  1，6-连接 33 32 31-35  还原糖 10.4 9.6 4.1

这些结果极其有趣，因为它们证实了在分支麦芽糊精和小球藻类或酵母类之间的协同而不是累加作用。在聚右旋糖的实例中，在聚右旋糖和小球藻或酵母间观察到同样的协同作用。然而，因为与聚右旋糖一起所得的葡糖苷酶激活并不与这些分支麦芽糊精所得的激活一样大，观察到的总体效果并不与它们一样大。因此，本申请人已经表明，通过研究这些大鼠的粪便中酶活性，对于肠内菌群的生长，可溶难消化纤维和具有多糖壁的真核生物的混合物的协同作用。本申请人还已经显示，通过研究这些粪便的抗氧化活性，对于具有多糖壁的生物的溶解，可溶难消化纤维和具有多糖壁的真核生物的混合物的协同作用。在所有可能中，肠内菌群的细菌，在归因于混合物的摄取的诱导后，会分泌多种能够水解小球藻和酵母的细胞壁的酶，释放多种化合物，特别是含氮化合物，这些化合物促进将自身生产多种酶的其他细菌的生长。

Salyers AA，Palmer JK，Wilkins TD.Laminarinase(beta-glucanase)activity in Bacteroides from the human colon.Appl Environ Microbiol.1977 May；33(5)：1118-24。

Robert C，Chassard C，Lawson PA，Bernalier-Donadille A.Bacteroides cellulosilyticus sp.nov.，a cellulolytic bacterium from the human gut microbial community.Int J Syst Evol Microbiol.2007 Jul；57(Pt 7)：1516-20。

J，Hajer J，Mrázek J.Detection of cellulolytic bacteria from the human colon.Folia Microbiol(Praha).2004；49(2)：175-7。

Marteau P，Pochart P，FlouriéB，Pellier P，Santos L，Desjeux JF，Rambaud JC.Effect of chronic ingestion of a fermented dairy product containing Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium bifidum on metabolic activities of the colonic flora in humans.Am J Clin Nutr.1990 Oct；52(4)：685-8。