不能在蚊子中复制的减毒重组甲病毒及其用途

摘要

本发明公开了不能在蚊子细胞中复制并且不能通过蚊子载体传播的减毒重组甲病毒。这些减毒甲病毒可以包括但不限于西部马脑炎病毒、东部马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒或基孔肯雅病毒。本发明还公开了产生这类甲病毒的方法和它们作为免疫原性组合物的用途。

说明书

相关申请的交叉引用

本国际申请要求现已被放弃的于2008年1月24日提交的流水号为61/062,229的美国临时申请的权利，在此通过引用将其整体并入。

联邦基金会(Federal Funding Legend)

本发明部分使用由国家健康研究中心/国家过敏和传染病研究中心的奖励1U54 AI057156获得的基金来进行。因此，联邦政府具有本发明的某些权利。

发明领域

本发明涉及甲病毒的分子生物学、病毒学和免疫学领域。具体来说，本发明提供不能感染蚊子的减毒重组甲病毒，并公开了产生这类甲病毒的方法及这些减毒甲病毒在免疫原性组合物中的用途。

相关技术说明

披膜病毒科(Togaviridae)的甲病毒属(Alphavirus)包含大量重要的人类和动物病原体。除了南极地区，这些病毒广泛分布于所有的大陆上，并代表了重要的公共健康威胁(18，39)。在自然条件下，大多数甲病毒通过蚊子传播，其中它们引起对载体的生物功能具有较小影响的持久、终生的感染。在蚊子吸食血液期间被蚊子感染的脊椎动物中，甲病毒引起特征为高滴度病毒血症(high-titer viremia)的急性感染，其是新蚊子感染及其在自然界中传播的前提条件。

委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)是甲病毒属中最重的致病成员之一。其在南美洲、中美洲和北美洲持续传播并引起涉及人类、马和其它家畜的散发性流行病和家畜流行病。在委内瑞拉和哥伦比亚(1995)，在最近涉及亚型IC VEEV的大爆发期间，出现约100,000人类病例，估计超过300起致命脑炎案例(37)。在VEEV家畜流行病期间，归因于脑炎的马的死亡率能够达到83％，并且，虽然人类的总死亡率较低(＜1％)，但能够在高达14％的感染个体，特别是儿童中检测到包括定向障碍、共济失调、精神萎靡和惊厥在内的神经系统疾病(21)。由VEEV引起的人类疾病的特征在于伴有寒战、严重头痛、肌痛、嗜眠和咽炎的发热疾病。年轻和年长的个体发展为伴有严重淋巴缺失的网状内皮组织感染以及随后的脑炎。CNS感染的结果是导致神经细胞死亡的急性脑膜脑炎(9)。神经系统症状在疾病发作的4-10天内出现并且包括突然发作、轻瘫、行为变化和昏迷。

尽管VEEV疫病持续地威胁，仍未设计出用于该病毒的安全有效的疫苗。40多年前，已经通过在豚鼠心脏细胞中对VEEV的高毒性特立尼达岛猴(Trinidad donkey，TRD)菌株进行连续传代来开发VEEV减毒TC-83菌株(4)。目前，TC-83仍是实验室人员和军方服役人员唯一可用的疫苗。超过8,000的人群已接种(2，8，34)，并且累积的数据清楚地表明，几乎40％的所有受接种者出现伴有通常为天然VEE的某些症状的疾病，包括发热、全身疾病和其它副作用(2)。该TC-83菌株在皮内注射和皮下注射接种后普遍地杀死新生但未成年小鼠(31)，并因此是用于进一步衰减和研究突变对病毒发病机制影响的良好原材料。

VEEV基因组为模拟细胞mRNA结构的近12-k的正极性单链RNA分子。基因组RNA包含5’甲基鸟苷酸帽和3’多聚腺苷酸尾(24)，即基因组RNA从核壳体中释放后直接允许通过宿主细胞机制翻译病毒蛋白的特征。将5’三分之二的基因组翻译为非结构蛋白(nsP)，其包含病毒基因组复制和亚基因组RNA转录所需要的复制酶复合物(replicative enzyme complex)的病毒组分。亚基因组RNA对应于3’三分之一的基因组，其由亚基因组启动子合成并被翻译为病毒结构蛋白。VEEV菌株TC-83的减毒表型为该菌株TRD基因组中两个突变的结果：其中一个突变取代E2糖蛋白位置120处的氨基酸，以及另一突变改变5’UTR的nt 3(11，23，24，43)。因此，如果诸如体内病毒传代的适当选择性条件出现，由于甲病毒非常高的突变率，则TC-83回复突变为致病表型仍然是一主要的忧虑。此外，VEEV TC-83能够在蚊子细胞中复制，并且在接种后感染蚊子(32)；由此，其仍然可能通过蚊子传播。

理想的是，活虫媒病毒疫苗菌株不应当通过节肢动物载体传播，因为在储存宿主之间的传播能够导致包括毒力增加的无法预料的变化。对于依靠易于回复突变的少量减毒突变的野生型病毒所产生的减毒菌株，或者对于经受了载体来源的传播而以不可预知方式进化的遗传修饰的菌株，这尤其是正确。通过1971期间在路易斯安那州收集的蚊子中检测到VEEV TC-83疫苗菌株，强调了前者的风险(32)，路易斯安那州是限于德克萨斯州的家畜流行病/流行病之外的区域。

甲病毒感染性cDNA的开发，为通过广泛修饰病毒基因组来探索它们的减毒提供了机遇，即将向wt致病表型的回复突变最小化或排除的方法。此外，这类甲病毒的基因组能够改造为含有仅在脊椎动物来源而不是昆虫来源的细胞中起作用的RNA元件。由此，这样广泛的突变能够防止基因修饰的病毒通过蚊子载体传播。

不管其作为新兴的人类和动物病原体的重要性，其作为生物武器的潜力和对于减毒甲病毒应用的忧虑，现有技术仍然缺乏产生仅能够在脊椎动物细胞中复制的甲病毒减毒菌株的方法。本发明实现了本领域长期存在的需求和期望。

发明概述

在本发明一个实施方案中，提供了产生减毒重组甲病毒的方法。这类方法包括在甲病毒非结构蛋白4(nsP4)编码序列的末端和亚基因组RNA编码序列的起始AUG之间克隆脑心肌炎病毒的内部核糖体进入位点(EMCV IRES)，代替亚基因组RNA的天然5’UTR。在本发明另一个相关实施方案中，提供了由以上讨论的方法产生的减毒重组甲病毒。

在本发明另一相关实施方案中，提供了包含编码减毒重组甲病毒的核苷酸序列的载体和包含并表达该载体的宿主细胞。在本发明另一相关实施方案中，提供了药物组合物。该组合物包含以上讨论的减毒重组甲病毒和药用可接受载体。在本发明相关实施方案中，提供了免疫原性组合物。该免疫原性组合物包含本文所述的毒重组甲病毒。

在本发明另一相关实施方案中，提供了保护个体不受暴露于甲病毒而导致的感染危害的方法。这类方法包括给予免疫有效量的包含本文所述减毒重组甲病毒的免疫原性组合物，由此保护个体而不受暴露于甲病毒而导致的感染的危害。

附图简述

图1A-1D表示重组EMCV IRES-编码的、VEEV TC-83-衍生的病毒在BHK-21细胞中的复制。图1A为设计的病毒基因组的示意图，在感染性中心试验中体外合成的RNA的感染性，1mg体外合成的RNA转染至BHK-21细胞后24h的病毒滴度，以及转染后48h BHK-21细胞中由所示病毒形成的噬斑的大小。箭头表示功能性亚基因组启动子。填充的框(filled box)表示EMCV IRES。图1B表示含有亚基因组启动子的VEEV TC-83基因组片段和相应的VEEV/mutSG/IRES片段的比对。开放框(open box)表示启动子的位置。VEEV TC-83基因组中亚基因组RNA的开始(start)和EMCV IRES的起点(beginning)以箭头表示。引入VEEV/mutSG/IRES基因组中的突变以小写字母表示。图1C表示转染后24h收获的在BHK-21细胞中由病毒形成的噬斑。图1D表示将1mg体外合成的RNA转染至BHK-21细胞后病毒的复制。

图2A-2C表示在噬斑纯化的VEEV/mutSG/IRES变体中发现的突变，这表明了在BHK-21细胞中更有效的复制和限定的适应性突变对VEEV TC-83和VEEV/mutSG/IRES复制的影响。图2A表示与公开的VEEV TC-83的序列相比，在噬斑分离物的基因组中发现的突变列表(24)。图2B为具有一个或两个确认的突变的VEEV TC-83和VEEV/mutSG/IRES基因组和在感染性中心试验中体外合成的病毒RNA的侵染性的示意图。功能性亚基因组启动予以箭头表示，且EMCV IRES以填充的框表示。图2C表示在转染1mg体外合成的病毒基因组后，设计的病毒在BHK-21细胞中的复制。

图3A-3B表示在表现出大噬斑表型的VEEV/mutSG/IRES变体的nsP2蛋白中确认的突变。图3A表示在体外合成的RNA转染后24h收获的来自病毒储存液的噬斑纯化的分离物(原始的)基因组中，和在Vero细胞中另外传代三次的储存液分离物(传代的)的基因组中确认的突变的列表。图3B表示限定的突变在VEEV nsP2中的定位。示出了目前已知的功能性结构域在甲病毒nsP2中的位置(38，39)。

图4A-4B表示在用体外合成的重组病毒转染的RNA BHK-21细胞中，蛋白和RNA合成的分析。将细胞用4mg所示的RNA进行电穿孔并植入35-mm培养皿中。在图4A中，在转染后4.5h，将孔中的培养基用1ml补充了10％FBS、ActD(1mg/ml)和[³H]尿苷(20mCi/ml)的aMEM替换。当在37℃下孵育4h后，将RNA分离并通过琼脂糖凝胶电泳分析。病毒基因组和亚基因组RNA的位置分别以G和SG表示。相比其它产生亚基因组RNA的病毒，VEEV/IRES-特异性亚基因组RNA形成更扩散的带，因为在凝胶中，其与核糖体28S RNA共迁移。在图4B中，转染后12h，将蛋白用[³⁵S]甲硫氨酸代谢标记并在十二烷基硫酸钠-10％聚丙烯酰胺凝胶上分析。将分子量标记物(kDa)的位置在凝胶左侧示出。将病毒结构蛋白C、E1和p62(E2的前体)的位置在凝胶右侧示出。星号表示IRES编码病毒复制所诱导的细胞蛋白(热休克蛋白)的位置。

图5A-5C表示在C₇10细胞中包含EMCV IRES的重组VEEV变体的传代。图5A为病毒基因组的示意图。箭头示出功能性亚基因组启动子的位置。填充的框表示EMCV IRES的位置。图5B表示在C₇10细胞中传代后重组病毒的滴度。将35-mm培养皿中的细胞用400ml的病毒样品感染，所述病毒样品在用体外合成的RNA(P1)转染BHK-21细胞后24h收获或者感染C₇10细胞后48h收获。虚线表示检测极限。图5C表示在噬斑纯化的VEEV/IRES变体中确认的含有IRES的序列的缺失，这表明在C₇10细胞中的有效复制。残留的EMCVIRES-特异性序列以小写字母表示。

图6表示VEEV/mutSG/IRES/1和VEEV TC-83在NIH 3T3细胞中的复制。以10PFU/细胞的MOI感染细胞。在所示时间点替换培养基，并在BHK-21细胞上通过噬斑试验测量病毒滴度。用相同的样品测量生物学试验中IFN-a/b的释放。释放的IFN-a/b的浓度以国际单位(IU)/ml表示。

图7表示用VEEV TC-83和VEEV/mutSG/IRES/1病毒感染的小鼠的存活。将六日龄的NIH瑞士小鼠用浓度为约10⁶PFU的所示病毒皮内注射接种。将动物监测2月。在感染9天后，在这些试验中的任何实验中均未出现死亡。

图8表示成年小鼠接种及激发后的存活。将5-6周龄的雌性NIH瑞士小鼠用约为10⁶PFU剂量的VEEV菌株TC-83或重组病毒皮下注射免疫，免疫后三周，将小鼠用约为10⁴PFU的VEEV菌株3908皮下注射激发，并记录死亡率。

图9表示产生不能感染蚊子的减毒重组甲病毒的示意方法。

发明详述

本发明涉及开发甲病毒减毒菌株的新策略。这些减毒甲病毒仅能够在脊椎动物细胞中复制。通过使病毒结构蛋白的翻译并最终病毒的复制依赖于脑心肌炎病毒的内部核糖体进入位点(EMCV IRES)实现这种表型。这类重组病毒是有生存力的并在新生小鼠中表现出高度的减毒表型，但仍然诱导针对VEEV感染的保护性免疫。此外，福尔马林失活的疫苗价格昂贵并且效率较低。除此以外，这些疫苗还需要多次重复接种。此外，对VEEV感染唯一有效的活减毒疫苗是完全反应原性的，并且在蚊子吸食接种的马的血液期间感染蚊子。由于减毒表型是不可逆的，相比目前可用的疫苗，本文所讨论的减毒甲病毒提供了显著的优势。此外，基因工程甲病毒不能在蚊子细胞中复制，从而提出了用于产生不能在蚊子中复制并由此不能在自然界传播的新的活重组病毒的新方法。

辛德毕斯(Sindbis)和其它甲病毒感染性cDNA克隆的开发(12，25，36)不仅为旨在研究病毒生物学和致病机理不同方面的反向遗传学实验带来了的机会，而且还为新重组疫苗的开发带来了机会。通过在组织培养或鸡胚胎中传代，病毒的衰减(29)通常由结构和非结构基因中以及病毒基因组顺式作用元件中少量点突变的累积造成。例如，VEEVTC-83疫苗菌株的衰减仅依靠2个点突变，并且高度的反应原性(34)可能反映该衰减机理的不稳定性。这引起了有关病毒在接种的个体中在复制期间可能回复突变为wt致病表型的忧虑。能够通过化学诱变使突变的数目额外增加(28)，但该过程也不使引入的变化不可逆。用RNA⁺病毒感染性cDNA克隆进行的基因操作，为病毒基因组的更强修饰带来了更大的可能性，并且为引入使其不能回复突变为wt基因组序列的广泛缺失(5，6，10，19)或可能增强的变体免疫原性的其他基因材料提供了机会。

主要的忧虑还在于，可能将基因改变的虫媒病毒引入通过蚊子载体介导的自然循环中，并且长期复制过程中在蚊子中或病毒血症发展期间在脊椎动物宿主中表现出进一步进化。实例为VEEV TC-83的用途，VEEV TC-83能够在马科动物中产生足以感染蚊子的病毒血症水平。在1971的德克萨斯州流行病期间，从在路易斯安那州收集的天然感染的蚊子中分离到TC-83(32)，强调了减毒甲病毒传播的风险。因此，在设计新一代活疫苗菌株时，应当谨慎地使虫媒病毒不仅高度衰减而且仅能够在脊椎动物来源的细胞中复制。这可通过将细胞-特异性RNA元件克隆至病毒基因组中来实现。相对于蟋蟀麻痹病毒IRES(20)，预料EMCV-特异性元件在节肢动物细胞中的作用完全无效。

在本发明中，将EMCV IRES克隆至VEEV TC-83基因组中，使病毒结构基因的翻译为IRES依赖性的。基因组之一在亚基因组RNA的5’UTR中含有功能性亚基因组启动子和IRES。该病毒是有生存力的，但其产生亚基因组RNA的能力促使进一步的进化，这导致IRES缺失和很可能回复突变为结构蛋白的标准的帽依赖性翻译。后者的缺失使其能够在蚊子细胞中复制。根据其不能回复突变为帽依赖性翻译，在亚基因组启动子中具有多重突变的第二变体是稳定的。因为这类回复突变不仅需要IRES缺失，而且还需要亚基因组启动子的修复，我们通过13个突变使所述亚基因组启动子的修复失活，这些多重突变的直接回复突变可能代表了微不足道的风险。然而，通过在nsP2基因中累积其他的适应性突变，该变体为进化为更有效的复制表型发展了令人感兴趣的途径。这些突变未显著地改变病毒RNA复制水平、病毒结构蛋白的合成或它们在细胞中的区域化。检测的突变也未产生能够增加基因组包装效率的其他迹象。因此，它们作用的机制仍待确定。然而，累积的公布数据表明RNA⁺病毒基因组的包装由复制复合物强力决定，并且该基因组需要通过功能性nsP呈递为用于粒子形成的结构蛋白(22，30)。本文的科学工作假说(working hypothesis)在于，nsP2的解旋酶结构域可能参与用于将病毒基因组包装成核壳体的病毒基因组的呈递，并因此确认的突变可能对该过程的效率具有积极的效果。

应当指出，本发明的目的是开发不能在节肢动物载体中复制并表现出稳定的、更减毒表型的VEEV变体。设计的VEEV/mutSG/IRES/1变体在IFN-α/β感受态细胞和IFN-信号缺失BHK-21细胞中的缓慢生长，其在组织培养中诱导较高水平IFN-α/β的能力，其显著降低的甚至在皮内注射接种后杀死新生小鼠的能力，以及其不在蚊子细胞中复制的能力表明，该变体可能满足这些需要。在不同的动物模型中将进一步研究其免疫原性。此外，据信，通过使用类似的基于EMCV IRES的策略能够使其它致脑炎甲病毒衰减，所述策略能够与最近几年开发的其他方法联合使用(1，13-15，31)。

总之，本发明的目的是减毒甲病毒的开发和其作为抗致脑炎甲病毒的新型疫苗的应用，所述致脑炎甲病毒包括VEEV、EEEV和WEEV和其它在人类和家畜中引起疾病的诸如基孔肯雅病毒(Chikungunya virus)的其它甲病毒。这类甲病毒的复制将依赖于EMCV IRES，所述EMCV IRES使它们不能在蚊子细胞或蚊子载体中复制。更重要的是，因为引入病毒基因组中的广泛修饰，所以该表型是不可逆的。因此，这些新的变体能够用于接种，而不用担心它们通过天然蚊子载体传播的可能性。

本发明涉及产生减毒重组甲病毒，包括以下步骤：在甲病毒非结构蛋白4(nsP4)编码序列的末端和亚基因组RNA编码序列的起始AUG之间克隆脑心肌炎病毒的内部核糖体进入位点(EMCV IRES)，代替天然5’UTR。该方法还可以包括通过在亚基因组RNA中成簇的点突变和天然5’UTR的缺失使甲病毒亚基因组启动子失活。此外，亚基因组启动子的失活可以不修饰非结构蛋白4的羧基端。另外，该方法还可以在非结构蛋白2(nsP2)中引入有效增加病毒复制、释放和病毒滴度的适应性突变。非结构蛋白2中适应性突变的实例可以包括但不限于Y₃₇₀→C、K₃₇₁→Q、P₃₄₉→T、D₄₁8→A、K₄₂₃→T或其组合。此外，甲病毒的实例可以包括但不限于委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)、东部马脑炎病毒(EEEV)、西部马脑炎病毒(WEEV)或基孔肯雅病毒。

本发明还涉及通过以上讨论的方法所产生的减毒重组甲病毒。这类甲病毒不能在蚊子中复制，不能通过蚊子载体传播，能够诱导高水平IFN α/β，能IFN α/β细胞中的缓慢生长，能在IFN信号缺失BHK-21细胞中缓慢生长，或其组合。

本发明还涉及包含编码以上讨论的减毒重组甲病毒的核苷酸序列的载体和包含并表达该载体的宿主细胞。构建载体并在细胞中表达它们是本领域众所周知且标准的技术。因此，本领域技术人员可以基于本领域可以使用的常规试验和知识来构建这类载体。

本发明还涉及包含以上讨论的减毒重组甲病毒和药用可接受载体的药物组合物。本发明还涉及包含本文的减毒重组甲病毒的免疫原性组合物。

本发明还涉及保护个体不受暴露于甲病毒而导致的感染危害的方法，所述方法包括以下步骤：给予免疫有效量的以上讨论的免疫原性组合物，由此保护个体不受暴露于甲病毒而导致的感染的危害。受益于所述方法的个体可以为人类或家畜。

本发明还涉及产生不能感染蚊子的减毒重组甲病毒的方法，所述方法包括以下步骤：将脑心肌炎病毒的内部核糖体进入位点和病毒壳体基因克隆至包膜糖蛋白基因下游，且所述病毒壳体基因位于亚基因组区3’末端，恰好在3’UTR的上游，其中病毒壳体以帽非依赖性方式表达且包膜蛋白基因以帽依赖性方式翻译，但病毒壳体蛋白以IRES依赖性方式翻译。

如本文所使用的，术语“a(一个)”或“an(一个)”可以表示一个或多个。如本文在权利要求中所用的，当其与词语“包含”结合使用时，词语“a”或“an”可以表示一个或多于一个。如本文所用的“另一个”或“其它”可以表示至少另一个或多个相同或不同的主张的要素或其组分。

通过诸如皮下、静脉内、肠胃外、腹膜内、皮层内、肌肉内、局部或鼻部的本领域任何方法标准能够单独地或者全身地或局部地给予本文所述的组合物。本文所述组合物的剂量制剂可以包含适合给药方法的常规非毒性生理的或药用可接受载体或介质，并且为本领域技术人员所熟知。

本文所述组合物可以单独地给药一次或多次，以实现、保持或改善治疗效果。本领域技术人员熟知如何确定剂量或者该组合物的适当剂量是否包含单次给药剂量或多次给药剂量。适当的剂量取决于个体的健康、甲病毒所引起的感染的免疫反应的诱导和/或预防，给药途径和所用的制剂。

给出的以下实施例旨在说明本发明的各种实施方案，并非以任何方式限制本发明。本领域技术人员应当容易地理解本发明非常适合实现这些目的并达到提及的目标和优势，以及本文固有的那些目的、目标和优势。本领域技术人员应当想到其中的变化和其他用途，所述变化和用途包括于权利要求的范围所限定的本发明的精神中。

实施例1

细胞培养物

BHK-21细胞由Paul Olivo(Washington University，St.Louis，Mo)提供，并且Vero细胞由Charles Rice(Rockefeller University，NY，NY)提供。NIH 3T3细胞由美国菌种保存中心(American Type Tissue Culture Collection)(Manassas，VA)获得。这些细胞系于37℃下维持于补充了10％胎牛血清(FBS)和维生素的α极限必需培养基(aMEM)中。蚊子C₇10细胞由Henry Huang(Washington Univ.，St.Louis，MO)获得，并且使之在补充了10％热失活的FBS和10％磷酸胰蛋白肉汤(TPB)的DMEM中繁殖。

实施例2

质粒构建

将标准重组DNA技术用于所有的质粒构建。图谱和序列根据要求从作者获得。在其它地方描述了具有在SP6 RNA聚合酶启动子的控制下的VEEV TC-83基因组的原始质粒pVEEV TC-83(33)。pVEEV/IRES含有带有EMCV多聚蛋白的最初4个密码子的EMCVIRES。将该序列克隆至5’UTR末端和起始AUG之间的VEEV亚基因组RNA编码序列中。pVEEV/mutSG/IRES编码VEEV TC-83基因组，其中亚基因组启动子通过成簇的点突变失活，所述成簇的点突变未修饰nsP4羧基端的氨基酸序列(图1A和1B)。该病毒基因组缺失亚基因组RNA的5’UTR。因此，预料VEEV TC-83非结构和结构蛋白由相同的基因组RNA来合成。通过所选变体目的片段的PCR扩增，随后通过原始基因组中相应片段的替换，将适应性突变引入pVEEV/mutSG/IRES编码的nsP2中。使用基于PCR的相同的技术于将不同的片段合成克隆至VEEV/mutSG/IRES基因组3’UTR的SphI位点。在用拯救的病毒进行其他实验前，将所有克隆的片段测序。

实施例3

RNA转录

将质粒通过CsCl梯度离心纯化，并通过MluI消化来线性化。在帽类似物的存在下，通过SP6 RNA聚合酶(Ambion)合成RNA(New England Biolabs)。转录物的产量和完整性在非变性条件下通过凝胶电泳来分析。在FluorChem成像器(Alpha Innotech)上测定RNA浓度，将转录反应用于电穿孔，而无需额外纯化。

实施例4

RNA转染

使BHK-21细胞的电穿孔在前述条件下进行(27)。为了拯救病毒，将1g体外合成的病毒基因组RNA电穿孔至细胞中(27)，随后将它们植入100-mm培养皿中，并孵育至观察到细胞病变效应为止。使用标准噬斑实验在BHK-21细胞上测定病毒滴度(26)。

为了评估RNA感染性，将电穿孔的BHK-21细胞的十倍稀释液植入包含分流的原初细胞的6孔Costar平板中。在含5％CO₂的孵育箱中于37℃下孵育1h后，将细胞用补充有3％FBS的含有0.5％超纯琼脂糖的2ml MEM覆盖。于37℃培养两天后，将噬斑用结晶紫染色，并以每g转染的RNA的空斑形成单位(PFU)/mg来测定侵染性。

实施例5

病毒基因组测序

在病毒储存液滴定期间，随机选择大噬斑(不用中性红染色)。将病毒从琼脂糖胶块中提取至MEM中，并将后者的培养基的等分试样用于感染35-mm培养皿中的BHK-21细胞。当深度CPE发展后，收获病毒储存液，用于进一步表征，并根据制造商(Invitrogen)的说明书通过TRizol试剂，从感染的细胞中分离RNA。使用标准的RT-PCR技术，合成长度为约1000nt的重叠片段，通过琼脂糖凝胶电泳纯化并测序。通过使用其它地方所述的FirstChoice RLM-RACE试剂盒(Ambion)，进行5’UTR的测序(16)。

实施例6

病毒复制分析

将五分之一电穿孔的细胞植入35-mm培养皿中。在图中所示的时间点，将培养基替换并在BHK-21细胞中通过噬斑试验来测定病毒滴度(26)。或者，将BHK-21、NIH3T3或C₇10细胞植入35-mm培养皿中，并在图中示出的MOI处感染。用新鲜的培养基替换培养基，并在BHK-21细胞中通过噬斑试验测定收获的样品中病毒滴度。

实施例7

蛋白合成分析

将BHK-21细胞用4mg所示的RNA进行电穿孔，并将五分之一电穿孔的细胞植入六孔Costar平板中。转染后12h，通过在0.8ml缺乏甲硫氨酸的DMEM培养基中孵育30min，对蛋白进行代谢标记，将所述DMEM培养基补充了0.1％FBS和20Ci/ml的[³⁵S]甲硫氨酸。该孵育后，将它们刮入培养基中，通过离心沉淀，并溶解于100μl标准蛋白上样缓冲液中。将等量蛋白上样至十二烷基硫酸钠(SDS)-10％聚丙烯酰胺凝胶上。电泳后，将凝胶干燥并放射自显影。

实施例8

RNA分析

为了分析病毒-特异性RNA的合成，将细胞用4mg体外合成的病毒RNA进行电穿孔，并将五分之一的细胞植入35-mm培养皿中。转染后4.5h，将孔中的培养基用1ml补充有10％FBS、ActD(1μg/ml)和[³H]尿苷(20Ci/ml)的aMEM替换。于37℃孵育4h后，根据制造实验方案，通过Trizol(Invitrogen)，分离总细胞RNA，随后在二甲亚砜中用乙二醛变性并通过使用上述条件的琼脂糖凝胶电泳来分析(7)。将凝胶用2，5-二苯基噁唑(PPO)浸渍，干燥并放射自显影。

实施例9

IFN-α/β试验

通过前述生物学试验，测量培养基中IFN-α/β的浓度(41)。简言之，在96-孔平板中将L929细胞以5×10⁴细胞/孔的浓度植入100ml完全培养基中，并在37℃下孵育6h。将从感染的NIH 3T3细胞收获的培养基样品用UV光处理1h，并直接在具有L929细胞的孔中以二倍步骤连续稀释。于37℃孵育24h后，将另外100ml具有2×10⁵PFU疱疹性口炎病毒(VSV)的培养基添加至孔中，并继续孵育36h-40h。随后将细胞用结晶紫染色，并将终点测定为保护50％的细胞免于VSV-诱导的CPE的危害所需的IFN-α/β的浓度。用于结果标准化的IFN-α/β标准品从ATCC购买，且在BHK-21细胞中通过噬斑试验测定释放的病毒的滴度。

实施例10

蚊子中病毒复制的评估

为了评价在蚊子体内的复制能力，使用1μL体积中约10⁵PFU，胸廓内接种埃及斑蚊(Aedes aegypti)(源自德克萨斯州加尔维斯敦(Galveston，Texas)的群体)。之所以选择胸廓内接种而不是口服暴露，是因为几乎任何库蚊易于通过任何甲病毒胸廓内感染，而口服易感性是高度可变的并且较不敏感(42)。使用玻璃移液管接种后，将蚊子于27C下孵育10天，随后在1mL补充有20％FBS和两性霉素B的MEM中单独滴定。随后将100μL体积的每一滴定的蚊子添加至24孔板上的Vero细胞单层并观察细胞病变效应5天以检测感染。试验对照包括TC-83亲本病毒和IRES突变体。

实施例11

用毒性VEEV免疫和激发

以20μl PBS总体积中约10⁶PFU的剂量，用VEEV TC-83菌株或设计的突变体大脑内(皮内注射)接种六日龄NIH瑞士小鼠。感染后，将每一组8只至10只动物，维持两个月而不进行任何处理。持续21天，每日观察小鼠的疾病(翘毛(ruffled fur)、精神萎靡、食欲减退和/或麻痹)和/或死亡症状。

使用VEEV TC-83或重组病毒以约10⁶PFU/小鼠的剂量接种8周龄雌性NIH瑞士小鼠，随后用约10⁴PFU的高毒性VEEV菌株3908皮下激发4周。持续21天，小鼠的疾病(翘毛、精神萎靡、食欲减退和/或麻痹)和/或死亡症状每日观察两次。

实施例12

基于重组VEEV TC-83的病毒

本研究的理论基础是开发能够在脊椎动物细胞但不能在蚊子来源的细胞中有效复制的甲病毒。因此，这类病毒的复制必须依赖于仅在脊椎动物中而不在昆虫细胞中起作用的蛋白或RNA序列。为了实现该目标，本发明设计了使甲病毒结构蛋白的表达依赖于EMCV IRES的方法。设计的IRES不含多聚(C)序列但保留了EMCV多聚蛋白的最初4个密码子，以实现VEEV TC-83结构基因的最有效翻译。在随后的实验中，已经证实这些其他氨基酸对病毒复制没有负面效应，但对病毒结构蛋白的翻译具有可检测的积极效果(未显示数据)。

在一构建体VEEV/IRES中，将IRES序列克隆至完整5’UTR下游亚基因组RNA中(图1A)。由此，预料该基因组能够进行亚基因组RNA合成。在另一重组体VEEV/mutSG/IRES中，通过13个同义点突变使亚基因组启动子失活(图1A和1B)，预料这防止回复突变为活性SGRNA启动子。为了促进VEEV结构蛋白的合成，克隆IRES序列以取代26S 5’UTR。

体外合成VEEV/IRES、VEEV/mutSG/IRES和未修饰的wt VEEVTC-83的基因组RNA，并转染至BHK-21细胞中。在感染性中心试验中，VEEV/IRES RNA表现出与TC-83RNA相同的感染性，并且发展了类似于那些TC-83的统一大小的噬斑(图1A和1C)。这强烈地表明设计的病毒的生产性复制不需要额外的适应性突变。VEEV/IRES复制至超过10⁹PFU/ml的滴度，但这些最终滴度和病毒复制速率比VEEVTC-83的低得多(图1D)。使用缺乏亚基因组启动子的另一重组病毒基因组VEEV/mutSG/IRES转染的BHK-21细胞产生感染性病毒的效率非常低(图1D)。在感染性中心试验中，该构建体主要表现出细小的噬斑，并且它们的数目难以估计。令人惊讶的是，该病毒在连续传代后表现出进一步进化，并迅速发展了产生更大噬斑的变体(图1C和未示出的数据)。图1D中所示的生长曲线表示形成小噬斑和大噬斑的病毒的释放。

因此，这些试验的结果表明，至少在VEEV/IRES基因组的情况下，EMCV IRES能够产生的结构蛋白的水平，足以用于VEEV复制。具有突变的亚基因组启动子的构建体VEEV/mutSG/IRES产生能够用于更有效复制而进化的复制缺陷病毒。

实施例13

VEEV/mutSG/IRES中适应性突变的分析

VEEV/mutSG/IRES向大噬斑表型的进化表明，在病毒基因组中其他突变的累积。由于大量引入的点突变，向wt基因组序列的回复突变是不可能的事件，因此适应性突变的位置难以预计。为了确认突变，随机选择电穿孔后24h收获的VEEV/mutSG/IRES样品的5个噬斑，并且对2个噬斑纯化变体的整个基因组(包括3’和5’UTR)进行测序。已确认的突变的列表如图2A所示。它们中大多数为同义的，并且不存在于已知的顺式作用RNA元件中。因此，它们对病毒复制的作用非常地不可靠。然而，两个噬斑分离物的基因组在nsP2蛋白中含有相同的突变Y₃₇₀→C，且基因组中之一也使邻近的编码的aa发生变化(K₃₇₁→Q)。

为了检测突变对病毒复制的影响，将Y₃₇₀→C和Y₃₇₀→C以及K₃₇₁→Q克隆至原始VEEV/mutSG/IRES的构建体中(图2B)，并将RNA侵染性、病毒复制速率和噬斑大小与原始VEEV/mutSG/IRES和其它构建体的比较。还将相同的突变克隆至VEEV TC-83基因组中，以检测它们对该亲代病毒复制的影响。在基因组中具有一个或两个突变的IRES-编码基因组RNA，即VEEV/mutSG/IRES/1和VEEV/mutSG/IRES/2，在感染性中心试验中表现出与VEEV TC-83RNA和拯救的病毒相同的侵染性，并形成类似于VEEV TC-83噬斑大小的统一的噬斑大小(数据未示出)。它们还表现出生长速率的有力增加(图2C和1D)，但第二突变的影响勉强可检测。因此，将数据合起来就表明，nsP2中的Y₃₇₀→C突变对病毒复制上具有有力的积极影响，并且第二突变未显著地改善它。当引入VEEV TC-83中基因组时，相同的突变对病毒复制速率或最终的滴度不具有任何可检测的影响(图2C)，这表明复制增强对于VEEV/mutSG/IRES变体是特异性的。

确认的aa变化(Y₃₇₀→C和K₃₇₁→Q)仅能够代表一部分导致亚基因组启动子-缺失的含有IRES病毒有效复制的可能突变。因此，在平行实验中，将由样品分离的其它3个噬斑克隆体中的nt 2161-2959进行测序，并在体外合成的RNA和5个噬斑纯化的变体的RNA转染后24h收获，在Vero细胞中另外3次传代后，从病毒储存液分离所述噬斑纯化的变体。可以预料这类传代将导致选择最有效的复制病毒。确认的突变的列表如图3A所示。由RT-PCR来源的DNA片段直接测序；因此，呈现的突变代表噬斑来源的病毒群体中的一致序列，并且不是源自PCR的(图3B)。

所有分离物在对应于nsP2 RNA解旋酶结构域羧基端片段的测序片段中，都含有突变，所有改变的氨基酸都位于氨基酸348-424之间。此外，在原始病毒储存液中电穿孔后产生的最常见突变以及在传代库(passaged pool)中的最常见突变为Y₃₇₀→C。这表明该突变可能对复制具有一种最显著的影响；因此，将具有该特定突变的上述变体VEEV/mutSG/IRES/1用于以下部分所描述的实验中。

实施例14

nsP2 Y₃₇₀→C突变对病毒复制的影响

在nsP2相关的RNA解旋酶的羧基端片段中适应性突变的确认，是令人惊讶的，并且未提出有关VEEV/mutSG/IRES复制增加的任何显而易见的解释。该突变可能对RNA复制或病毒结构蛋白翻译或病毒粒子形成或复制复合体区域化等具有刺激效果。然而，最期待的效果为病毒RNA合成的增加。因此，将BHK-21细胞用体外合成的不同VEEV变体的基因组转染，在存在ActD的情况下，在电穿孔4.5h后开始，用[³H]尿苷将新合成的病毒RNA代谢标记4h，并通过琼脂糖凝胶电泳分析RNA(图4A)。

如所预料的，VEEV/IRES能够进行亚基因组RNA合成，这表明在亚基因组RNA 5’UTR的3’末端引入的IRES未干扰亚基因组启动子的活性。VEEV/mutSG/IRES及其在nsP2中具有适应性突变的变体未产生可检测的SG RNA。因此，引入这些基因组启动子序列中的13个突变完全地废止了亚基因组RNA的转录。令人惊讶的是，nsP2中的适应性突变对RNA基因组的复制没有显著的影响，并且VEEV/mutSG/IRES/1和VEEV/mutSG/IRES/2基因组RNA与原始设计的VEEV/mutSG/IRES基因组一样有效地复制。此外，所有变体的基因组RNA复制非常类似于VEEV TC-83的基因组RNA复制。在原始VEEV TC-83RNA的情况下也没有检测到这些突变的影响(见对应于VEEV/1和VEEV/2的泳道)。该发现有力地表明适应性未导致RNA复制的增加。

在电穿孔后12h，评估病毒结构蛋白的合成(图4B)。到那时，VEEV/IRES-和VEEV/mutSG/IRES-特异性病毒壳体及可能的其它结构蛋白约2倍地合成，效率比在用VEEV TC-83RNA转染的细胞中低。该合理小的差异未说明分别低多于4和7个数量级的VEEV/IRES和VEEV/mutSG/IRES病毒的感染性滴度(与VEEV TC-83的滴度相比)，所述滴度在转染后12h收获的样品中检测。此外，在本实验和其它实验中，病毒蛋白在含有原始VEEV/mutSG/IRES基因组的BHK-21细胞中的合成，对比在nsP2中具有适应性突变的VEEV/mutSG/IRES/1和VEEV/mutSG/IRES/2，没有检测到差异。在用含有IRES的病毒感染的细胞中，标记的蛋白模式的区别特征在于，存在两条额外的带，其通过质谱学确认为热休克蛋白Hsp90和Hsp72。它们诱导的生物学意义仍不清楚，但可能源于导致病毒结构蛋白折叠中的某些异常，所述异常导致具有由IRES表达的结构蛋白的细胞中的应激发展。

在其他试验中，评估用VEEV TC-83、VEEV/mutSG/IRES和VEEV/mutSG/IRES/1感染的细胞中病毒糖蛋白的细胞内分布，并且通过用VEEV-特异性抗体染色来分析这些蛋白在细胞表面的存在。没有检测到糖蛋白分布的显著差异。检查适应性突变引起病毒基因组中其他包装信号形成的可能性；将含有突变的片段(对应于VEEV基因组的nt 2533-2950)克隆至VEEV/mutSG/IRES基因组的3’UTR中，并在感染性中心试验中检测体外合成的RNA中的重组体。与原始VEEV/mutSG/IRES相比，未检测到噬斑大小或病毒滴度增加。

在另一变体中，将亚基因组启动子和VEEV病毒壳体编码序列克隆至VEEV/mutSG/IRES基因组的3’UTR中，以检测来自亚基因组RNA的其他病毒壳体的表达是否增加病毒复制的效率。该修饰对于病毒滴度也没有任何积极效果。最后，分析VEEV/mutSG/IRES是否产生无基因组亚病毒颗粒而不是感染性病毒。观察到情况并非如此：用VEEV/mutSG/IRES RNA转染的和用[³⁵S]甲硫氨酸代谢标记的细胞不产生能够通过蔗糖梯度超速离心检测的亚病毒颗粒(数据未示出)。因此，结合上述总和分析，对于原始VEEV/mutSG/IRES非常低效的复制，或对于VEEV nsP2中检测的突变对含有IRES的病毒复制的积极效果，未提出明显的机理解释。然而，本发明的主要目的是开发VEEV变体，其复制依赖于于EMCV IRES功能，VEEV/IRES和VEEV/mutSG/IRES/1这两者看来满足该目的。

实施例15

蚊子细胞和蚊子中IRES依赖性VEEV变体的复制

关于甲病毒复制的累积数据清楚地表明了它们的遗传不稳定性和进化的高速率，这导致任何异源基因的缺失(17，40)，特别是如果它们对病毒复制具有负面效果。因此，本发明关键的问题之一是设计的EMCV IRES的插入片段是否稳定并且使病毒不能在蚊子细胞中复制。为了对此进行检测，将C₇10蚊子细胞用VEEV/IRES和VEEV/mutSG/IRES病毒感染，所述VEEV/IRES和VEEV/mutSG/IRES病毒是在体外合成的RNA电穿孔至BHK-21细胞24h后收获的。使用VEEV/mutSG/IRES而不是在nsP2中具有适应性突变Y₃₇₀→C的上述VEEV/mutSG/IRES/1，检测RNA转染后释放的变体的整个库在蚊子细胞中复制的能力。

对于第一代，在C₇10细胞感染后48h，VEEV/IRES的滴度接近1.5×10¹⁰PFU/ml，并且在第二代后收获的储存液中检测到类似的滴度(图5A和5B)。相反，在第一代后，VEEV/mutSG/IRES的滴度为150PFU/ml(这可能反映用于感染的遗留病毒而不是在蚊子细胞中产生的新生病毒)，并且在随后的第二代后低于检测极限(图5A和5B)。在其他实验中，将在nsP2中含有适应性突变的VEEV/mutSG/IRES的噬斑纯化变体在C₇10细胞中传代。在双盲传代后，未回收到感染性病毒。

在另一实验中，用约10⁵PFU的VEEV TC-83和VEEV/mutSG/IRES/1变体胸廓内接种埃及斑蚊(Ae.Aegypti)。在埃及斑蚊中，17只用IRES突变体接种的蚊子中没有一只蚊子为进行了可检测的复制，而在CPE实验中，在17只用TC-83亲本菌株接种的蚊子中17只复制至可检测的水平，平均滴度大于10⁶PFU/蚊子。因此，含有IRES的VEEV变体VEEV/mutSG/IRES/1不能在蚊子细胞中体外和体内复制。

为了解释在蚊子细胞中传代后VEEV/IRES(能够产生亚基因组RNA变体)的高滴度，随机选择两个单独的噬斑，并对含有IRES的基因组片段测序。在两个分离物中，IRES序列不再存在于病毒基因组中，并且仅发现了原始IRES的13和15个遗留核苷酸(图5C)。因此，蚊子细胞中VEEV/IRES变体的传代导致IRES阴性变体的累积，并且VEEV/mutSG/IRES(缺乏亚基因组启动子)不发展能够在蚊子细胞中有效复制的突变体。

实施例16

VEEV/mutSG/IRES/1变体表现出减毒表型

本发明旨在开发不能在蚊子来源的细胞(并且，相应地蚊子载体)中复制，但在脊椎动物中表现出比亲代VEEV TC-83更减毒的表型的VEEV变体。VEEV/mutSG/IRES/1变体较低的复制速率带来的忧虑是，用，该病毒不能在具有完整的IFN-a/b产生和信号的脊椎动物细胞中复制。然而，情况并非如此。图6所示的实验结果表明，在不缺乏IFN-α/β分泌及信号的NIH 3T3细胞中复制的VEEV/mutSG/IRES/1的滴度大于10⁹PFU/ml。其复制引起更有效的IFN-a/b诱导(图6)，但显然，IFN释放未消除已建立的病毒复制。如在BHK-21细胞中所示(图2C)，VEEV/mutSG/IRES/1的复制比VEEV TC-83复制的效率低，这表明IRES-依赖性突变体可能是体内衰减的。实际上，用约10⁶PFU皮内注射接种6日龄小鼠后，86％的小鼠幸免于感染并且没有发展脑炎症状；相反，相同剂量的VEEV菌株TC-83杀死92％的小鼠。结合这些数据，表明基因修饰的IRES依赖性VEEV比亲代VEEV TC-83更衰减。

然而，VEEV/mutSG/IRES/1变体在新生和成年小鼠中仍然保持免疫原性。在12只幸存于用VEEV/mutSG/IRES/1皮内注射接种的6日龄小鼠中，10只幸存于5周后给予的10⁴PFU野生型VEEV菌株3908的皮下注射应激；相反，在12只以相同方式应激的假(PBS)感染小鼠中，没有幸存(图7)。VEEV/mutSG/IRES/1在成年小鼠中也是免疫原性的；用约10⁶PFU一次皮下注射免疫保护80％的小鼠不受3周后用10⁴PFU(～10⁴LD₅₀)的VEEV菌株3908的皮下注射激发(图8)。在激发前，所有这些小鼠中的中和抗体滴度(PRNT₈₀)为不可检测的＜1∶20，这表明1次种接种后的不完全保护可能是较低水平的含有IRES的病毒体内复制的结果。因此，其高水平的衰减赋予高度安全性，但可能需要重复接种。

实施例17

降低衰减但保持蚊子感染性缺乏的表达策略

在本发明单独的实施方案中，设计新颖的表达策略以降低衰减但保持蚊子感染性的缺乏。该策略涉及将IRES置于包膜糖蛋白基因的下游，且病毒壳体基因位于亚基因组区3’末端，恰好在3’UTR的上游(图9)。因此，获得亚基因组信息，同时，包膜蛋白基因以帽依赖性方式翻译，而病毒壳体蛋白以IRES依赖性方式翻译。BHK和Vero细胞中该新IRES突变体的复制也是有效的，但不能在C7/10蚊子细胞中检测到。胸廓内接种20只埃及斑纹成年雌蚊子未获得复制的证据。当用IRES版本2(IRES version 2)接种小鼠时，所有10只血清转化，平均滴度比常规TC-83所诱导的滴度低约2倍，并且所有10只小鼠受到IRES版本2的保护，而不受致死的皮下应激的危害。因此，新的IRES表达策略看来导致较低的衰减同时保持蚊子非感受态表型。

表1

本文引用了以下参考文献：

1.Aguilar，P.V.et al.，2007，J Virol 81：3866-76.

2.Alevizatos，A.C.et al.，1967，Am J Trop Med Hyg 16：762-8.

3.Barton，D.J.et al.，1999，J Virol 73：10104-12.

4.Berge，T.O.et al.，1961，Am.J.Hyg.73：209-218.

5.Blaney，J.E.，Jr.et al.，2006，Viral Immunol 19：10-32.

6.Blaney，J.E.，Jr.et al.，2005，J Virol 79：5516-28.

7.Bredenbeek，P.J.et al.，1993，J.Virol.67：6439-6446.

8.Burke，D.S.et al.，1977，J Infect Dis 136：354-9.

9.Dal Canto，M.C.，and S.G.Rabinowitz，1981，J Neurol Sci49：397-418.

10.Davis，N.L.et al.，1995，Virology 212：102-110.

11.Davis，N.L.et al.1991，Virology 183：20-31.

12.Davis，N.L.et al.，1989，Virology 171：189-204.

13.Garmashova，N.et al.，2007.J Virol 81：13552-65

14.Garmashova，N.et al.2006，.J Virol 80：5686-96.

15.Garmashova，N.et al.，2007，J Virol 81：2472-84.

16.Gorchakov，R.et al.，2004，J Virol 78：61-75.

17.Gorchakov，R.et al.，2007，Virology 366：212-25.

18.Griffin，D.E.2001.Alphaviruses(甲病毒)，p.917-962.In Knipe and Howley(ed.)，Fields’Virology(费氏病毒学)，Fourth Edition(第4版).Lippincott，Williams and Wilkins，New York.

19.Hart，M.K.et al.，2000，Vaccine 18：3067-75.

20.Jan，E.，and P.Sarnow.2002，J Mol Biol 324：889-902.

21.Johnson，K.and D.Martin.1974.Adv.Vet.Sci.Comp.Med.18：79-116.

22.Khromykh，A.A.et al.，2001，J Virol 75：4633-40.

23.Kinney，R.M.et al.1993，J.Virol.67：1269-1277.

24.Kinney，R.M.et al.，1989，Virology 170：19-30.

25.Kuhn，R.J.et al.，1996，J Virol 70：7900-9.

26.Lemm，J.A.et al.，1990，J.Virol.64：3001-3011.

27.P.et al.，1991，J.Virol.65：4107-4113.

28.Morrill，J.C.et al.，1991，Vaccine 9：35-41.

29.Murphy，B.R.，and R.M.Chanock.2001.Immunization against viral diseases(病毒疾病的免疫)，p.435-467.In D.M.Knipe and P.M.Howley(ed.)，Fields’Virology(费氏病毒学)，Fourth Edition(第4版).Lippincott，Williams and Wilkins，New York.

30.Nugent，C.I.et al.，1999，J Virol 73：427-35.

31.Paessler，S.et al.，2003，J Virol 77：9278-86.

32.Pedersen，C.E.et al.，1972，Am J Epidemiol 95：490-6.

33.Petrakova，O.et al.，2005，J Virol 79：7597-608.

34.Pittman，P.R.et al.，1996，Vaccine 14：337-43.

35.Pugachev，K.V.et al.，2000，J Virol 74：10811-5.

36.Rice，C.M.et al.，1987，J.Virol.61：3809-3819.

37.Rivas，F.et al.，1997，J Infect Dis 175：828-32.

38.Russo，A.T.et al.，2006，Structure 14：1449-58.

39.Strauss，J.H.，and E.G.Strauss，1994.，Microbiol.Rev.58：491-562.

40.Thomas，J.M.et al.，2003，J Virol 77：5598-606.

41.Trgovcich，J.et al.，1996.Virology 224：73-83.

42.Weaver，S.C.1997.Vector Biology in Viral Pathogenesis，p.329-352.In N.Nathanson(ed.)，Viral Pathogenesis.Lippincott-Raven，New York.

43.White，L.J.et al.，2001，J Virol 75：3706-18.

本说明书中提及的任何专利或出版物表示本发明所属领域技术人员的水平。此外，这些专利和出版物通过引用并入本文的程度，如同专门和单独指出每一篇单独的出版物都通过引用并入。