迟钝爱德华氏菌快速检测试纸条及快速检测方法与应用

摘要

本发明涉及一种迟钝爱德华氏菌快速检测试纸条，其是胶体金免疫层析检测试纸条，胶体金免疫层析检测试纸条的结合垫上吸附有迟钝爱德华氏菌胶体金标记抗体，胶体金免疫层析检测试纸条的分析膜上具有检测线和质控线，检测线上包被有迟钝爱德华氏菌抗体，质控线上包被有与迟钝爱德华氏菌抗体免疫原相同的第二抗体。还提供了一种迟钝爱德华氏菌快速检测方法，及上述的迟钝爱德华氏菌快速检测试纸条在检测迟钝爱德华氏菌中的应用。本发明的迟钝爱德华氏菌快速检测试纸条可以简便、快速、敏感、准确检测迟钝爱德华氏菌，能够在早期控制迟钝爱德华氏菌病的蔓延，在水产养殖迟钝爱德华氏菌病害控制中具有重要的意义，适于大规模推广应用。

说明书

技术领域

本发明涉及检测试纸条技术领域，具体涉及迟钝爱德华氏菌检测试纸条技术领域，特别涉及一种迟钝爱德华氏菌快速检测试纸条及快速检测方法与应用。

背景技术

迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)是目前在水产养殖业中具有极大危害的革兰氏阴性病原菌，能够感染包括海水鱼和淡水鱼在内的多种鱼类。它在世界不少国家和地区都引起了不同程度的鱼类灾害，近年来给我国水产养殖业造成了极大的危害。

建立迟钝爱德华氏菌快速、简单、准确的检测方法，对水产养殖迟钝爱德华氏菌病害控制具有重要的意义。目前传统的检测方法，是对病原微生物富集，根据菌落形态特征和生理生化特征或结合16S rDNA测序来判定病原种类。此外，免疫学检验技术被广泛的应用到病原微生物的检测中。包括细菌凝集实验、免疫扩散实验、免疫荧光技术、免疫印迹技术、酶联免疫吸附技术(ELISA)等。有人报道了以聚合酶链反应(PCR)或环介导等温扩增技术(LAMP)对迟钝爱德华氏菌特异性基因进行检测。部分研究工作者采用免疫学检验方法对迟钝爱德华氏菌进行检测，包括荧光抗体技术、应用抗迟钝爱德华氏菌的单克隆抗体建立的免疫组化检验方法、(间接)酶联免疫吸附法(ELISA)等。Swain等人将斑点酶联免疫吸附法(Dot-ELISA)用于迟钝爱德华氏菌的检测中。

传统的细菌学生理生化鉴定方法费时繁琐，而一般的免疫酶试验、免疫荧光法及ELISA等方法虽然可以用于迟钝爱德华氏菌的检测，但其操作程序较复杂、检测相对费时费力。PCR技术简便、快速、敏感性高，但对仪器设备及实验技能均要求较高，在水产养殖的基层单位难以大面积推广。

20世纪90年代初，胶体金免疫层析技术(GICA)逐渐发展起来。该方法是一种以胶体金为标记物的快速免疫结合分析技术，具有特异性强、灵敏度高、简便快速、肉眼判读、稳定性高等优点。相比较传统的几种迟钝爱德华氏菌的检测方式，胶体金免疫技术在检测时间以及操作简便性上占了极大的优势，本发明将这项技术运用于迟钝爱德华氏菌的检测，建立简便、快速、敏感、准确检测迟钝爱德华氏菌的方法，就能够在早期控制迟钝爱德华氏菌病的蔓延，在水产养殖迟钝爱德华氏菌病害控制中具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是克服了上述现有技术中的缺点，提供一种迟钝爱德华氏菌快速检测试纸条及快速检测方法与应用，该迟钝爱德华氏菌快速检测试纸条可以简便、快速、敏感、准确检测迟钝爱德华氏菌，能够在早期控制迟钝爱德华氏菌病的蔓延，在水产养殖迟钝爱德华氏菌病害控制中具有重要的意义，适于大规模推广应用。

为了实现上述目的，在本发明的第一方面，提供了一种迟钝爱德华氏菌快速检测试纸条，其特点是，所述迟钝爱德华氏菌快速检测试纸条是胶体金免疫层析检测试纸条，所述胶体金免疫层析检测试纸条的结合垫上吸附有迟钝爱德华氏菌胶体金标记抗体，所述胶体金免疫层析检测试纸条的分析膜上具有检测线和质控线，所述检测线上包被有迟钝爱德华氏菌抗体，所述质控线上包被有与所述迟钝爱德华氏菌抗体免疫原相同的第二抗体。

较佳地，所述迟钝爱德华氏菌抗体是迟钝爱德华氏菌EIB202为免疫原获得的抗体。

较佳地，所述第二抗体是羊抗兔抗体或羊抗鼠抗体。

其中，迟钝爱德华氏菌抗体的浓度可以为4.77mg/ml，1ml胶体金标记的迟钝爱德华氏菌抗体的量为6～25μg，最佳标记量为18μg，最佳标记pH为8.0。

较佳地，所述分析膜是硝酸纤维素膜。

较佳地，所述胶体金免疫层析检测试纸条还包括支撑板、样品垫和吸水垫，所述样品垫、所述结合垫、所述分析膜和所述吸水垫设置在所述支撑板上并依次相互部分重叠。以样品垫为起始端，吸水垫为末端，支撑板位于底层，其上自起始端至末端依次为样品垫、结合垫、分析膜和吸水垫，相邻两部分交界处部分重叠。分析膜上包被有迟钝爱德华氏菌抗体的检测线靠近起始端，包被有第二抗体的质控线靠近末端。

更佳地，所述支撑板为PVC板，所述样品垫为玻璃纤维素膜、聚酯膜或滤纸纤维，所述吸水垫为滤纸纤维。

在本发明的第二方面，提供了一种迟钝爱德华氏菌快速检测方法，其特点是，采用上述的迟钝爱德华氏菌快速检测试纸条进行检测。

具体操作为：在检测时，将采集的样品滴加至样品垫，样品在毛细作用下自起始端向末端层析流动。若检测线和质控线都显色，结果为阳性，若检测线不显色而质控线显色则为阴性，若检测线与质控线都不显色或检测线显色而质控线不显色，则检测结果无效。

在本发明的第三方面，提供了上述的迟钝爱德华氏菌快速检测试纸条在检测迟钝爱德华氏菌中的应用。

应用时，将采集的样品用样品稀释液进行适当的稀释，然后将稀释的样品滴加至检测试纸条的样品垫，样品在毛细作用下自起始端向末端流动，3～10分钟判断结果。

本发明的有益效果在于：本发明的迟钝爱德华氏菌快速检测试纸条是胶体金免疫层析检测试纸条，所述胶体金免疫层析检测试纸条的结合垫上吸附有迟钝爱德华氏菌胶体金标记抗体，所述胶体金免疫层析检测试纸条的分析膜上具有检测线和质控线，所述检测线上包被有迟钝爱德华氏菌抗体，所述质控线上包被有与所述迟钝爱德华氏菌抗体免疫原相同的第二抗体，从而可以简便、快速、敏感、准确检测迟钝爱德华氏菌，能够在早期控制迟钝爱德华氏菌病的蔓延，在水产养殖迟钝爱德华氏菌病害控制中具有重要的意义，适于大规模推广应用。

采用上述的迟钝爱德华氏菌快速检测试纸条检测迟钝爱德华氏菌，与传统的检测方法相比，具有如下优点：

a.操作简单，不需特殊设备，不需专业技术人员操作；

b.方便快捷，只需3～10分钟即可得出结果，可迅速采取应对措施；

c.经济实惠，可用于对大量样品进行筛选。

本发明的迟钝爱德华氏菌快速检测试纸条的所有这些性能特征都为其商品化提供了现实的开发和应用前景。

附图说明

图1是本发明的迟钝爱德华氏菌快速检测试纸条的一具体实施例的主视示意图。

图2是图1所示的具体实施例的侧视示意图。

图3是采用图1所示的具体实施例进行检测的阳性检测结果示意图，T、C线同时显色。

图4是采用图1所示的具体实施例进行检测的阴性检测结果示意图，仅C线显色。

图5是采用图1所示的具体实施例进行检测的无效检测结果示意图，C线不显色。

图6是采用图1所示的具体实施例进行特异性检测的结果示意图。

图7是采用图1所示的具体实施例进行灵敏度检测的结果示意图。

图8是采用图1所示的具体实施例进行模拟现场检测的结果示意图。

其中，1为支撑板，2为样品垫，3为金标垫，4为分析膜(T：包被有迟钝爱德华氏菌多克隆抗体的检测线，C：包被有羊抗兔IgG的质控线)，5为吸水垫。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。

实施例1：多克隆抗体的制备：

1)用TSB培养基将迟钝爱德华氏菌EIB202(CCTCC-M 208068)培养至对数期后期，取菌液于4℃，4000r·min^-1离心5min，用0.05mol·L^-1的PBS缓冲液(pH 7.4)洗涤三次后，PBS缓冲液重悬，加入0.4％的甲醛灭活48h；

2)将灭活菌液与等量完全弗氏佐剂充分乳化后，经背部皮内多点注射成年新西兰雌兔，抗原剂量2×10⁷CFU/只；

3)2周后将灭活菌液与等量不完全弗氏佐剂充分乳化，经背部皮内多点注射免疫，之后每隔2周加强免疫一次，3次加强免疫后采血制备血清，并用间接酶联免疫法(ELISA)测定血清效价；

4)采血前3天，耳静脉加强免疫，剂量为10⁷CFU/只，颈动脉插管放血，分离血清，-20℃保存备用；

5)用蛋白G亲和纯化血清制备多克隆抗体，纯化后IgG含量为4.77mg/ml，纯度达到98.7％～99％，效价达10⁶以上。

实施例2：胶体金的制备及迟钝爱德华氏菌快速检测试纸条组装：

1.采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液

1)取250ml三角瓶一个，加99ml超纯水及1ml 1％氯金酸，加热沸腾；

2)取1.8mL的1％柠檬酸钠加入上述溶液中，迅速混合均匀，再保持沸腾10min，自然冷却后蒸馏水恢复至l00mL体积；

3)胶体金溶液用硅化过的试剂瓶4℃保存，备用。

2.金标抗体的制备

1)将迟钝爱德华氏菌多克隆抗体用PBS缓冲液(pH 7.4)稀释，与胶体金溶液(pH 8.0)混合，电磁搅拌1h；

2)加入PBSTB封闭液(含0.05％吐温20和5％BSA的PBS缓冲液)封闭1h；

3)4℃，16000r/min离心40min，弃上清；

4)沉淀加入封闭液，4℃，16000r/min离心40min，弃上清；

5)用封闭液重悬，并调至适当浓度，4℃保存。

3.迟钝爱德华氏菌快速检测试纸条的组装

1)将金标抗体均匀涂布于经处理过的玻璃纤维素膜上，置于4℃环境中干燥，制备出金标垫。

2)用喷金划线仪将迟钝爱德华氏菌多克隆抗体和羊抗兔抗体以2μL/cm喷涂于硝酸纤维素膜上的预定检测线和质控线上，置于4℃环境中干燥，制备出分析膜。

3)首先将分析膜粘贴在支撑板上预定位置，再将结合物垫和吸水垫粘贴到支撑板上，结合物垫和吸水垫在上与分析膜部分重叠，然后将样品垫粘贴至预定位置，在上方与结合物垫部分重叠。组装妥当后用切片机将其切成4mm宽的试纸条，即为本发明的迟钝爱德华氏菌快速检测试纸条。成品请参见图1和2所示。

实施例3：迟钝爱德华氏菌快速检测试纸条特异性检测

1)将水体常见细菌以及鱼类常见病原菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鳗弧菌、哈氏弧菌、ATCC来源的迟钝爱德华氏菌ATCC15947、ATCC23692以及鲶鱼爱德华氏菌ATCCA33202分别于最适培养条件培养至对数期。

2)以PBS缓冲溶液重悬菌体并稀释至10⁵CFU/ml。

3)各取100μl以迟钝爱德华氏菌快速检测试纸条检测，确定试纸条的特异性。结果见图6。从图中看出，所有的迟钝爱德华氏菌均呈阳性，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、哈氏弧菌和鳗弧菌呈阴性，可见该试纸条对迟钝爱德华氏菌具有较好的特异性，对水体常见细菌交叉反应呈阴性。

实施例4：迟钝爱德华氏菌快速检测试纸条灵敏度检测

用迟钝爱德华氏菌快速检测试纸条检测浓度为分别为10⁵CFU/ml至10⁹CFU/ml同数量级的迟钝爱德华氏菌悬液，观察试纸条检测细菌最低浓度，同时与PCR方法对比检测，观察对比结果。以胶体金免疫层析试纸条检测迟钝爱德华氏菌，阴性对照为无菌PBS，由图7可见，该试纸条对迟钝爱德华氏菌的敏感度为10⁵CFU/ml，10⁴CFU/ml在10min内检测线未出现条带。

实施例5：迟钝爱德华氏菌快速检测试纸条现场检测

将迟钝爱德华氏菌快速检测试纸条用于山东烟台渔场罹患迟钝爱德华氏菌病的大菱鲆检测。

1)取疑似感染迟钝爱德华氏菌病大菱鲆腹水1ml，其中100μl以迟钝爱德华氏菌快速检测试纸条检测，发现在检测线显色，对照PBS并不显色(图8)。

2)取100μl涂布DHL培养基，长出均一的迟钝爱德华氏菌特有的黑心菌落，进行菌落计数，同时挑取单菌落进行生理生化及16S rDNA测序验证。

3)经生理生化及16S rDNA测序结果证明引起大菱鲆腹水的感染菌为迟钝爱德华氏菌，且在腹水中含量为4.7×10⁵cfu/ml，与试纸条检测结果相符。证明该试纸条可以应用于现场检测。

本发明根据抗原抗体特异性结合的免疫学原理，利用胶体金标记技术，免疫层析技术和银染技术建立起快速检测体系，研制出迟钝爱德华氏菌快速检测试纸条，与酶联免疫法(ELISA)、聚合酶链式反应(PCR)和斑点酶联免疫吸附法(Dot-ELISA)等已经建立的检测方法相比，操作更简单，速度更快，3～10min即可得出检测结果，无需特殊设备和专业技术人员操作，可随时现场用于渔场对迟钝爱德华氏菌感染的诊断与监测。

该迟钝爱德华氏菌快速检测试纸条包含支撑板、样品垫、吸附有迟钝爱德华氏菌胶体金标记抗体的结合垫、含有检测线(T)和质控线(C)的分析膜、以及吸水垫。在检测线上包被有迟钝爱德华氏菌抗体，质控线上包被有与迟钝爱德华氏菌抗体免疫原相同的羊抗鼠，羊抗兔等第二抗体。应用免疫层析双抗体夹心法原理检测样品中的迟钝爱德华氏菌。

本发明中，分析膜检测线上吸附的抗体和结合垫上胶体金标记抗体可以都为抗迟钝爱德华氏菌多克隆抗体，可以分别为抗迟钝爱德华氏菌多克隆抗体和单克隆抗体，也可以是针对两个不同抗原决定簇的抗迟钝爱德华氏菌单克隆抗体。

本发明所研制的迟钝爱德华氏菌快速检测试纸条灵敏度高，检测限不高于10⁵CFU/ml，特异性好，用其它常见细菌检测时，不出现阳性反应。在检测之前进行一定时间的富集培养或检测之后与分析膜上滴加银增强溶液，则可进一步提高检测的灵敏度。较高的灵敏度和很好的特异性及其良好的操作性使其可以大面积推广，用于渔场等单位对迟钝爱德华氏菌感染的监测与早期预警，防控迟钝爱德华氏菌的蔓延，减小和避免其在水产养殖中造成的巨大经济损失。

综上，本发明的迟钝爱德华氏菌快速检测试纸条可以简便、快速、敏感、准确检测迟钝爱德华氏菌，能够在早期控制迟钝爱德华氏菌病的蔓延，在水产养殖迟钝爱德华氏菌病害控制中具有重要的意义，适于大规模推广应用。

在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。