结核分枝杆菌糖脂抗原的DNA适配子及其应用

摘要

本发明公开了一种结核分枝杆菌糖脂抗原的DNA适配子，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。实验表明本发明DNA适配子Mal与结核分支杆菌作用特异性高，亲和力强，为结核病的诊断提供了新型的制剂。同时实验表明该DNA适配子能够抑制结核分枝杆菌感染，为结核病的治疗提供了一种新的途径。

说明书

技术领域

本发明属微生物免疫和检验领域，具体涉及一种能检测人结核分枝杆菌（Mycobacterium Tuberculosis, H37Rv）[ATCC 93009（4）]的单链DNA适配子。本发明还涉及该DNA适配子在结核菌表面糖脂抗原及结核病的早期诊断及治疗中的应用。

背景技术

目前，结核病仍然是威胁人类生命健康的主要传染病之一，也是导致人类死亡的主要因素之一。据WHO统计，目前全球约有三分之一人口虽感染结核，但没有明显临床表现。因此所导致的诊断延时及误诊是导致全球结核病的进一步传播及死亡率的上升的主要原因。目前国内外结核已有的诊断技术存在许多缺陷，缺乏特异、有效、快速、方便、廉价的诊断技术和产品，特别是一直缺乏对结核抗原的敏感早期检测手段：如过去PPD（结核菌素纯蛋白衍化物 ）也常用于结核病的诊断和流行病学调查, 但是其缺乏特异性，敏感性低，有一定应用局限性；又如传统的痰抗酸染色的灵敏度难以达到，并且不能区分不同种类结核分枝杆菌； 传统的抗体检测方法存在窗口期问题，不能达到检测目的，并且不能区分是卡介苗接种还是感染结核的问题；近些年发展的RT-PCR的诊断方法虽然特异性强，但需昂贵仪器，成本高。临床上对疑似感染结核的病人，由于缺乏有效的诊断方法，常常采用先抗结核治疗，再以治疗的效果为依据来进行诊断，如此一来浪费了大量的人力物力，也可能造成对其他疾病的误诊或是延误治疗。所以，急需探索新型诊断方法对结核病，特别是对结核菌抗原进行早期诊断，以用于结核病快速、有效、方便、廉价的特异性检测，对于及时治疗结核病人和控制结核病传染疫情都具有十分重要的意义。因此，急需开发一种快速、有效、灵敏、高特异性的结核病诊断及治疗试剂，特别是急需开发一种比临床上传统使用的抗酸染色方法更灵敏和快速地用于结核菌抗原诊断的新型试剂。

脂糖是结核分枝杆菌胞壁的主要成分，大约30%结核分枝杆菌基因参与了脂类的合成和代谢。甘露糖修饰的脂阿拉伯甘露聚糖（ManLAM）是主要存在于致病的人结核分枝杆菌、牛结核分枝杆菌以及卡介苗（BCG）胞壁中的脂糖，但由于其酰基化以及糖基化修饰的不同，不同菌种中ManLAM的结构各异，是从结构上区分各种分支杆菌的分子靶标。同时，研究表明，ManLAM可以通过抑制树突状细胞（DC）的成熟、增加免疫抑制性细胞因子如白细胞介素10（IL-10）的表达、抑制白细胞介素12（IL-12）的表达以及调节性T细胞的产生等一系列机制来抑制机体的免疫功能。

SELEX（Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment）筛选技术是90年代发展起来的一种新的体外筛选技术，它运用大容量的单链随机寡核苷酸文库，并结合体外PCR扩增技术，以指数富集与靶分子特异结合的寡核苷酸配基，经过多轮筛选后获得高亲和力、特异性强的寡核苷酸适配子（aptamers），具有库容量大、亲和力高、靶分子范围广等优点，已成功运用于许多靶分子的筛选中，已经被广泛的应用于包括感染性疾病、肿瘤等的诊断制剂开发研究中，是极具诊断潜力的新型小分子制剂。然而到目前为止，还没有成功将SELEX筛选技术用于开发诊断及治疗结核分枝杆菌的试剂。

发明内容

本发明的目的是在于提供一种能与毒性结核分支杆菌H37Rv表面脂糖ManLAM特异性结合的DNA适配子。

本发明的另一个目的在于提供上述DNA适配子在制备诊断结核病试剂中的应用。

本发明的目的还在于提供上述DNA适配子在制备治疗结核病药物中的应用。

本发明通过随机单链DNA文库以及引物的构建、双链DNA文库的合成、SELEX筛选、PCR扩增、亲和力测定、体外不同细菌结合实验等得到具有与毒性结核分支杆菌H37Rv高特异性、高亲和力的DNA适配子Ma1，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

进而，本发明提供上述DNA适配子Mal在制备诊断试剂中的应用。以Ma1为模板，PCR扩增生物素以及荧光FAM标记的适配子，然后采用ElISA以及流式细胞术的方法测定与不同细菌的结和力。结果显示，适配子Ma1与毒性结核分枝杆菌H37Rv具有最高的亲和力，与其它的分支杆菌及金黄色葡萄球菌等亲和力很低, 表明该DNA适配子对结合结核菌特异性强。通过生物素标记Ma1适配子，对79例结核病人痰液及68例健康志愿者唾液进行检测分析，结果显示，适配子可以有效的检出结核病人标本，检出率以及与病人抗酸染色的符合率很高。

本发明还提供上述DNA适配子Mal在制备抗结核病药物中的应用。本发明将小鼠行毒性结核分枝杆菌攻毒后，用ssDNA适配子处理后的小鼠肺脏菌落明显少于对照组，病理变化也较对照组轻，说明ssDNA适配子可以特异性的与结核分枝杆菌表面的ManLAM结合，有效的降低结核分枝杆菌的感染。

本发明的优点和效果：

一、筛选获得的ssDNA适配子可特异性与毒性结核分枝杆菌H37Rv表面ManLAM结合，可以直接用作毒性结核分枝杆菌的诊断制剂。适配子制备简单，价格低廉，确保了获得的ssDNA适配子特异性的结合在毒性结核分枝杆菌表面，从而降低了诊断的非特异性。

二、ssDNA适配子应用于结核病的诊断中，诊断周期短，操作简单，较目前常规的结核病诊断技术如痰培养等周期明显缩短。

三、为克服临床上结核治疗出现的日益严重的耐药问题和副作用大的问题提供了新的解决思路。目前结核病治疗的常用药异烟肼、利福平、链霉素等不但杀伤结核分支杆菌，同时也对寄生在体内的多种益生菌具有杀伤作用；另外，结核分支杆菌对这些药物的耐药日益严重。本发明制备的针对毒性结核分支杆菌表面ManLAM的ssDNA适配子为小分子核酸，其分子结构不同于广谱抗生素，无耐药的可能；同时它只针对结核分支杆菌发挥作用，对益生菌无害。

四、临床标本检测试验可知，筛选获得的ssDNA适配子可以有效地检测结核病的感染，检出率以及符合率都很好，初步证实可以作为新的结核病诊断试剂。

五、动物实验结果可见，小鼠行毒性结核分枝杆菌攻毒后，用ssDNA适配子处理后的小鼠肺脏菌落明显少于对照组，病理变化也较对照组轻，说明ssDNA适配子可以特异性的与结核分枝杆菌表面的ManLAM结合，有效的降低结核分枝杆菌的感染。此外，该适配子已经克隆到pUC19载体上，且已经转化至大肠杆菌DH5a中，可以直接通过该菌种进行大量制备该适配子。

总而言之，本发明提供的DNA适配子Mal与毒性结核分支杆菌作用特异性高，亲和力强，为结核病的诊断提供了新型的制剂。克服了临床上对结核抗原诊断的非特异性、不灵敏性以及周期长的缺点。并为结核病的治疗提供了一种新的途径。

附图说明

图1.SELEX技术筛选特异性结合毒性结核分枝杆菌H37Rv表面ManLAM的ssDNA适配子扩增筛选获得的12轮ssDNA文库与ManLAM的结合能力比较示意图。

12轮筛选完成后，分别取40pmol的ssDNA文库与ManLAM作用，发现第12轮适配子库与ManLAM的结合能力最强。

图2. 适配子Ma1与不同细菌亲和能力大小的结果示意图。

其中，1毒性结合分枝杆菌（H37Rv），2卡介苗（BCG），3耻垢分枝杆菌（M.smegmatis），4胞内分枝杆菌（M.intracellulare），5鸟分枝杆菌（M.avium），6绿脓杆菌（P.aeruginosa），7金黄色葡萄球菌（S.aureus），8大肠杆菌（E.coli），9白色念珠菌（S.albus），10藤黄微球菌（M.luteus），11鼠伤寒沙门菌（S.typhimurium），12毒性结核分枝杆菌+无关适配子（H37Rv+aptamer contro）。

以Ma1为模板，PCR扩增生物素以及荧光FAM标记的适配子，然后采用ElISA以及流式细胞术的方法测定与不同细菌的结和力。结果显示，适配子Ma1与毒性结核分枝杆菌H37Rv具有最高的亲和力，与其它的分支杆菌及金黄色葡萄球菌等亲和力很低, 说明适配子Ma1结合结核菌特异性强，具有作为诊断试剂的价值。

图3. 流式细胞术检测单适配子Ma1与H37Rv、 BCG及耻垢分枝杆菌（M. smegmatis）的亲和能力。 适配子Ma1与毒性结核分枝杆菌H37Rv具有最高的亲和力，而与卡介苗以及无毒的耻垢分支杆菌亲和力很低。

图4. 适配子Ma1检测临床结核病人痰液的检测结果示意图。

通过生物素标记Ma1适配子，对79例结核病人痰液及68例健康志愿者唾液进行检测分析，结果显示，适配子可以有效的检出结核病人标本，检出率以及与病人抗酸染色的符合率很高。

图5.适配子Ma1降低结核分枝杆菌感染小鼠肺脏的菌落数。

抗酸染色证实，结核分枝杆菌H37Rv感染的小鼠在适配子Ma1作用后与未使用适配子组小鼠相比，小鼠肺脏的细菌载量明显减少，其中A为毒性结核分枝杆菌H37Rv感染后小鼠的肺脏抗酸染色，B为结核分枝杆菌H37Rv感染的小鼠在适配子Ma1作用后的肺脏抗酸染色。箭头所指为结核分枝杆菌。该动物实验结果显示Ma1还具有抑制结核菌感染和治疗结核病的价值。

图6.适配子Ma1对结核分枝杆菌感染后小鼠肺脏及脾脏病理改变示意图。

结果显示，结核分枝杆菌H37Rv感染的小鼠在适配子Ma1作用后与未使用适配子组小鼠相比，小鼠肺脏及脾脏的病理改变明显较轻。A为正常小鼠肺脏，B为结核分支杆菌感染后小鼠肺脏，C为适配子治疗后小鼠的肺脏；D为正常小鼠的脾脏，E为结核分枝杆菌感染后小鼠的脾脏，F为适配子治疗后小鼠的脾脏。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1  DNA适配子的筛选

本发明具有特异性结合毒性结核分枝杆菌H37Rv的DNA适配子的筛选方法如下：

1：构建随机单链DNA文库及引物。构建长度88个碱基的单链DNA文库：5’-GCGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGAACA GTCCGAGCC-N30-GGGTCAATGCGTCATA-3’，其中N代表A,T,C,G四个随机碱基。上游引物为：5’- GCGGAATTCTAATACGACTCAC TATAGGGAACAGTCCGAGCC-3’，画线部分为EcoRI的DNA限制性酶切位点；下游引物为：5’-GCGGGATCCTATGACGCATTG ACCC-3’，画线部分为BamHI的DNA限制性酶切位点。随机单链DNA文库以及引物均可由公司合成。

2、双链DNA（dsDNA）及单链DNA（ssDNA）文库的PCR扩增及保存：每一轮筛选前先将ssDNA文库扩增为dsDNA文库后保存，取少量dsDNA文库作为模板扩增出下一轮筛选的ssDNA文库。反应程序均为：95℃ 5min，95℃ 36s，60℃ 36s，72℃ 84s，20-30个循环，72℃ 5min。 循环次数根据具体的扩增效果进行调整。PCR产物通过3%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，胶纯化试剂盒进行回收（按照试剂盒产品说明书操作）。

3、SELEX筛选。每轮筛选所用的ssDNA量均为40pmol，使用前置于85℃水浴10分钟后迅速冰浴5min；将提纯的毒性结核分支杆菌表面的脂糖ManLAM（按照参考文献的方法进行提取纯化）溶于包被缓冲液中包被96孔ELISA板，4℃过夜；使用筛选洗脱液反复洗涤6次后加入40pmol的ssDNA文库，37℃孵育1h后用筛选洗脱液洗涤6次；在筛选孔中加入100?l 高压灭菌的双蒸水（ddH₂O），95℃加热10分钟；将孔内ddH₂O吸至新的EP管中，然后加入2倍体积的无水乙醇及1/10体积的NaAc（3M）置于-70℃沉淀过夜，最后通过凝胶回收。（SELEX筛选缓冲液为：20 mM pH 7.4 Tris·HCl，137 mM NaCl，5 mM KCl，2 mM CaCl₂，1 mM MgCl₂）

4、为了获得高特异性结合的DNA适配子，选用ManLAM梯度筛选来增加筛选压力。前三轮用8?g的ManLAM，后续筛选逐渐降低ManLAM的用量，第4轮到第9轮用0.8?g，第10到第12轮ManLAM量降为0.08?g。并从第5轮开始通过外周血单个核细胞（PBMC）进行反筛，第5至第7轮用1×10⁶的PBMC反筛，第8至第10轮用5×10⁶的PBMC反筛，第11、12轮用1×10⁷的PBMC反筛。收集第4轮获得的ssDNA适配子40pmol，使用前置于85℃水浴10min后冰浴5min；将分离的正常人PBMC包被ELISA板，加入ssDNA适配子，37℃孵育1h后吸取上清液；然后将上清液重复步骤2与ManLAM进行作用。

5、比较12轮筛选后获得的ssDNA适配子库与毒性结核分枝杆菌ManLAM的亲和力。采用ElISA的方法测定每一轮的ssDNA和ManLAM的亲和力。具体方法如下：用每一轮的dsDNA和生物素标记的引物2通过不对称PCR扩增大量的ssDNA适配子，然后琼脂糖凝胶电泳回收，测浓度后备用；用0.8?g 的ManLAM包被ELISA板，4℃过夜；用含有0.05% Tween-20 的PBS（PBST）洗6次；每孔分别加入100?L含生物素标记的每一轮的生物素标记的ssDNA（40pmol），37℃，1h；用PBST洗6次；每孔加入1：1000稀释的HRP标记的链霉亲和素37℃，30min；TMB显色。

通过检测，第12轮具有与ManLAM最高的亲和力，将第12轮ssDNA进行不对称PCR扩增，得到dsDNA产物，经DNA限制性内切酶EcoRI以及BamHI消化后连接于质粒pUC19载体（Yanisch-Perron，C.,1985）上，转化大肠杆菌DH5a（Hanahan，D.,1983），通过氨苄青霉素进行抗性筛选，挑取单克隆，提取质粒后进行测序，结果该ssDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，将之命名为Mal。

实施例2 Ma1在结核病诊断中的应用

以Ma1为模板，PCR扩增生物素以及荧光FAM标记的适配子，然后采用ElISA以及流式细胞术的方法测定与不同细菌的结和力。

ELISA法：

（1）首先用不同细菌（1X10⁵/孔）包被96孔板，然后4度，过夜。

（2）用含有0.05% Tween-20 的PBS洗6次；

（3）每孔加入含鲑鱼精DNA（100 ?g/mL）的PBS 100 ?L进行封闭，37℃，?小时；

（4）用含有0.05% Tween-20 的PBS洗6次；

（5）每孔分别加入100 ?L含生物素标记的Ma1（40pmol），37℃，?小时；

（6）用含有0.05% Tween-20 的PBS洗6次；

（7）每孔加入1：1000稀释的HRP标记的链霉亲和素100 ?L，37℃，30分钟；

（8）TMB显色10-20分钟，用0.5M的硫酸终止反应；

（9）450nm上机检测。

 流式细胞术：

（1）    用FAM-primer2（引物序列为：FAM-5’-GCGGGATCCTATGACGCATTGACCC-3’）进行不对称PCR扩增，得到带有荧光标记的单适配子。 

扩增条件：

dsDNA文库2 μL10×Buffer10 μL引物primer24 μL (25   mmol)(10mM) dNTP4 μLTaq DNA   Polymerase2 μLdH₂O78 μL总体积100 μL

反应程序：95℃，5 min，95℃，36sec；60℃，36sec；72℃，84 sec；共30个循环，72℃，5min。

（2）分别取100 μL 10⁶ CFU的H37Rv、BCG及耻垢分支杆菌于EP管中，75%乙醇固定15min后，PBS洗3次。

（3）每管加入4μg带有荧光标记的单适配子，混匀，于37℃孵育2小时。

（4）PBS洗3次，加入1mL PBS后上流式检测。

结果如图2和3所示，适配子Ma1与毒性结核分枝杆菌H37Rv具有最高的亲和力，与其它的分支杆菌及金黄色葡萄球菌等亲和力很低, 说明适配子Ma1结合结核菌特异性强，具有作为诊断试剂的价值。

通过生物素标记Ma1适配子，对79例结核病人痰液及68例健康志愿者唾液进行检测分析。方法是：

1、  首先以Ma1为模板，PCR大量扩增生物素标记的适配子（方法同上述流式细胞术中的PCR扩增），然后将正常人及病人痰液用3%NaOH等比稀释，使其粘稠度下降。

2、  然后分别加到ELISA板孔中（100μL /孔），最后采用ELISA的方法（方法同实施例2中ELISA法）测定它们的亲和力。

Cut-off值的计算：由于测定的结果为非正态分布，则用百分位数法单侧95％来确定Cut-off值，根据结果计算可得cut-off值为0.185。

结果如图4显示，适配子可以有效的检出结核病人标本，检出率以及与病人抗酸染色的符合率很高。

实施例3 Ma1对结核菌的抑制作用 

用10⁷CFU（400μl）的H37Rv感染Balb/c小鼠，小鼠分两组，每组6只，第一组小鼠感染后不作处理，第二组小鼠感染后用适配子Ma1治疗，感染后三天每只小鼠分别注射5?g适配子，每隔三天注射一次，共注射三次。所有小鼠均为尾静脉注射，实验前H37Rv均经过小鼠体内传代，以保证足够的毒力。

抗酸染色证实（图5），结核分枝杆菌H37Rv感染的小鼠在适配子Ma1作用后与未使用适配子组小鼠相比，小鼠肺脏的细菌载量明显减少，其中A为毒性结核分枝杆菌H37Rv感染后小鼠的肺脏抗酸染色，B为结核分枝杆菌H37Rv感染的小鼠在适配子Ma1作用后的肺脏抗酸染色。箭头所指为结核分枝杆菌。该动物实验结果显示Ma1还具有抑制结核菌感染和治疗结核病的价值。

适配子Ma1对结核分枝杆菌感染后小鼠肺脏及脾脏病理改变如图6所示，结核分枝杆菌H37Rv感染的小鼠在适配子Ma1作用后与未使用适配子组小鼠相比，小鼠肺脏及脾脏的病理改变明显较轻。

序列表

 

<110> 武汉大学

 

<120> 结核分枝杆菌糖脂抗原的DNA适配子及其应用

 

<130> 

 

<160> 4    

 

<170> PatentInversion3.5

 

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

 

<400> 1

CCCTGATTCCCCCTCATCCGATGGACATCT                                   30

 

 

<210> 2

<211> 88

<212> DNA

<213> 人工序列

 

 

<220>

<221> misc_feature

<222> (43)..(72)

<223> nisa,c,g,ort

 

<400> 2

gcggaattctaatacgactcactatagggaacagtccgagccnnnnnnnnnnnnnnnnnn      60

 

nnnnnnnnnnnngggtcaatgcgtcata                                         88

 

 

<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

 

<400> 3

gcggaattctaatacgactcactatagggaacagtccgagcc                         42

 

 

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

 

<400> 4

gcgggatcctatgacgcattgaccc                                            25