雁阵式定域随机突变方法及其在单抗分子进化技术中的应用

摘要

本发明公开了一种雁阵式定域随机突变方法及其在单抗分子进化技术中的应用，本发明的雁阵式定域随机突变方法，包括下列步骤：设计随机突变PCR扩增的目的序列的雁阵式引物，合成引物并将引物混合后进行overlapping PCR，获得指定区域发生随机突变的扩增序列。本发明的雁阵式定域随机突变方法可用于单克隆抗体分子进化，本发明还进一步结合KA扫描、雁阵式定域随机突变方法及噬菌体展示技术，提供了一种单克隆抗体分子进化的方法。本发明的突变方法用于分子进化，速度快、成功率高、应用范围广。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种随机突变方法及其在单克隆抗体分子进化技术中的应用。

背景技术

(一)治疗性单抗

自1986年第一个治疗性单抗药物诞生以来，治疗性单抗的产业化已经获得巨大的成功，这可以从以下几个方面的数据得到阐明。

产品数量在急剧增加。在美国，已有近30个治疗性单抗类被批准上市，已经进入临床研究的，目前进入临床研究的单抗共有123件，其中23件已进入III期临床或新药申报阶段；新的进入临床研究的治疗性单抗药物还在快速增加。正在开发的产品有700多个，其中240多个在不同国家进入临床。单抗类药物已经占据正在研发的基因工程药物的30％以上。市场规模在迅速扩大。从市场情况来看，根据过去二十年的情况来看，治疗性单抗药物每年的实际销售增长都明显超出了预期。据DataMonitor 2008年的数据，早在2003年，治疗性单抗已经形成了72亿美元的销售。2006年的销售达到195亿美元，2007年为263亿美元，预计2008年的销售规模将达到350亿美元以上，年增长率高达22.88％。至今已出现12个重磅炸弹级的产品。其中，Enbrel、Humira、Rituxan等6个产品年销售超过了45亿美元。DataMonitor预计，2013年，治疗性单抗市场容量超过500亿美元，并会新出现10到12个重磅炸弹级的单抗药物，使单抗药物达到一个新的高峰。由此可见，无论是从产品研发趋势或是从市场角度，治疗性单抗都保持了高强度的超预期增长，并且这种趋势仍将持续。预计，2008-2010年上市的产品中还有若干会有过5亿美元的销售。

临床指征已全面覆盖。从临床指征上看，在早期，治疗性单抗主要针对各种恶性肿瘤和自身免疫疾病。经过二十几年的发展，单抗类药物的临床指征已经覆盖了各种恶性肿瘤、自身免疫、心血管疾病、感染性疾病等各种重要疾病，其疗效突出，副作用小的特点使其占据了不可取代的地位。特别是在恶性肿瘤和疑难杂症的治疗方面，单抗药物显示了前所未有的光明前景，已经开创了基因工程药物研究的新时代。

特别值得指出的是，近几年单抗药物在治疗老年性疾病，例如帕金森病和阿兹海默症方面也获得突破性进展，引起了业内极大的关注。

至今，在国内已经上市或进入临床的品种多为进口(13种)或仿制品(15种)，国内机构创新的只有7种(上市4种，在临床3种)，均属落后的鼠源或嵌合单抗，缺乏竞争力。至今没有出现国内原创的重量级产品(上海技术预见报告-生物技术研究报告，2008年6月)。由于知识产权意识的不断加强，仿制已无出路，开发有自主知识产权的创新型单抗药物是必然趋势(上海预见报告)。

(二)、获得候选单抗的方法

当前，国际上主要有4种创新型单抗的研发平台，即①鼠源或以鼠源为基础的改造(嵌合和人源化)、②以CAT为代表的全人抗体库技术、③人源化小鼠和④单抗分子进化技术。第①种已经落后，第②种成功率太低，第③种过于复杂、投入巨大、前期工作耗时长且费用高、风险高。第④种是近几年逐渐成熟的技术，国外已有若干成功案例，如AME(CDR-grafting，US patent 7175996)、Morphosys(TRIM technology，文献23，US Patent 7432364)，Crucell()等。它以人工突变和噬菌体高通量筛选技术为核心，使现有单抗的技术指标得以提高。这种技术操作简单、成功率高、风险小且成本低，成为今后创新型tMab开发的核心技术之一。

(三)、单抗库、单抗分子进化技术

单抗分子人工进化技术主要包括原型单抗分子的获得、人工突变和以噬菌体为基础的高通量筛选。这方面的情况，文献11～20有详细描述。

超大规模全人源单抗库

单抗库技术是由Huse WD和J McCafferty等人在1990年前后创立的一项具有革命性意义的技术。此后，科学家们利用该技术进行了大量工作，构建了多种结构的单抗库或其它文库(1～10)。但是由于这种技术本身的局限性(主要是难以获得亲和力能达到治疗性单抗要求的候选分子)，在治疗性单抗开发方面至今只有Humira一个产品获得成功。为了解决这些问题，科学家做了各种努力，但至今未见突破性进展。

克服这种局限性的途径之一是构建超大规模单抗库(1，2，5，8，10)，以获得更加丰富的变异，从而提高获得高技术指标候选单抗的可能性。但由于构建超大规模单抗库实际操作上的难度很大，直到目前仍未获得显著成效，难以从任何规模的单抗库中直接获得技术指标达到治疗性单抗要求的候选分子。

分子进化技术

为了解决上述问题，科学家在噬菌体展示技术的基础上发展了分子进化技术(11～16)，在包括治疗性单抗开发方面获得了很大成功，已有多个成功案例，如US Patent 6989250，7575747，7560112，541033，7317091，7435799，7175996所述。值得指出的是，这些案例是以现有商业化的治疗性单抗作为原型分子的，且其分子进化的突变方案采用的是定点突变(21)、随机突变(11～15)、shuffling(16，20)、CDR-grafting(17)等方法，有效突变效率低、技术难度高、工作量大，且所获产物需要交叉许可才能进行商业生产和销售。

高通量筛选技术--噬菌体展示

包括本发明在内的已有单抗人工分子进化技术都采用具海量筛选能力的噬菌体表面展示技术，从而方便地从大至10E12群体中淘筛出所需的高亲和力克隆。关于噬菌体展示的筛选方法，很多文献(如文献2，5，8，10)中有详细描述。

参考文献

1.Barbas CF，Bain JD，Hoekstra DM，et al.et al.1992，Semisynthetic combinatorialantibody libraries：A chemical solution to the diversity problem；PNAS 89：4457-4461(1992).

2.Griffiths，A.D.et al.，1994，Isolation of high affinity human antibodiesdirectly from large synthetic repertoires.EMBO J.13：3245-3260.

3.Hawkins RE，Russell SJ，Winter G.1992，By-passing immunisation.Humanantibodies from synthetic repertoires of germline VH gene segments rearrangedin vitro.Selection of phage antibodies by binding affinity.Mimicking affinitymaturation.J Mol Biol.226(3)：889-96

4.Huse，W.D.et al.，1989，Generation of a Large Combinatorial Library of theImmunoglobulin Repertoire in Phage Lambda.Sci.246：1275-1281.

5.Marks JD，Hoogenboom HR，Bonnert TP，McCafferty J，Griffiths AD，Winter G.，1991，By-passing immunization.Human antibodies from V-gene libraries displayed onphage.J Mol Biol.5；222(3)：581-97.

6.McCafferty，J.et al.，1990，Phage antibodies：filamentous phage displayingantibody variable domains；Nature 348：552-554(1990).

7.Rader C，Barbas CF，1997，Phage display of combinatorial antibody libraries.Curr Opin Biotechnol.8(4)：503-8.

8.TJ Vaughan，AJ Williams，K Pritchard，JK.Osbourn，AR.Popel，JC.Earnshaw，JohnMcCafferty，RA.Hodits，Jane Wiltonl & Kevin S.Johnson，1996，Human Antibodieswith Sub-nanomolar Affinities Isolated from a Large Non-immunized Phage DisplayLibrary，Nature Biotech.，14：309-314.

9.Winter G，Griffiths AD，Hawkins RE，Hoogenboom HR.，1994，Making antibodies byphage display technology.Annu Rev Immunol.，12：433-55.

10.Hiroshi Tachibana，Xunjia Cheng，Katsuomi Watanabe，Masataka Takekoshi，FumikoMaeda，Satoshi Aotsuka，Yoshimasa Kaneda，Tsutomu Takeuchi，and Seiji Ihara，1999，Preparation of Recombinant Human Monoclonal Antibody Fab FragmentsSpecific for Entamoeba histolytica，Clinical and Diagnostic LaboratoryImmunology 6(3)：383-387。

11.Borrebaeck CA，Ohlin M.，2002，Antibody evolution beyond Nature.Nat Biotechnol.20(12)：1189-90.

12.Juárez-González VR，-Umbarila L，Quintero-Hernández V，Olamendi-PortugalT，Ortiz-León M，Ortíz E，Possani LD，Becerril B.2005，Directed evolution，phagedisplay and combination of evolved mutants：a strategy to recover theneutralization properties of the scFv version of BCF2 a neutralizing monoclonalantibody specific to scorpion toxin Cn2.J Mol Biol.346(5)：1287-97.

13.Moore，J.C.et al.，1996，Directed evolution of a para-nitrobenzyl esterase foraqueous-organic solvents；Nature Biotechnol.14：458-467.

14.-Umbarila，L.，Juárez-González，V.R.，Olamendi-Portugal，T.，Ort íz-León，M.，Domingos Possani，L.，Becerril，B.2005，A strategy for the generation ofspecific human antibodies by directed evolution and phage display：an exampleof a single-chain antibody fragment that neutralizes a major component ofscorpion venom，FEBS Journal，272(10)：2591-2601.

15.Schier，R.et  al.，1996，Isolation of Picomolar Affinity Anti-c-erbB-2Single-chain Fv by Molecular Evolution of the Complementarity DeterminingRegions in the Center of the Antibody Binding Site；J.Mol.Biol.263：551-567.

16.Stemmer，W.P.C.，1994，Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling；Nature 370：389-391(1994).

17.Daughtery，B.L.，et al.，1991，Polymerase chain reaction facilitates the cloning，CDR-grafting，and rapid expression of a murine monoclonal antibody directedagainst the CD18 component of leukocyte integrins，NAR，19：2471-2476.

18.Hayashi，N.，et al.，1994，Simultaneous Mutagenesis of Antibody CDR Regions byOverlap Extension and PCR，BioTech.，17：310-315.

19.Marks JD，Griffiths AD，Malmqvist M，Clackson TP，Bye JM，Winter G.1992，By-passing immunization：building high affinity human antibodies by chainshuffling.Biotechnology(N Y).10(7)：779-83.

20.Stemmer，W.P.C.，1994，DNA shuffling by random fragmentation and reassembly：Invitro recombination for molecular evolution；PNAS 91：10747-10751.

21.Dower，W.J.et al.1988，High efficiency transformation of E.coli by high voltageelectroporation；NAR 16(13)：6127-6145.

22.Ho，S.N.et al.，1989，Site-directed mutagenesis by overlap extension using thepolymerase chain reaction；Gene 77：51-59.

，B.，Ge，L.，Plückthun，A.，Schneider，K.C.，Wellnhofer，G.& Moroney，S.E.Trinucleotide phosphoramidites：Ideal reagents for the synthesis of mixedoligonucleotides for random mutagenesis.NAR.22，5600-5607(1994).

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中的缺陷，提供一种雁阵式定域随机突变方法及其在单抗分子进化技术中的应用。

本发明一方面提供了一种雁阵式定域随机突变方法，包括下列步骤：

1)雁阵式突变引物的设计与合成：

雁阵式随机定域突变方案是以图2所示的雁阵式引物设计为基础的。该设计方案的要点如下：

(1)雁阵式引物设计：

将指定发生随机突变区域及其侧翼序列作为随机突变PCR扩增的目的序列，并设计该目的序列的中央引物、左侧引物及右侧引物：

侧翼序列包括5’-端和3’-端两部分，长度根据与其他序列拼接的需求，各取不少于20个碱基的区域，一般为20-40个碱基，较佳的，侧翼序列中应包括有限制性酶切位点以满足拼接需求。侧翼序列可由本技术领域的技术人员凭借需求，按常规确定。

中央引物的设计：以目的序列等分处为中心点，两侧各取多个碱基作为中央引物，中央引物至多包含一个突变位点。引物中心点左右序列的长度以保持Tm值在45～58度为宜，优选范围是48～54度，一般而言，中央引物的长度约为38～60个碱基，优选范围是38～45个碱基。

左侧引物及右侧引物的设计：设计目的序列中心点以左的重叠延伸PCR引物作为左侧引物，设计目的基因中心点以右的重叠延伸PCR引物作为右侧引物，各左侧引物与右侧引物均至多包含一个突变位点。各左侧引物与右侧引物的长度约为20-40个碱基，且引物的长度以保持与相邻引物的重叠区域的Tm值在45～58度为宜，优选范围是48～54度。左侧引物、右侧引物及中央引物共同组成如图2所示的雁阵式。

无论目的序列的长短，本技术领域的技术人员均可采用常规的引物设计软件如DNAStar软件，设计出符合上述条件的引物。

一般来说，侧翼序列中应不包含突变位点，突变位点仅分布于指定发生随机突变的区域。

上述所有的引物中应有多个引物带有突变，并且每个突变引物仅含一个突变位点，在不同的突变引物间，突变位点的位置或碱基序列不同。突变位点可以指定。突变引物在突变位点的突变碱基可为根据需要设定，也可以是随机突变。

(2)引物合成：引物合成时候，中央引物可取正向或反向，左侧引物均取正向，右侧引物均取反向。

上述方法进一步图示说明如下：

假设下述原型序列有5个以下划线表示M0～M4五个需要突变的位点：

CGACTCAGCTGCGCTGCTAGTGACTGTCTCTTCTCTCACCACTGGATGACTTGGGTCCAGCAGCTGCTGGACCCAGTCAGC(SEQ ID NO：6)

按照上述方法，其引物设计及其overlapping关系如图1所示。在其中央突变点M0两侧各取20～30个碱基作为中央引物，其长度约为40～60个碱基，优选范围是40～45个碱基。中央或近中央可设计1个突变。中心点左右序列的长度以保持Tm值在45～58度为宜，优选范围是48～54度。在其余各突变点两侧各取10～20个碱基，引物的长度应以保持与相邻引物的overlapping区域的Tm值在45～58度为宜，优选范围是48～54度。

2)随机突变PCR：

将上述左侧引物、右侧引物及中央引物混合进行overlapping PCR，获得指定区域发生随机突变的扩增序列。

overlapping PCR方法为已知技术，可参考文献：Wu G，JB Wolf，AF Brahim.S.Vadasz，M Gunasinghe，SJ Freeland，2006，Simplified gene synthesis：Aone-step approach to PCR-based gene construction，J.biotech.，124(3)：496-503。

所述指定随机突变区域为目的基因中一段连续的正链DNA序列，优选含有6-40个碱基。较佳的，有21-40个碱基。指定随机突变区域可以根据操作者的需要确定，如抗体基因的CDR区、酶分子或蛋白分子的domain等。

所述引物中的一个突变位点为指定随机突变序列中一个拟突变密码子对应的三联碱基，突变位点上的三联碱基可以是与原型不同的任意碱基组合，从而导致该突变位点所编码的氨基酸的随机突变。

参与随机突变PCR的引物均至多包含一个突变位点。而不同的引物间，突变位点的位置或碱基序列不同。

由于每个突变引物均只含有一个随机突变位点，这使得同时含有多种突变引物的PCR反应体系能够容易进行扩增，相比含有多个不定数随机突变位点的PCR反应体系，扩增的成功率获得了大大的提升。此外，尽管本发明的每个突变引物只含有一个随机突变位点，由于PCR反应体系中含有多种单点随机突变引物，因此在最后的扩增产物在指定随机突变区域内不仅有单点随机突变，也可以发生多点随机突变。

优选的，引物间，所述Tm值至多相差2度。此设计可保证所有引物在同一PCR条件下进行。

本发明第二方面提供了上述雁阵式定域随机突变方法在单克隆抗体分子进化技术中的应用。

通过将雁阵式定域随机突变方法与KA扫描及噬菌体展示技术的结合，可以实现单克隆抗体分子的进化。

本发明第三方面，提供了一种单克隆抗体分子进化方法，包括下列步骤：

1)KA扫描(key amino acid screening，关键氨基酸扫描)：

a.以待进化单克隆抗体对应的特异性抗原为亲和对象，从抗体库中筛选出多个能产生与该抗原特异性结合的抗体克隆。

较佳的，筛选出的克隆数量至少为96个。

所述抗体库选自全人源抗体库、特异性人源化、鼠源、兔源、骆驼源、全人工合成等来源的Fab或scFv抗体库中之任一或为二者的合并。所述全人源抗体库优选全人源超大规模抗体库。

所述待进化单克隆抗体可以是各种来源的单克隆抗体，如已知的单克隆抗体、从抗体库中淘选出的单抗、各种哺乳动物杂交瘤获得的抗体、从哺乳动物脾脏或外周血的免疫细胞获得的抗体、或者已经进化的抗体等。较佳的，待进化单克隆单抗为：以目标抗体对应的抗原为亲和对象，从单克隆抗体库中筛选出的与该抗原亲和力最高的单抗。

b.从步骤a获得的克隆中，选出亲和力最高、次高和较高的克隆各5-10个，进行抗体DNA测序。

亲和力最高的克隆是指：该克隆产生的抗体与待进化抗体对应的抗原的亲和力(以后简称亲和力)在经步骤a获得的克隆中排位最前。如5个亲和力最高的克隆即为亲和力排位为1-5位的克隆，10个亲和力最高的克隆即为亲和力排位为1-10位的克隆。

亲和力次高的克隆是指：与所选亲和力最高的克隆中亲和力相对最低的克隆相比，在相同条件下与特异性抗原ELISA反应后的光密度读数低至少0.7单位，且在满足上述条件的克隆中排位最前。

亲和力较高的克隆是指：与所选亲和力次高的克隆中亲和力相对最低的克隆相比，在相同条件下与特异性抗原ELISA反应后的光密度读数低至少0.7单位，且在满足上述条件的克隆中排位最前。

c.根据步骤b测序结果，分析这些克隆中同一指定随机突变区域(任一CDR区)中的氨基酸分布情况，选择出该区域的不可变位点，及可变位点，可变位点又区分为突变无效位点，及与亲和力有关的可变位点即KA位点。

不可变位点：在步骤b筛选出的所有克隆或绝大多数克隆(＞80％)或亲和力最高的克隆中氨基酸相同的位点视为不可变位点。

突变无效位点：与亲和力无关的可变位点。突变无效位点的主要特征是，在步骤b获得的亲和力最高的克隆中，氨基酸的变化均无规律。例如，既包括非极性氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸)，也包含极性氨基酸(如色氨酸、酪氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸)，既有酸性氨基酸(如天冬氨酸、谷氨酸)，也有碱性氨基酸(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、芳香族氨基酸(如色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸)、亚氨基酸(脯氨酸)、含硫氨基酸(如半胱氨酸、蛋氨酸)。

与亲和力有关的可变位点：指定随机突变区域在排除了不可变位点和突变无效位点后剩下的位点。

2)雁阵式定域随机突变：

采用前述雁阵式定域随机突变方法获得KA位点或可变位点发生随机突变的目的序列扩增产物。

雁阵式定域随机突变时，突变位点即为步骤1)中所述KA位点或可变位点对应的三联碱基，所述指定发生随机突变区域为任一CDR区。

3)将步骤2获得的KA位点或可变位点发生随机突变的目的序列扩增产物与该抗体其余部分的序列拼接成完整的Fab重链或轻链的DNA分子后，插入到噬菌体载体中，并转化入宿主细胞建成突变库；

4)以待进化单抗对应的抗原为亲和对象，从突变库中筛选出多个能产生与该抗原特异性结合的抗体的克隆，并选择出亲和力相比待进化单抗获得提高的克隆。

较佳的，在步骤3前重复步骤1和2，获得不同CDR区发生随机突变的扩增产物。通过同样的操作，可以分别获得重链和轻链各自三个CDR区的突变PCR产物，再通过三个突变PCR产物的overlapping PCR即可获得在CDR区带有目的突变的Fab结构，并克隆到噬菌体载体中。载体可为pCOMb3M。

同样较佳的，在步骤4)后，以步骤4)选择出的亲和力最高的克隆分泌的单抗为原型，重复步骤1)-4)进一步进化单克隆抗体。

上述单克隆抗体分子进化方法我们又称其为PAE(Programmed Artificial Evolution，即程序化人工进化技术)技术，该技术是核心技术人员在多年技术积累的基础上，以噬菌体展示技术为基础建立的人工改造单抗分子，从而使其能满足治疗用单抗要求的核心技术。

PAE技术优势：

(1)速度快。2-3个月即可获得性能明显提高的人工进化产物。

(2)成功率高。从理论上讲，任何单抗都可以用这种方法改造，而且多数情况下可以获得比较理解的结果，其亲和力、中和能力或其他生物学特性有明显改善。因此，利用这种方法进行治疗性单抗药物的开发风险大大降低。

(3)应用范围广。本发明所述技术在单抗，特别是治疗性单抗研究上有多方面地应用。对(1)现有治疗性单抗或者(2)在研发过程中发现的带有某些特定缺陷而不能作为治疗性单抗进一步开发的候选单抗进行改造，以达到如下目的：

--提高亲和力：国外一些公司和我们的研发工作已经证明，利用分子进化技术可以快速提高单抗的亲和力。作为治疗性单抗，其亲和力有较高的要求，目前业内公认的指标是1nM以下，但目前多数治疗性单抗的亲和力均达到0.1nM或更高。在研究开发过程中，许多单抗因为亲和力不够而不能够作为治疗性药物进行开发。我们的研究发现，人工进化可以使单抗的亲和力提高1至3个数量级。因此，利用人工进化进一步改善治疗性单抗的亲和力是一条行之有效的快速方法。例如，我们通过人工进化，获得了比原型单抗亲和力高近300倍的抗人TNFa单抗。

--提高疗效：由于亲和力的提高以及其他方面生物学特性的改变，其疗效可以得到明显的提高。在同样剂量下，可以获得更好的疗效，或者达到同样的疗效可以使用更低的剂量。我们在研究中曾经发现，经人工进化的抗人RANKL单抗亲和力比国外同类产品提高了38.6倍，只需要其1/4的剂量即可获得同样的疗效。我们的另一案例中，人工进化产物对靶蛋白的亲和力未见明显提高，但其中和能力却提高很多，其疗效也明显提高。

--降低副作用：由于亲和力、特异性等方面的提高以及其他方面生物学特性的改变，其副作用可以得到明显的降低。其原因可能有(1)由于剂量的降低(2)减少了交叉反应。

--改变单抗的特性：单抗分子的某些特性改变后，更容易进行相关研究(例如，临床前研究中与小动物的兼容性)或能更好地满足其他方面的需求。

--快速人源化：利用单抗库技术可以对鼠源或其他来源的单抗进行人源化，使外源遗传物质减少到最低，从而大大降低免疫原性。到目前为止，借助人工进化技术是单抗人源化最可靠、最快速的方法。

本发明优选的单克隆抗体分子进化方法详述如下：

单克隆抗体分子进化的原型单抗分子来源于全人源超大规模抗体库HuLib。该抗体库采用来自22个省区或直辖市、包括16个民族的约3000位健康青年人的血样，历经3年研制的具有充分复杂性和变异性的全人源超大规模抗体库，其有效容量高达10E11，理论上可以从中筛选出任何抗原的单抗。详细构建过程参照文献1～10的方法进行。此前已经发表的人源抗体库均为来自1至少数几个个体的样本建立的，其变异的丰富程度不足以满足筛选高指标候选单抗的要求。这是目前唯一来自如此大样本的非突变超大规模全人源抗体库。该抗体库是本发明所述分子进化原型单抗的来源。

理论上，从上述抗体库中可以筛选出任何抗原的单抗。至今已经从中获得了抗人G-CSF单抗28株、抗人IL-11单抗21株、抗人TNFa单抗6株、抗人RANKL单抗17株等。这些单抗的亲和力分布在I0E-6～10E-8M。根据已有的结果，从这个抗体库中可以获得所有抗原的单抗。

如同其它直接来自抗体库的单抗一样，来自上述抗体库的单抗，其亲和力也通常在10E-6～10E-8M，筛选出达到10E-9M或更高亲和力的候选单抗有相当难度。为此，需要结合本发明所述的PAE技术对从该库中筛选出的单抗进行进一步改造，使其能够达到治疗性单抗的要求。

技术要点：

PAE技术的要点主要有三个方面。第一、高效的突变设计。突变引物的设计是能否获得适当突变的关键。其要点主要有：(1)根据项目目的选择适当的突变点，采用本发明所述的KA扫描法；(2)根据选定的突变点及交接序列确定引物序列。特别是第(1)项内容十分重要，不妥的设计会导致无法获得理想的突变。本发明主要是在突变点的选择和突变方案设计方面进行了改进。第二、大容量噬菌体展示库的建立。人工进化需要建立具有海量突变体的噬菌体库，它由三个步骤构成，即PCR和高效连接和转化。这三个步骤中涉及的PCR、DNA连接和质粒DNA转化虽都是成熟技术，但是由于超大库容的特殊需要，这三个步骤并不是轻而易举的。特别值得提出的是，由于引物中还有大量突变，其PCR常常遇到很大的困难。本发明的GCR法在很大程度上解决了这一问题。第三、高效的噬菌体淘筛方案。噬菌体展示技术虽已很成熟，但是如何从海量(10E10～10E12)的突变体中筛选出符合要求的克隆并不是一件十分轻松的事，使用哪种载体、采用哪种具体的筛选方案不但会影响试验进程，而且会影响试验结果。文献2，5，8，10提供了详细的淘筛方案。

经过长期的工作，我们建立的PAE技术已经相当成熟，在上述三个方面均已建立程序化的实验操作体系，能够保证试验的正常进行。

突变方案

人工进行基因突变的方法有很多种。就DNA分子水平上的突变方法而言，使用比较广泛的成熟技术有定点突变(21)、随机突变(11～15)、domain shuffling(16，20)、CDR-grafting(17)等方法。在单抗分子进化技术中要求既能获得尽量丰富的有效变异，又能避免对超大库容的需求。变异丰度不足难以获得理想的突变体，变异丰度过大则对库容要求大幅度提高，会极大地增加建库和淘筛的难度。因此，如何在获得足够有效变异的前提下尽量降低对库容的要求，是一个值得探索的问题。

本发明提供了一种能大幅度降低库容要求并提高有效突变的方法。其根本点在于，(1)从前述全人抗体库HuLib中筛选高质量的候选单抗原型分子，其亲和力应达到10E-8mol/l或更高，从而大大降低后续改进的压力。(2)降低无效突变。根据关于单抗分子结构的已有资料，特别是同一抗原表位已有单抗的分子结构信息，确定原型中可能有效的突变位点，剔除明显无效的突变位点，使库容需求大幅度降低。无效突变点的确认可以通过下述的KA扫描方法完成。(3)采用下述的雁阵式突变方案，提高突变效率和PCR的可操作性，降低对建库库容的要求，使实际操作更容易进行。

KA扫描方法

从上述抗体库中可以筛选出大量特异性的克隆，从中选出亲和力最高、次高和较高的克隆各5个，进行DNA测序。三类克隆在亲和力方面应相差一个数量级(在ELISA检测中光密度读数相差约0.7单位)。根据测序结果，可以分析三个CDR区氨基酸的分布情况。那些在所有克隆或绝大多数克隆(＞80％)，尤其是高亲和力克隆中氨基酸相同的位点视为不可变位点，其余的视为可变位点。再根据氨基酸分布情况，从可变位点中进一步甄别出与亲和力无关的可变位点(突变无效)，即可确定与亲和力有关的可变位点，即KA位点。突变无效位点的主要特征是，在亲和力最高的克隆中氨基酸的分布无规律。

KA位点是在排除了不可变位点和突变无效位点后剩下的部分，氨基酸数量已大幅度减少。在此基础上按照下述的定域随机突变方案进行突变，可以大大降低对突变群体大小的要求，使得建库和筛选操作很容易进行。

根据15个克隆的氨基酸分布难以区分三类氨基酸时，可适当增加克隆数量。

雁阵式定域随机突变

PAE技术采用了雁阵式定域随机(Goose Array CDR-in random，GCR)突变方案，与其他突变方案相比有两个优势：①可同时进行多点突变，容易创造丰富的变异；②一组引物间的随机组合可产生多突变点的随机组合，突变效率比定点突变高至少3个数量级；③突变区域是确定的(即定域)，但区域内具体位点的突变是随机的，它结合了定点突变和随机突变的双重优势。(4)常规的随机突变方案中每条引物都有很多突变点，往往PCR很难进行，所得产物往往严重偏离随机排列。本方案中每条引物仅包含一个突变点，可避免这种情况。

图2是雁阵式随机突变方案示意图。这种突变设计有以下特点：(1)可以在一个指定区域内同时进行多点随机突变或多点定点突变。该方法每条引物上只有一个突变点，但不同引物上对应于原型系列的突变点位置不同。(2)避免了一般多点突变方法中复杂PCR难度大的问题，一般情况下一次PCR即可获得良好的PCR产物。(3)有效突变效率比通常的随机突变或多点定点突变要高2个数量级。(4)PCR产物多是杂合的，其纯合过程将在转化后细菌的繁殖过程中完成。因此，对转化效率的要求相对较低。在同样转化效率情况下，获得的有效库容比常规方法高1倍，这在后续的建库过程中有重要意义。

附图说明

图1：一个典型序列的引物设计；

图2：雁阵式PCR引物设计示意图

*代表突变点，引物设计中以N表示，可以是四种碱基的任意一种。可以根据试验设计要求确定四种碱基在该点的比例，从而实现对突变群体在该点突变的控制。

图3：pCOMb3M质粒结构图。该载体是以pCOMb3H为基础改建的，其两个多克隆位点与原始载体不同，其余部分未作修改。该载体的轻链测序引物为gcgattgcagtggcactggc(SEQ IDNO：14)，重链测序引物为cctacggcagccgctggattg(SEQ ID NO：15)。

图4.抗人TNFa抗体7B4、2H7、4D3、6F5、3C9、3H6等6个Fab克隆亲和力试验结果

图5.以光密度反映的原型分子2G8、最好亲和力克隆9H6以及另外三个随机挑选的克隆的亲和力数据。从这些数据中可以看出，分子进化完成后的分子群体中亲和力分布很宽，且有一些分子的亲和力明显高于原型。

图6：抗人RANKL抗体对破骨细胞形成的影响。图中数据为TRAP染色细胞的计数结果。纵坐标为形成的破骨细胞数；横坐标为抗体浓度，范围如正文所述。

图7：抗人CD20单抗ELISA实验的光密度。进化后的3D7具有明显高于原型6B2和阳性对照Rituxan的亲和力。

图8：抗人CD20单抗内杀伤试验

图9抗人VEGF抗体亲和力测定结果

具体实施方式

以下列举具体实施例以进一步阐述本发明，应理解，实例并非用于限制本发明的保护范围。

以下列举了四个候选治疗性单抗的研制。并以抗人TNFa单抗的研制为例说明本发明的操作程序，并说明四个治疗性单抗的生物活性鉴定情况。

实施例1全人源超大规模抗体库构建

全人源超大规模抗体库的构建参考文献1～10的方法进行。具体操作如下：

1.采集血样和cDNA合成

收集3000人的外周血各1ml，混合，用淋巴细胞分离液(医科院天津血研所生产)分离单个核细胞。用GIBCO公司的试剂盒，从分离的人外周血淋巴细胞中提取细胞的总mRNA。用GIBCO公司的mRNA纯化试剂盒纯化，以上述获得的mRNA为模板，反转录出cDNA第一链。以上步骤按照厂家提供的说明书进行。

2.PCR扩增

1.引物设计

为了构建全人源Fab抗体库，在引物设计时，尽可能使PCR引物对人群具有广泛的通用性。我们参照国内外已发表的多种人单抗基因家族序列中Fv区两端较保守的区段序列，设计了人单抗VH基因(hVH)、VL基因(hVL)、5′端(back)、3′端(forward)引物。为了进一步加强引物对人单抗V区基因扩增的通用性，在各引物序列中引入了多处简并位点(多义位点)。根据所用载体pCOMb3M(加入了以下内容涉及到的限制酶切位点)。扩增Kappa和lambda链的引物和重链gamma链Fd区域的引物设计为表1所示。引物序列包含有用于克隆的限制性位点。

PCR扩增条件为：100ul体系，正反向引物各1uM，30个循环(预变性2分钟，94C1分钟，50C2分钟，72C3分钟，后延伸1分钟)。PCR产物在1.2％琼脂糖凝胶上120V电泳约20分钟，割胶并进行胶纯化。然后，用AscI和NheI或SfiI和NotI酶切处理后先(轻链)后(重链)连接到载体pCOMb3M，然后转化E.coli TG1。

表1.扩增全人源Fab片段的引物(参考文献10)。引物方向为5’-3’，其中M＝A or C，Y＝C or T，W＝A or T，R＝A or G，H＝A，C，or T，S＝5 C or G，K＝T or G.

a)反应体系的组成

b)反应条件：

预变性：94度2分钟

主循环：94度20秒，51度20秒，72度15秒。

循环数：20

后延伸：72度2分钟

PCR过程在Thermocycler热循环仪上进行。

其中，引物序列中的多义位点代号，系根据国际生物化学学会(IUB)命名委员会(NC)公布的标准方案所编。引物均委托上海生工公司进行合成。

3.PCR产物的回收及纯化

按照上述条件进行PCR后，将产物在0.8％琼脂糖凝胶上电泳进行鉴定，发现有分子量分别在650bp左右和670bp左右的两条条带，用Promega公司的胶回收试剂盒回收片段，操作按照厂家的说明书进行。

3.Fab重链和轻链PCR片段克隆到pCOMb3M载体

按照上述条件进行PCR后，获得两端带有相应酶切位点的H和L片段，进行纯化，去除引物和dNTPs。纯化后片段用相应的酶(均购自Promega公司)进行双酶切，产生可与载体pCOMb3M相连接的粘性末端，纯化后与载体连接。

噬菌粒载体pCOMb3M本身包含有SacI/HindIII和XhoI/SpeI酶切位点，可与上述PCR片段相连接。可采用常规的DNA连接酶，将PCR片段克隆进入噬菌粒载体上相应的位点。在pCOMb3M载体上其相邻位置是g3基因，将来可表达Fab-g3p融合基因。

pCOMb3M载体的构建方法：以SacI/HindIII/XbaI片段插入到pCOMb3H的SacI/XbaI位点，形成的新载体即为pCOMb3M。其图谱如图3所示。

4.转化、建库

1升LB培养液加入1ml过夜培养的TG1细胞，培养至OD值约0.3～0.4，4000rpm离心收集细胞，10倍体积的冰纯水洗涤两次，重悬于1ml含2％的Yeast Extract、1％polypeptone、1mM MgCl2的10mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中。100μl电击感受态细胞加入连接过夜的DNA样品100ng，电压为10千伏进行电击，将包含Fab片段的连接载体转染进入E.coli TG1细胞。然后将E.coli细胞培养于SOBAG(含100mg/L氨苄青霉素和2％葡萄糖的SOB培养基)琼脂板，培养温度为30℃，其中转化有pCOMb3M载体的E.coli细胞成活。反复进行电转化，使所获抗体库的容量达到1×10E11。

以2×YTAG(含100mg/L氨苄青霉素及2％葡萄糖的2×YT培养基)稀释细菌至OD600＝0.2；再以15ml该悬液培养至对数生长期，加入10E11pfu的M13KO7辅助噬菌体(购自Promega公司)，37℃振摇培养1h，离心后重悬于10ml 2×YTAK(含100mg/L氨苄青霉素及70μg/ml卡那霉素的2×YT培养基)，摇床培养过夜，于4℃以1500×g离心15min。收集上清即为全人源Fab噬菌体展示文库。将其分装后于-20℃保存，以备下一步以特异性抗原对文库进行″panning″(淘筛)。

实施例2人B细胞来源的全人源抗人TNFa单抗基因获得

除了上述途径外，某些抗原还有获得全人源单抗基因的其他来源，例如分泌抗人TNFα单抗的人白细胞等。

1.血样及其初步筛查

取活动性类风湿关节炎病人外周血5毫升，用淋巴细胞分离液分离白细胞，进行培养，根据ELISA结果鉴定阳性克隆。

为了获得分泌抗人TNFα的人B细胞，首先用重组人TNF  (上海欣百诺生物工程有限公司)常规包被96孔板，每孔用该蛋白250ng，包被过夜。然后，用5％脱脂奶粉室温封闭2小时，奶粉用pH7.2PBS配制。洗涤后，加入不同病人血清100微升，室温温育1小时。然后加入过氧化物酶标记的羊抗人IgG，室温放置1小时。洗涤至少5遍后，加入含TMD或其他显色剂，室温或37度处理20分钟。最后，加入终止液。加入的过氧化物显色底物加入10分钟后，用50l 1N的硫酸终止反应，读取450nm光密度值。选取阳性且OD值高的血清作为获选血样。

2.人外周血白细胞的分离

按照下述配方配制10倍红细胞裂解液：称取NH4Cl 80g，KHCO3 10g，Na4EDTA 3.7g，溶于800mL蒸馏水中，用1N HCl or 1N NaOH调节pH值用至7.2-7.4，定容至1000ml。然后按照下述步骤分离外周血白细胞：

a)取新鲜抗凝血，400-500g离心5分钟，离心弃上清。

b)加入6-10倍细胞体积的红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，裂解1-2分钟。例如细胞沉淀的体积为1ml，则加入6-10ml的红细胞裂解液。本步骤在室温或4度操作均可。

注意：对于鼠的血液，裂解1-2分钟已经足够，对于人的外周血，宜延长裂解时间至4-5分钟，并且裂解过程中宜适当偶尔摇动以促进红细胞裂解。

c)400-500g离心5分钟，弃红色上清。4℃离心效果更佳。

d)如果发现红细胞裂解不完全，可以重复上述步骤2和步骤3一次。通常极微量的红细胞不会影响后续的一些检测。

e)洗涤1-2次：加入适量PBS、HBSS、生理盐水或无血清培养液，重悬沉淀，400-500g离心2-3分钟，弃上清。可再重复1次，共洗涤1-2次。洗涤液的用量通常应至少为细胞沉淀体积的5倍，4℃离心后所得沉淀即为白细胞。按照100mg或10E7白细胞沉淀1ml的比例加入Trizol，立即进行总RNA抽提纯化或-80℃保存备用。

3.mRNA的分离

按照TriZol(购自Invitrogen，Cat.No.12183-555)，)分离总RNA，过程按照厂家说明书进行。所得产物-80℃保存备用。

用Dynabeads mRNA Purification Kit(购自Invitrogen，Cat.no.610.06)分离纯化mRNA。

4.PCR获得全人源抗人TNF单抗基因

以上述所得mRNA为底物，oligo-dT25(委托上海捷瑞生物工程公司合成)为引物，用MMLV反转录酶(Invitrogen公司产品，Cat.No.28025-013)以获取cDNA第一链。上述操在均按照厂家说明书进行。用下述引物和条件进行PCR，所用扩增酶为ClonTech的Pfu以确保扩增过程中减少可能的突变。用实施例1所示引物进行PCR以扩增Fab结构的重链和轻链。

PCR条件：

a)反应体系的组成：

b)反应条件：

预变性：94度2分钟

主循环：94度20秒，51度20秒，72度15秒。

循环数：20

后延伸：72度2分钟

PCR过程在Thermocycler热循环仪上进行。

c)电泳鉴定与胶回收

按照上述条件进行PCR。完毕后将产物在1％琼脂糖凝胶电泳上进行鉴定，两个PCR的产物分别为约650bp和670bp左右，与理论大小相符。用Promega公司的胶回收试剂盒回收该片段，操作按照厂家的说明书进行，各得DNA约20微克。

以实施例一中所示方法，把上述PCR产物克隆到pCOMb3M中，并转化、建库。

实施例3、从全人源抗体库淘筛抗人TNFa单抗

以实施例1和2建立的抗体库为基础进行，淘筛的操作步骤如下。淘筛及其他过程中，以Humira的Fab形式作为阳性对照。

1.复苏的抗体库菌株1毫升加入新鲜LB培养基14毫升，于50毫升三角瓶中37度培养16小时。

2.12000rpm高速离心10分钟，转移上清至一个无菌的50毫升离心管中，保存备用。其滴度应在2X10E11以上。

3.以纯化的重组人TNFa(由上海欣百诺公司提供)为抗原，常规方法包被25毫升细胞培养瓶。包被后的细胞瓶中加入不少于3X10E10噬菌体颗粒，37度温育1小时。

4.倒掉瓶中的液体，用10毫升加入了1％Tween-20的PBS洗涤培养瓶10次。

5.在培养瓶中加入1毫升对数期的TG1细胞，37度温育震荡培养16小时。

6.重复2～6步，共进行4个重复循环。

7.将上述获得的细胞稀释至100000细胞/ml后在加入0.1％氨苄青霉素的1.5％琼脂平板上进行培养以获得单克隆。

8.取上述平板上的克隆在96孔深孔板上进行培养，每孔一个克隆，共作960个克隆(10块96孔板)。

9.将上述深孔板在96孔板离心机上5000RPM离心20分钟后，将上清转移到新的无菌深孔板，封口后保藏于4度备用。

10.取96孔板10块，每孔中加入TNFa(10ug/ml)10微升常规包被后，分别加入上述保存的上清10微升，37度温育1小时后用含有1％Tween-20的PBS洗涤20次。

11.加入1微升HRP标记的羊抗M13单抗，37度温育30分钟后用1％Tween-20的PBS洗涤10次。

12.加入含有0.025％DAB显色剂的PBS 200微升和1微升1％的H2O2，37度温育显色20分钟后在读板机上读取595纳米处的光吸收。

根据光吸收读数确定显色反应强的孔，这些孔相对应的克隆即为亲和力较强的Fab单抗克隆。

本研究通过上述过程从实施例1构建的库中筛选出了415个阳性克隆，根据读数确定其中5个亲和力最强的克隆。这5个克隆分别接种在100ml LB培养基中，在37度260rpm条件下震荡培养9小时后加入终浓度为1mM的IPTG诱导培养10小时。然后用Pharmacia的“重组人scFv纯化系统”参照厂家说明书分离纯化重组Fab单抗蛋白。抽提纯化的重组Fab蛋白质用于亲和力研究。亲和力研究证明，在这415个阳性克隆中有3个具有较高的亲和力，它们是：5H4、9D2和4E8。其中，4E8具有最高的亲和力，此克隆将用在后续的研究。上述得到的噬菌体展示文库中的单抗能够结合特异性的抗原，通过淘选技术选择亲和力高的单抗。用重组人TNF(rhTNF)抗原包被酶联板，BSA封闭，温育2h，洗板后加50μl噬菌体抗体库(约10E12 CFU)温育2h，TBST(Tris 50mmol/L，NaCl 150mmol/L，Tween-200.5％，BSA 1％，pH7.5)液洗1次(第2轮洗5次，第3轮后洗10次，每次5min)，以50μl洗脱液回收噬菌体，中和缓冲液调节pH至中性，感染Ecoli TG1，进行下一轮筛选。共进行3轮筛选，移走没有抗原结合能力的噬菌粒。

进行夹心ELISA实验，测定单抗的抗原结合活性。加入50μl 200ng/ml的重组人TNF(rhTNF)抗原包被酶联板，BSA封闭，37℃温育1h，加入用PBST(KCl 2.7mmol/L，Na2HPO410mmol/L，KH2PO41.8mol/L，NaCl 137mmol/L，Tween-20 0.5％，pH7.4)对倍稀释的噬菌体单抗，37℃孵育2h。洗板，加入HRP标记的羊抗M13单抗(购自Pharmacia公司)，37℃1h。用1％Tween-20的PBS洗板，加底物液显色，在读板机上读取595纳米处的光吸收。根据计算，阳性率接近20％。从上述克隆中根据光密度挑选出5个亲和力最强的(读数＞2.2，此时阳性对照约为2.8)，5个中等的(读数约为1.5)和5个较低的(读数约为0.8)克隆抽取DNA，用于测序。测序引物可以用Fab片段恒定区部分的序列。

用同样方法从实施例2的抗体库中筛选出的5个最高亲和力的克隆的读数也在2.1～2.3附近，未见更高读数的克隆出现。这说明，这种所谓特异性抗体库来源的单抗与本发明说述的抗体库来源的单抗在亲和力方面不具备优势。

根据测试结果，选定从实施例1抗体库获得的亲和力最高的4E8号克隆用作以下的突变研究。

实施例4分子进化方案设计与实施

1.根据实施例3中20个克隆的测序结果，确定各CDR中突变有效的氨基酸位置，即KA扫描法。以重链CDR1H为例予以说明，其他CDR区的分子进化可采用同样方法和步骤。

20个克隆重链CDR1H氨基酸序列(氨基酸位26～32，符号～代表缺失)如下：

氨基酸位点P26在高亲和力组无明显优势氨基酸，且该位点氨基酸的极性、酸碱性质、特殊基团等对亲和力影响不大，视为突变无效位点，对突变无效位点，在拟突变位点数较多时，可以不对其进行突变操作，但拟突变位点数较少时可以进行突变操作。P27、P31和P32在高亲和力组中的优势氨基酸分别为F、N和H，视为不可改变位点；P28在高亲和力组中无明显优势氨基酸，为可突变位点；P29优势氨基酸为F，不可改变，但变为Q影响不大；P30高亲和力组无明显优势氨基酸，为可变位点；P31在高亲和力组中优势氨基酸为H，为不可变位点。据此，确定P27、P29、P31和P32为不可变位点，P26、P28、P30可变。据此，根据密码表、CDR1H两侧的框架区可对上述序列设计雁阵式定域随机突变引物。该CDR1H(氨基酸序列为PFPFANH)及其两侧框架区的序列为：

(SEQ ID NO：26)由于剔出了不可变的和突变无效的位点，使其可突变位点的数量由原来的7个减少为3个，就大大降低了对库容的要求。其效果可通过下述计算表示。

表：突变点数与组合数的关系

就建库的技术难度而言，10E7容量的库比较容易建立(对应6个突变点)，而建立10E12(对应9～10个突变为点)的库难度就很大了。

2.在此基础上，制定引物设计方案并设计引物

根据上述框架区和CDR1H序列，引物设计方案为：

Forward引物组：

CGGCTCAGCTGCGCTGCTAGTggctttcccttctctaaccac(原始序列)(SEQ ID NO：27)

CGGCTCAGCTGCGCTGCTAGTNNNTTTCCCTTCTCT(SEQ ID NO：34)

CAGCTGCGCTGCTAGTGGCTTTNNNTTCTCTAACCAC(SEQID NO：35)

GCTAGTGGCTTTCCCTTCNNNAACCACTGGATGAATTG(中央引物)(SEQ ID NO：36)

Backward引物组：

CTGCCGGACCCAATTCATCCAgtggttagagaagggaaagcc(原始序列)(SEQ ID NO：28)

CTGCCGGACCCAATTCATCCAGTGGTTNNNGAAGGGAAGC(SEQ ID NO：37)

CAATTCATCCAGTGGTTAGAGAANNNAAAGCCACTAG(SEQ ID NO：38)

GTTAGAGAAGGGAAANNNACTAGCAGCGCAGCTGAGCCG(SEQ ID NO：39)

NNN表示同一位置与原始序列不同的任意三联碱基组合。

3.PCR，建突变库

以上述引物组进行PCR，即可获得带有不同突变位点组合的PCR产物。引物组的PCR组合如下：

以上述中央引物、左侧引物与右侧引物为引物进行PCR。

a)反应体系的组成：

b)反应条件：

预变性：94度2分钟

主循环：94度20秒，51度20秒，72度15秒。

循环数：20

后延伸：72度2分钟

PCR过程在Thermocycler热循环仪上进行。

一个抗体分子的重链和轻链各有三个CDR区，均按照上述方法分别进行突变，分别获得突变片段后，再用常规overlapping PCR把各片段拼接成完整的Fab重链或轻链的DNA分子，插入到pCOMb3M载体后，再按照实施例3的方法进行淘筛。同样地，用Humira的Fab形式作为阳性对照。

4.鉴定及结果

参照实施例3的方法鉴定高亲和力克隆。两块96孔板中，共得到89个光密度＞3.0(阳性对照的光密度读数为2.89，原型的读数为2.27)的克隆，其中7H3读数达3.25(相当于亲和力提高约13.58倍)。

该原型分子的CDR1H氨基酸序列为PFPFANH，进化后获得的7H3的CDR1H区序列为GFSFTNH。鉴定完毕，可采用实施例4的方法以7H3为原型，仍然采用根据实施例3中20个克隆的测序结果，以实施例4的方法对CDR1L进行分析，选择出KA位点，根据密码表、CDR1L两侧的框架区设计雁阵式定域随机突变引物，经两轮PCR后再相应酶切位点替换7H3克隆的原始的轻链，再按照实施例3的方法进行淘筛，淘选出的亲和力最高的单抗的亲和力比4E8原型提高了约40％。还可以同样的方法进一步对CDR2H、CDR3H、CDR2L、CDR3L等区逐一进行进化。

实施例5、抗人TNFa单抗进化后的中和能力鉴定

利用实施例1和2提供的全人源抗体库，参照实施例3提供的方法筛选出了抗人TNFa的Fab。又经实施例4提供的方法，对原型抗人TNFa单抗4E8进行了多次分子进化包括CDR1、CDR2、CDR3的进化，获得了光密度读数接近3.5(阳性对照为2.75，原型为2.16)的克隆7B4和2H7，其氨基酸序列如下表所示。

通过以下方法检测从上述克隆纯化的Fab单抗对人TNFa的中和能力。

1.取对数生长期的L929细胞，用消化液常规消化后充分分散细胞，并用细胞培养液稀释到2×10⁵细胞/毫升。

2.取96孔板4块，每孔中加入100微升细胞悬浮液，5％CO₂培养箱中37度培养24小时。

3.用1～2μg/ml放线菌素D和0.001微克/毫升TNFa标准品(上海欣百诺生物科技有限公司产品)的细胞培养液将待测样品稀释至10微克/毫升、1.0微克/毫升、0.1微克/毫升、0.01微克/毫升、0.001微克/毫升、0.0001微克/毫升和0.00001微克/毫升。

4.每孔加入100微升各种稀释度的样品，每个稀释度3个孔。阴性对照只加入含1～2μg/ml放线菌素D的细胞培养液。阳性对照中加入高剂量的TNFa(2μg/ml)细胞培养液。

5.5％CO₂培养箱中37度培养24小时或更长。培养时间根据阳性对照孔中的细胞全部死亡确定。

6.用MTT染色后在读板机上读取光密度数据。对数据进行作图(结果见图4)。

由试验数据可以看出，7B4、2H7的中和能力明显高于Humira Fab，其余克隆则与Humira Fab大体相当或略低。

实施例6、抗人RANKL单抗进化后的中和活性和亲和力鉴定

参照实施例3的方法，以重组人RANKL为抗原(Orbigen公司产品)从HuLib中淘筛特异性抗体，获得高亲和力克隆2G8，其ELISA光密度读数为2.16。参照实施例4的方法对重链及轻链的CDR区进行分子进化，获得了关键技术指标明显高于阳性对照的克隆＞10个，其中9H6的ELISA光密度读数为3.48，与其原型2G8(光密度为2.16)相比有明显提高。

图5是以光密度反映的原型分子2G8、最好亲和力克隆9H6以及另外三个随机挑选的克隆的亲和力数据。从这些数据中可以看出，分子进化完成后的分子群体中亲和力分布很宽，且有一些分子的亲和力明显高于原型。

根据测序获得的DNA序列推测的原型分子2G8轻链可变区的氨基酸序列(108氨基酸)EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASRSVRSRYLAWYQQKPGQAPRLLIYGALSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQRLNWPLTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO：32)

根据测序获得的DNA序列推测的原型分子2G8重链可变区的氨基酸序列(122氨基酸)EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSAYLMKWVRQAPGKGLEWVSGITGIGGLTYYSDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSARLEDTSVYYCAKDPGTTVIMSWFDPWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：33)

1.抗人RANKL单抗的中和活性--对破骨细胞形成过程的抑制作用

RAW264.7(ATCC No.TIB-71，Manassas，Va.)是一个由Abelson小鼠白血病病毒诱导的肿瘤衍生的巨噬细胞株，在RANKL存在时，该细胞系可分化成类破骨细胞。Simonet等(1997，Cell 89 p.309)和Lacey等(1998，Cell 93p.165)详细描述了在RANKL存在时在RAW细胞培养物中产生破骨细胞的检测方法。

RAW细胞可以由配体刺激从而分化成类破骨细胞，其分化的情况可以通过检测TRAP(抗酒石酸盐酸性磷酸酶(Tartrate resistant acid phosphatase，TRAP)的活性来了解。因此，抗人RANKL单抗对骨质疏松的影响或骨损伤也就可以检测了。

在一定量(50ng/ml)RANKL存在的情况下，加入10ng/ml～150ng/ml本发明制备的的抗人RANKL单抗，对RAW细胞培养4天，用ara-硝基磷酸盐处理5分钟后，把培养基从细胞吸出，每孔中加入120ul 0.1M的柠檬酸缓冲液(含1mL Triton X-100)后，室温处理5分钟。采用QUIDEL Metra TRAP5b ELISA试剂盒(QUIDEL公司产品编号：8036)，加入100微升PNPP溶液(157.8mg酸性磷酸酶试剂(Sigma 104-100)，7.2ml酒石酸盐溶液(Sigmacat.no.387-3)和22.8ml柠檬酸缓冲液)，室温处理3到5分钟。最后，加入50ul 0.5M NaOH溶液终止反应。

TRAP可把para-硝基磷酸盐转化成para-硝基酚，在405nm波长下可对其进行光密度定量。TRAP的活性是破骨细胞发育的替代指标，与405nm的光密度相关。一组光密度与抗RANKL单抗浓度的数据即可反映单抗抑制破骨细胞形成的情况。

中和作用测试：采用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色法。多核TRAP阳性染色是破骨细胞的特征性标志，这是设计本试验的基础。以RAW 264.7细胞为试验材料，1×10⁴细胞/孔接种于24孔板，培养24小时后分别用50ng/ml RANKL和不同浓度(10ng～500ng/ml)，细胞每3d换液1次。第6天抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色(美国Sigma-Aldrich公司，387-A)，细胞用柠檬酸盐/丙酮溶液固定1分钟，在以萘酚AS BI磷酸盐作为底物的孵育液中37度孵育1小时，蒸馏水洗3次，苏木素复染2分钟，干燥后二甲苯透明，DPX(聚苯乙烯+酞酸丁二酯+二甲苯)封固，光镜观察。TRAP阳性细胞为破骨细胞，镜检计数TRAP阳性多核破骨细胞(≥3个核)的数量。

试验结果见图4。单抗浓度分别为：0，0.001，0.01，0.05，0.1，1.0，10.0ng/ml。从图中数据可以看出，本发明获得的抗人RANKL单抗具有良好的中和RANKL刺激破骨细胞形成的能力。

实施例7、抗人CD20单抗进化后的生物活性和亲和力鉴定

参照实施例3的方法，以重组人CD20为抗原从HuLib中淘筛特异性抗体7F2，参照实施例4的方法进行重链及轻链的CDR区分子进化，获得了关键技术指标明显高于阳性对照的克隆8G3。

图7是以ELISA光密度反映的原型分子7F2、进化后的高亲和力分子8G3、阳性对照Rituxan-Fab和阴性对照Humira-Fab亲和力数据。由此可以看出，进化后的8G3比原型分子7F2的亲和力提高明显提高，比阳性对照也明显提高。这在以下的生物活性实验中将得到进一步验证。

生物活性试验

测活细胞株为CD20B淋巴细胞瘤细胞株DHL-4。阴性对照为抗人Humira Fab人源化单抗，阳性对照为Rituxan Fab。

体外加入抗CD20单抗可诱导细胞凋亡，加入细胞和单抗后第5～7天进行细胞计数和MTT检测。结果见下表。

表2.抗CD20单抗的生物活性比较(存活细胞％)

从上述结果可以看出，加入抗人CD20单抗RitusanFab和本发明的8G3后，存活细胞数量明显减少，而阴性对照则未见明显变化，这说明上述单抗具有明显杀伤CD20⁺阳性B淋巴细胞的作用。8G3的效果明显优于阳性对照。

抗人CD20单抗内杀伤试验

DHL4淋巴瘤细胞按照5X10⁶/只小鼠的量皮下注射免疫缺陷性小鼠，待肿瘤长至0.3X0.3以上时，注射8G3，阴性对照为抗人Humira Fab人源化单抗，阳性对照为Rituxan Fab。在第10天按照每只小鼠5毫克进行注射。注射后第10天、第20天和第30天测量肿瘤的大小，结果如图8所示。

上述结果说明，与阴性对照相比，注射单抗后体内肿瘤的生长受到明显的抑制。

实施例8、抗人VEGF单抗进化后的亲和力鉴定

参照实施例3的方法，以重组人VEGF为抗原从HuLib中淘筛特异性抗体，获得了亲和力较高的克隆3D7。参照实施例4的方法进行重链及轻链的CDR区分子进化，获得了关键技术指标明显高于阳性对照的克隆6B2。

图9是以光密度反映的原型分子3D7、进化后的高亲和力分子6B2、阳性对照Avastin-Fab和阴性对照Humira-Fab亲和力数据。由此可以看出，进化后的6B2比原型分子和阳性对照高均明显高。这在以下的生物活性实验中将得到进一步验证。

生理功能研究

试验设计：由于至今只发现血管内皮细胞对VEGF有特异的增殖反应，本试验根据Gospodarowicz D等的方法(PNAS，1989，86：7311)检测抗VEGF单抗的生物学活性。具体方法如下：

a.取96孔细胞培养板一块，每孔中加入0.5ml含有1X10⁴牛肾上腺血管内皮细胞(可从中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库获得)培养液和200IU的VEGF(购自深圳晶美公司)，在第4天单独加入同样量的VEGF以持续刺激牛肾上腺内皮细胞增殖。

b.待测样品和阳性对照储存液浓度均为500ug/ml。阳性对照为Genentech公司的RhuFabV2。用含有0.2％明胶的PBS稀释液系列稀释待测样品和阳性对照后，每孔中加入0.5ml待测样品和阳性对照。阴性对照孔加入0.5ml细胞培养液。每个处理设3次重复。在37度5％CO₂培养箱中培养4～5天。

c.MTT检测：取经过上述处理的细胞0.2毫升，加入1/10体积浓度为5mg/ml的MTT溶液，37度培养30分钟后在酶标仪上读取570nm处的光吸收。参考波长为630nm。

结果分析：

表3.抗人VEGF抗体对牛肾上腺血管内皮细胞的增殖作用

从上表可以看出，本发明的人源抗人VEGF单抗的生物活性，比阳性对照Avastin明显高。

小鼠肝癌灌注治疗效果研究

大鼠移植性肝癌模型建立的方法

将皮下荷瘤大鼠断颈处死后，局部消毒，取皮下瘤块，拨去纤维组织，挑选无出血、无坏死肿瘤组织，用利刀片切成0.2mm3大小的小块备用。另取Wistar大鼠，以戊巴比妥钠按40mg/kg腹腔注射麻醉，取仰卧位，四肢固定于手术板上后，手术区用75％酒精消毒后，在腹正中切开皮肤10mm左右，用显微组织镊子将肝包膜戳一小口，将肿瘤块沿隧道嵌入。移植完毕后逐层缝合腹壁，饲养待用，整个过程在无菌条件下进行。

治疗方法

动脉插管参照Lindell等的方法肝脏接种瘤块后第7d，大鼠腹腔麻醉后固定，再次剖腹(开口约2～3cm)，暴露肝脏，测量肿瘤表面最大径(a)和最小径(b)，分离胃十二指肠动脉、肝动脉及肝固有动脉，结扎胃十二指肠动脉的远端.以银夹暂时阻断肝总动脉，于手术显微镜下在胃十二指肠动脉上切一小口，由此将外径约0.3mm的特制导管上行插入肝固有动脉.待回血后，按以下分组及剂量(表1)分别灌注相应制剂.灌注后拔管、结扎胃十二指肠动脉近端，放开肝总动脉上的银夹，逐层缝合切口后擦净伤口、外涂金霉素软膏，分笼恒温、自动供水供食饲养。

肿瘤生长率测定

每组部分大鼠于治疗后第7d处死，再次测量肿瘤的最大径(a)和最小径(b)，按公式计算肿瘤体积：V＝ab2/2，再根据治疗前后的肿瘤体积计算肿瘤生长率(GR＝治疗后的肿瘤体积/治疗前的肿瘤体积)。

5组大鼠灌注前后的肿瘤体积及肿瘤生长率方差分析结果见表4。治疗前各组肿瘤体积之间均无显著性差异，肝动脉灌注阴性对照，所有大鼠的肿瘤均明显增大，平均肿瘤体积显著大于灌注前。灌注抗Vegf单抗后，肿瘤体积较治疗前亦明显增大，但肿瘤生长率低于对照组。这说明，灌注抗VEGF单抗可以明显抑制肝肿瘤的生长。

表4.大鼠动脉灌注抗VEGF单抗后肝肿瘤体积及肿瘤增长率(n＝10)

序列表

<110>无锡天演生物技术有限公司

<120>雁阵式定域随机突变方法及其在单抗分子进化技术中的应用

<130>091481

<160>39

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>31

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>引物

<400>1

ctgagctcgm catycagwtg acccagtctc c                31

<210>2

<211>31

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>引物

<400>2

ctgagctcga trttgtgatg acycagwctc c                31

<210>3

<211>31

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>引物

<400>3

ctgagctcga aattgtgwtg acgcagtctc c            31

<210>4

<211>31

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>引物

<400>4

ctgagctcga catcgwghtg acccagtctc c            31

<210>5

<211>32

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>引物

<400>5

gcaagcttac actctcccct gttgaagctc tt           32

<210>6

<211>81

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>6

cgactcagct gcgctgctag tgactgtctc ttctctcacc actggatgac ttgggtccag    60

cagctgctgg acccagtcag c                                              81

<210>7

<211>29

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>引物

<400>7

ctgagctcca gtctgysctg actcagccw            29

<210>8

<211>29

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>引物

<400>8

ctgagctcca gtctgtgytg acgcagccg            29

<210>9

<211>29

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>引物

<400>9

ctgagctcma ckttataytg actcaaccg            29

<210>10

<211>29

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>引物

<400>10

ctgagctcca gactgtggta acycaggag            29

<210>11

<211>29

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>引物

<400>11

ctgagctctc ctatgwgctg actcagcca            29

<210>12

<211>29

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>引物

<400>12

ctgagctctc ttctgagctg actcaggac            29

<210>13

<211>31

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>引物

<400>13

gtaagcttga amatkctgta gsggccactg t                31

<210>14

<211>20

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>引物

<400>14

gcgattgcag tggcactggc                             20

<210>15

<211>21

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>引物

<400>15

cctacggcag ccgctggatt g                           21

<210>16

<211>31

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>引物

<400>16

gactcgagat ggcccaggtg cagctggtgc a                31

<210>17

<211>31

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>引物

<400>17

gactcgagat ggcccagrty cagctggtgc a            31

<210>18

<211>31

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>引物

<400>18

gactcgagat ggcccagstr cagctgcags a            31

<210>19

<211>31

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>引物

<400>19

gactcgagat ggccsargtg cagktggtgg a            31

<210>20

<211>31

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>引物

<400>20

gactcgagat ggccccagtg tgaggtgcag c            31

<210>21

<211>31

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>引物

<400>21

gactcgagat ggcccaggtg cagctacags a            31

<210>22

<211>32

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>引物

<400>22

ctactagttg tgtgagtttt gtcacaagat tt           32

<210>23

<211>32

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>引物

<400>23

ctactagttt tgcgctcaac tgtcttgtcc ac        32

<210>24

<211>32

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>引物

<400>24

ctactagttg tgtgagttgt gtcaccaagt gg        32

<210>25

<211>32

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>引物

<400>25

ctactagttg ggggaccata tttggactca ac        32

<210>26

<211>63

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>26

cggctcagct gcgctgctag tggctttccc ttctctaacc actggatgaa ttgggtccgg    60

cag                                                                  63

<210>27

<211>42

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>27

cggctcagct gcgctgctag tggctttccc ttctctaacc ac    42

<210>28

<211>42

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>28

ctgccggacc caattcatcc agtggttaga gaagggaaag cc    42

<210>29

<211>216

<212>PRT

<213>artificial  sequence

<220>

<223>7B4和2H7的Fab L链

<400>29

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Tyr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1               5                   10                  15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ser Val Gly Asp

            20                  25                  30

Arg Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65                  70                  75                  80

Glu Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Ile Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala

            100                 105                 110

Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser

        115                 120                 125

Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

    130                 135                 140

Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser

145                 150                 155                 160

Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

                165                 170                 175

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

            180                 185                 190

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Thr Pro Val Thr

        195                 200                 205

Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

    210                 215

<210>30

<211>229

<212>PRT

<213>artificial sequence

<220>

<223>7B4 H链

<400>30

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Phe Ser Asn His

            20                  25                  30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Gly Glu Ile Arg Ser Lys Ser Met Asn Ser Ala Thr His Tyr Ala Glu

    50                  55                  60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser

65                  70                  75                  80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

                85                  90                  95

Tyr Cys Ala Arg Asn Asp Tyr Gly Ala Ala Tyr Asp His Trp Gly Gln

            100                 105                 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

        115                 120                 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

    130                 135                 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145                 150                 155                 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

                165                 170                 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

            180                 185                 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

        195                 200                 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

    210                 215                 220

Lys Thr His Thr Cys

225

<210>31

<211>229

<212>PRT

<213>artificial sequence

<220>

<223>2H7 H链

<400>31

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Phe Ser Asn His

            20                  25                  30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Gly Glu Ile Arg Ser Lys Ser Met Asn Ser Ala Thr His Tyr Ala Glu

    50                  55                  60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser

65                  70                  75                  80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

                85                  90                  95

Tyr Cys Ala Arg Asn Val Asp Gly Ala Pro Tyr Asp His Trp Gly Gln

            100                 105                 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

        115                 120                 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

    130                 135                 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145                 150                 155                 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

                165                 170                 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

            180                 185                 190

Ser Ser Ser Val Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

        195                 200                 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

    210                 215                 220

Lys Thr His Thr Cys

225

<210>32

<211>108

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>32

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1               5                   10                  15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Arg Ser Val Arg Ser Arg

            20                  25                  30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

        35                  40                  45

Ile Tyr Gly Ala Leu Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

    50                  55                  60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65                  70                  75                  80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Leu Asn Trp Pro

                85                  90                  95

Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

            100                 105

<210>33

<211>122

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>33

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ala Tyr

            20                  25                  30

Leu Met Lys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Ser Gly Ile Thr Gly Ile Gly Gly Leu Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val

    50                  55                  60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Met Asn Ser Ala Arg Leu Glu Asp Thr Ser Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Lys Asp Pro Gly Thr Thr Val Ile Met Ser Trp Phe Asp Pro Trp

            100                 105                 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>34

<211>36

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(22)..(24)

<223>与原始序列不同的任意三联碱基组合

<400>34

cggctcagct gcgctgctag tnnntttccc ttctct                        36

<210>35

<211>37

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(23)..(25)

<223>与原始序列不同的任意三联碱基组合

<400>35

cagctgcgct gctagtggct ttnnnttctc taaccac                    37

<210>36

<211>38

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(19)..(21)

<223>与原始序列不同的任意三联碱基组合

<400>36

gctagtggct ttcccttcnn naaccactgg atgaattg                    38

<210>37

<211>40

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(28)..(30)

<223>与原始序列不同的任意三联碱基组合

<400>37

ctgccggacc caattcatcc agtggttnnn gaagggaagc            40

<210>38

<211>37

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(24)..(26)

<223>与原始序列不同的任意三联碱基组合

<400>38

caattcatcc agtggttaga gaannnaaag ccactag               37

<210>39

<211>39

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(16)..(18)

<223>与原始序列不同的任意三联碱基组合

<400>39

gttagagaag ggaaannnac tagcagcgca gctgagccg           39