用于检测鉴定伤寒沙门氏菌核酸片段的引物、探针及芯片

摘要

本发明公开了一种用于检测鉴定伤寒沙门氏菌核酸片段的引物、探针及芯片，该引物序列包括：SEQ ID NO.2所示的上游引物序列和SEQ ID NO.3所示的下游引物序列组成的引物对序列；该探针序列的组成为5’-Zc-P-3’，其中，5’端的Zc是与基因芯片上固定的探针Z互补的序列，3’端的P是SEQ ID NO.4所示的伤寒沙门氏菌基因的特异序列；该基因芯片，包括：用于检测鉴定伤寒沙门氏菌核酸片段的探针和固定在固相载体上的Z探针。本发明的引物、探针及芯片能特异性地针对伤寒沙门氏菌进行检测。

说明书

技术领域

本发明涉及一种引物和探针及芯片，特别是涉及一种用于检测鉴定伤寒沙门氏菌核酸片段的引物、探针及芯片。

背景技术

伤寒是经伤寒沙门氏杆菌污染的水或食物传播的急性传染病，《中华人民共和国传染病防治法》将其列为乙类传染病。伤寒沙门氏杆菌是水体和食品中的重要污染源，人通过食用了受污染的饮用水和食物，经口感染。临床特征为长程发热、全身中毒症状、相对缓脉、肝脾肿大、玫瑰疹及白细胞减少等，主要并发症为肠出血和肠穿孔。除引起肠道病变外，还能导致其他器官或全身感染，严重威胁人民的健康。伤寒遍布于世界各地，以热带及亚热带地区为多，而且最近20年间，临床分离出来的伤寒沙门氏杆菌对抗生素的耐药性越来越高，给治疗带来很大难度。

伤寒患者和带菌者是本病的传染源。病菌随粪便和尿排出体外，通过污染饮水、食物、日常生活接触等途径传播，蟑螂、苍蝇在本病的传播上起媒介作用。在伤寒沙门氏杆菌的传播过程中，无症状携带者扮演了一个很重要的角色。由于不出现任何症状，这些无症状携带者为伤寒杆菌的繁殖和感染其他人提供了一个安全的储存宿主。而且伤寒杆菌在自然界中的生活力较强，在水中一般可存活2～3周，在粪便中能维持1～2月，在牛奶中不仅能生存，且可繁殖，能耐低温，在冰冻环境中可持续数月。

伤寒杆菌的诊断依据主要为临床症状及实验室诊断，主要分为细菌培养技术、免疫学检测技术、PCR技术和基因芯片技术。细菌培养和基于免疫学的肥达试验(Widal reaction)是诊断伤寒杆菌的传统方法，细菌培养由于特异性高，不出现假阳性而被称为金标准，是最常用确诊伤寒的诊断依据，但培养结果容易受抗生素等条件的影响，且耗时。肥达试验已沿用近100年，60年代曾有人对其特异性提出异议，认为其结果存在着混乱模糊的情况，非伤寒发热性疾病肥达试验也呈阳性结果，如各种急性感染，肿瘤，结缔组织病性疾病，慢性溃疡性结肠炎，均可出现阳性结果。因此对肥达氏反应结果的判定宜审慎，必须密切结合临床资料。近年来随着轻症和亚临床病例增多，肥达氏反应的阳性率有下降趋势，故对其诊断价值发生了争论。ELISA的基本原理是用酶促反应的放大作用来显示初级免疫学反应，既可检测抗原，又可检测抗体，用ELISA法检测伤寒患者Vi抗原，灵敏性达1ng/ml。国内、外用ELISA检测过临床标本中的Vi抗原，V9抗原，LPS，H抗原等，敏感性在62.5％～93.1％，因检测抗原的不同而异。在伤寒的血清免疫学诊断方法中，ELISA方法简便，快速，敏感，特异性高，是公认较好的一种诊断方法。PCR反应技术具有较高的特异性和敏感性，且操作简单、快速。菌体裂解时可释放强烈的内毒素，是伤寒杆菌致病的主要因素。目前利用沙门菌的invA基因和鞭毛素基因用PCR方法扩增进行分子杂交，可以检出3～300个活菌细胞，达到敏感和特异的效果。

基因芯片由于具有高通量检测、简便快速、敏感性高等特点，可利用微生物的特异序列制备病原菌的检测芯片用于微生物的快速检测，快速大量的鉴定致病相关因子，还可以进行不同微生物之间基因组结构和功能基因的比较，深化对致病机制、耐药机制的认识，为防病治病奠定基础。利用基因芯片还可以进行病原菌及生存环境相互关系的研究，找出抑制细菌生长的措施，减少病原菌对人类及环境的伤害。随着生物芯片技术的不断成熟完善，试验和使用成本的降低，生物芯片已经可以用于公共卫生、食品安全等方面的微生物检测。

沙门氏杆菌的H抗原有两种，称为第1相和第2相。第1相特异性高，又称特异相，因此可以通过检测编码H抗原的基因进行沙门氏菌的检测鉴定。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种用于检测鉴定伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)核酸片段的引物、探针及芯片。该引物、探针及芯片能特异性地针对伤寒沙门氏菌进行检测。

为解决上述技术问题，本发明的一种用于检测鉴定伤寒沙门氏菌核酸片段的引物，其序列包括：SEQ ID NO.2所示的上游引物序列和SEQ ID NO.3所示的下游引物序列组成的引物对。

所述引物进行聚合酶链式反应(PCR)所产生的产物的片段大小为159bp。

另外，本发明的一种用于检测鉴定伤寒沙门氏菌核酸片段的探针，其序列由两部分组成，其组成为5’-Zc-P-3’，其中，5’端的Zc是与基因芯片上固定的探针Z互补的序列，3’端的P是SEQ ID NO.4所示的伤寒沙门氏菌基因的特异序列。所示Z和Zc是与所检测的物种没有同源性的人工合成的长度为20-25pb的一对互补序列。

本发明的用于检测鉴定伤寒沙门氏菌核酸片段的引物和探针，可以用于伤寒沙门氏菌的聚合酶链式反应(PCR)或/和基因芯片，特异性地检测样本中的伤寒沙门氏菌。

另外，本发明的用于检测鉴定伤寒沙门氏菌的基因芯片，包括：上述用于检测鉴定伤寒沙门氏菌核酸片段的探针和固定在固相载体上的Z探针，其中，用于检测鉴定伤寒沙门氏菌核酸片段的探针一端DNA片段末端(5’端)连接有与Z探针互补的Zc序列。

所述用于检测鉴定伤寒沙门氏菌核酸片段的探针可在其DNA末端片段上进行标记，该标记包括：荧光素标记、生物素标记、放射性元素标记、电化学发光标记和酶标记。

本发明中所述固相基质可选用本领域周知的基质，只要所述基质与所述反应物相容，不会影响检测结果就可以。

本发明基因芯片还包括至少一种对照探针，所述对照探针选自：阴性对照探针、阳性对照探针。该基因芯片的制备可按常规方法制备。

在本发明的另一方面，提供了一种应用上述基因芯片进行检测的方法，包括如下步骤：

1)使用商业化的DNA抽提试剂盒，按照试剂盒的说明制备样品DNA模板，通过PCR反应对目的基因(包括16S基因、伤寒沙门氏菌的H1d基因)进行扩增；所采用的PCR体系为：PCR缓冲液0.7-1.2×，dNTP 0.1-0.2mM，上下游引物(包括用于检测鉴定伤寒沙门氏菌核酸片段的上下游引物、16S上下游引物)各0.1-0.4μM，酶0.2-0.6×，DNA模板20pg-20ng，PCR反应总体积为10-20ul；PCR的反应条件为：95℃变性3min；之后在95℃变性30s，58-65℃退火30s，68℃延伸30s的条件下循环28-35次；68℃延伸5min；

2)取2-10μl PCR扩增产物，使用1-5U的虾碱酶(Shrimp Alkaline Phosphatase，SAP)和5-15U的外切酶(Exonuclease I，Exo I)进行纯化后，加入用于检测鉴定伤寒沙门氏菌核酸片段的探针0.1-0.4μM和0.1-0.4μM荧光标记的双脱氧核苷Cy3-ddATP，进行单碱基延伸反应，反应中所加入的DNA聚合酶为0.8-1.5U，在退火温度66-72℃的条件下循环30-35次，产生带有荧光标记的产物；

3)对带有荧光标记的产物，加入终浓度为6×SSPE或6×SSC(saline sodium citrate，柠檬酸钠)的杂交液，与已经固定有Z的基因芯片在46-50℃进行杂交1.5-2.5小时，杂交结束后，分别使用含有2×SSC、1×SSC、0.5×SSC、无SSC的清洗液清洗，干燥芯片后，使用芯片扫描仪检测杂交反应的结果。

在本发明的另一方面，还提供了本发明的基因芯片在临床检测中的应用。

本发明的具体原理是利用靶基因的一对特异性引物和一个特异性探针，采用PCR的方法实现靶基因的特异性扩增。扩增产物采用凝胶电泳进行检查，应出现且仅出现一条大小为159bp的条带。所产生的PCR产物进行荧光标记，然后与探针杂交，使用激光扫描仪检测杂交信号。有伤寒沙门氏菌存在时，芯片上的伤寒沙门氏菌核酸片段所对应的位点应该有荧光信号产生，否则无荧光信号。荧光信号强度还应与样本中的伤寒沙门氏菌核酸片段的多少成正比，通过荧光信号的强弱程度还可以大致反映出样本中靶基因片段的含量。

本发明的引物、探针及芯片，具有较强特异性，因此能针对伤寒沙门氏菌进行检测。

附图说明

下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细的说明：

图1是利用引物对F-080105和R-080105检测伤寒沙门氏菌的阳性样本和阴性样本的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图，图中每个泳道为不同的细菌DNA，其中，1为沙门乙型副伤寒血清型，2为沙门菌鸡血清型，3为鼠伤寒沙门菌，4为肠炎沙门菌，5为伤寒沙门菌，6为沙门菌某些亚种，7为大肠埃希菌，M为100bp Ladder(TaKaRa公司)；

图2是利用引物对F-080105、R-080105和16S引物检测模拟样本的多重PCR产物琼脂糖凝胶电泳图，图中每个泳道为不同的模拟样本DNA，其中，1为模拟样本1，2为模拟样本2，3为模拟样本3，4为模拟样本4，M为100bp Ladder(TaKaRa公司)；

图3是利用引物对F-080105、R-080105和探针Zc-P-080105以及16S引物和16S探针检测伤寒沙门氏菌的芯片排布图，其中，P为定位探针，N为阴性对照探针，B为空白对照，C为金黄色葡萄球菌，D为结核分支杆菌，E为志贺氏菌，F为肠出血性大肠杆菌O157，G为幽门螺旋杆菌，H为霍乱弧菌O139，I为大肠埃希杆菌，J为单核增生李斯特氏菌，K为伤寒沙门氏菌，L为肠炎沙门氏菌，M为微生物的16S基因；

图4是利用引物对F-080105、R-080105和探针Zc-P-080105以及16S引物和16S探针检测伤寒沙门氏菌的阳性样本的芯片扫描图，芯片上含有定位探针、阳性对照探针、阴性对照探针；

图5、图6、图7和图8分别为模拟样本1、2、3、4的检测芯片扫描图。

具体实施方式：

I、引物和探针设计

对已有的伤寒沙门氏菌基因组序列进行比较，选择无二级结构且高度保守的片段【伤寒沙门氏菌的H1d基因序列(GenBank X16406.1，228bp)，如SEQ ID NO.1所示】，设计多对引物和探针，引物长度一般为20个碱基左右，探针长度一般为25个碱基，引物间和引物内无互补序列，两条引物的Tm值相差不超过3℃。通过实验，筛选出最优引物和探针组合如下：

用于检测鉴定伤寒沙门氏菌核酸片段的上游引物F-080105(SEQ ID NO.2所示)序列：AATGGGCGACGATTTCTATG

用于检测鉴定伤寒沙门氏菌核酸片段的下游引物R-080105(SEQ ID NO.3所示)序列：CCATCGGTAGCAGTAACAACTTC

用于检测鉴定伤寒沙门氏菌核酸片段的探针Zc-P-080105(DNA型，P-080105序列如SEQID NO.4所示)，其序列为：Zc-CAGCTCCAGTTTGAGCAACGCCAGT，其中，Zc是与基因芯片上固定的探针Z互补的序列，Z和Zc是与所检测的物种没有同源性的任意一对互补的人工合成的长度为20-25pb的序列。本实施例中所选择的Z序列为ATCGTCACCTGTAGCGTCAA(SEQ ID NO.5所示)，Zc的序列为TTGACGCTACAGGTGACGAT(SEQID NO.6所示)。

另外，本实施例中涉及到的公知16S基因(实验中作为阳性对照)引物序列如下：

16S上游引物R-080109(SEQ ID NO.7所示)：AGGAGGTGATCCAACCGCA

16S下游引物F-080109(SEQ ID NO.8所示)：AACTGGAGGAAGGTGGGGAT。

且设计的基因芯片的阳性对照探针16S探针Zc’-P-080109(DNA型，P-080109序列如SEQID NO.9所示)，其序列为：Zc’-GGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGT，其中，Zc’是与基因芯片上固定的探针Z’互补的序列，Zc’序列为：AGCTCACCATGTACGAACTG(SEQ ID NO.10所示)，Z’序列为：CAGTTCGTACATGGTGAGCT(SEQ ID NO.11所示)。

II、PCR扩增

使用Qiagen公司商业化的DNA抽提试剂盒，按照说明书上的操作步骤，抽提样本DNA，制备DNA模板，用上述设计的引物通过单位点PCR反应或多位点的多重PCR反应对该模板进行扩增。

所采用的PCR体系为：PCR缓冲液1×，dNTP 0.15mM，上下游引物(包括上游引物F-080105、下游引物R-080105、16S上下游引物)各0.2μM，酶0.3×，DNA模板10ng(PCR反应的酶和缓冲液为Clonetech公司生产，dNTP为TaKaRa公司生产)。PCR的反应条件为：95℃变性3min；之后在95℃变性30s，62℃退火30s，68℃延伸30s的条件下循环30次；68℃延伸5min。PCR的反应体系为15ul的总体积。

III、PCR产物凝胶电泳

对II步骤所产生的PCR产物采用2.5％(g/100ml)琼脂糖凝胶进行电泳，并利用凝胶成像仪检测所产生的PCR产物。

其中，图1显示了仅使用引物对F-080105和R-080105对伤寒沙门氏菌和其他细菌样本，如沙门乙型副伤寒血清型、沙门菌鸡血清型、鼠伤寒沙门菌、肠炎沙门菌、伤寒沙门菌、沙门菌某些亚种、大肠埃希菌进行PCR的结果，该图中，只有伤寒沙门氏菌的PCR扩增产物出现且仅出现一条大小为159bp的条带，说明了该引物对用于伤寒沙门氏菌检测的特异性。

另外，由于较少在实际样本中检测到伤寒沙门氏菌，因此，以模拟样本为例进行伤寒沙门氏菌的检测。图2为使用引物对F-080105、R-080105和16S引物对四个模拟样本的多重PCR结果，其中，模拟样本1和模拟样本2中含有伤寒沙门氏菌，模拟样本3和模拟样本4中不含有伤寒沙门氏菌，由图中箭头所指位置可知，只有含有伤寒沙门氏菌的模拟样本1、2在159bp处出现一条亮带。

IV、荧光标记的产物制备

取出II步骤所产生的多重PCR产物(引物对F-080105、R-080105和16S引物扩增产物)5ul，使用3U的SAP和10U的ExoI在37℃孵育30min，纯化去除未参与PCR反应的过量引物和脱氧核苷(dNTP)，加入0.2μM探针Zc-P-080105和0.2μM 16S探针以及0.2μM的结合有荧光分子的双脱氧核苷(如Cy3-ddATP)，再加入DNA聚合酶1U，在退火温度70℃的条件下循环32次，进行单碱基延伸反应，产生带有荧光标记的产物。

V、基因芯片杂交

合成5’端带有氨基修饰的Z序列，使用点样仪将20-30ng/μl的Z点制在醛基化修饰的玻璃片基上，制备成基因芯片。而对Z’序列按照对待Z序列相同步骤，也点制在上述同一块玻璃片基上，以备阳性监测。

将IV步骤所得的带有荧光标记的产物(含有探针Zc-P-080105和16S探针)10ul，加入终浓度为6×SSPE(或6×SSC)的杂交液，使总体积为15ul，与已经固定有Z和Z’的基因芯片在48℃杂交2小时。

杂交结束后，分别使用含有2×SSC、1×SSC、0.5×SSC、无SSC的清洗液清洗未结合的物质，干燥芯片后，采用激光扫描仪进行芯片扫描，获取芯片杂交的图像。

VI、基因芯片图像分析

对V步骤所得的图像进行分析，即可得出所检测样本中是否存在有所需检测的伤寒沙门氏菌。还可进一步对V步骤所得图像进行分析，根据所得荧光信号的强度，还可以大概估算出所检测样本中伤寒沙门氏菌的含量。

其中，利用引物对F-080105和R-080105和探针Zc-P-080105以及16S引物和16S探针检测伤寒沙门氏菌的阳性样本的芯片扫描图如图4所示(样本芯片排布图如图3所示)，若检测样本中含有伤寒沙门氏菌，则芯片上伤寒沙门氏菌探针的对应位置将显示荧光，如果检测样本中没有伤寒沙门氏菌，则无荧光信号。图4所示芯片为伤寒沙门氏菌标准菌株的检测结果。

对步骤III中使用过的模拟样本1、2、3、4进行芯片检测，其芯片检测结果分别如图5、图6、图7和图8所示，其中，图5、图6、图7和图8中的定位探针、阴性对照探针、空白对照及微生物的16S基因在芯片上的排布位置与图3一样。芯片上的16S作为阳性对照，在进行任何细菌检测时，16S都应显示出荧光信号。模拟样本的芯片检测结果表明，模拟样本1和模拟样本2确实含有伤寒沙门氏菌，模拟样本3和模拟样本4不含有伤寒沙门氏菌。在进行多样本检测时，还可以根据荧光信号强度的大小，估算每个样本中伤寒沙门氏菌的多少。

综上所述，本发明的引物、探针及基因芯片，具有较强特异性，因此，能针对伤寒沙门氏菌进行特异性检测。

序列表

<110>上海生物芯片有限公司

<120>用于检测鉴定伤寒沙门氏菌核酸片段的引物、探针及芯片

<130>NP-09-13615

<160>11

<170>PatentIn version 3.3

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aatggtaaat ctgaagttgt tactgctacc gatggtaaaa cttactta                 228

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