一组人成骨肉瘤细胞系及小鼠体内移植模型

摘要

本发明公开了三个人成骨肉瘤细胞系well2、well5和LZJ，保藏编号分别为CCTCC C200961；CCTCC C200962；CCTCC C200963，本发明还公开了相应的NOD/SCID小鼠体内移植模型的建立，为骨肉瘤临床和基础研究工作提供良好和稳定的实验对象及模型平台。建立的成骨肉瘤细胞系在体外稳定传代两年以上，性状稳定，形态、免疫表型和染色体遗传学等特征与常用的成骨肉瘤细胞系相似。NOD/SCID小鼠成瘤稳定，瘤体病理形态与病人原代肿瘤组织相似，同时该动物模型对成骨肉瘤常用化疗药物敏感，很好的模拟了临床病人骨肉瘤的临床转轨。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物动物细胞系领域，更具体地讲，涉及一组人成骨肉瘤细胞系和小鼠体内移植模型的建立。

背景技术

成骨肉瘤是常见的骨恶性肿瘤，好发于青少年，恶性程度高。目前常用治疗方案为手术治疗+新辅助化疗，根治效果并不十分理想，肺转移发生率高。基本原因在于对于骨肉瘤发病机制的了解尚不清楚，基础研究工作的开展也不深入。成骨肿瘤细胞系和动物成瘤移植模型是在肿瘤发病机理和药物及其它疗法筛选研究工作中常用到的基本工具。虽然国际上权威的细胞库ATCC已存有数个成骨肉瘤细胞系(MG-63、Saos-2和U-2os等)，但它们在动物体内致瘤率都极低；极大地影响了基础研究工作的质量。另外，少数个别实验室可能已有自建的、有致瘤能力的成骨肉瘤细胞系，但均未见广泛使用。因此，建立新型成骨肉瘤细胞系及体内稳定移植模型是促进临床和基础研究工作的一个基本前提条件。

目前，国内国外常用的成骨肉瘤细胞系有MG-63、Saos-2和U-2os等。这些细胞系长期在体外传代，有些已经丧失了原有分离之肿瘤组织的一些特征，尤其是它们在动物体内致瘤能力极低，不能建立体内研究模型。少数实验室自建的、可有致瘤能力的成骨肉瘤细胞系，长期传代性状不稳定，没有得到广泛使用，从而造成了成骨肉瘤动物体内成瘤模型建立的限制，成骨肉瘤致病机理的基础研究和药物和其它疗法筛选工作不能深入开展。

发明内容

本发明的目的是提供三个成骨肉瘤细胞系。

本发明的第二个目的是提供所述相应的人成骨肉瘤细胞系NOD/SCID小鼠体内移植模型。

本发明公开的人成骨肉瘤细胞系(well5、well2和LZJ)来自中国人成骨肉瘤组织标本在NOD/SCID小鼠体内接种及传代组织衍生物，尔后又在体外稳定传代两年以上，生物性状和表型与原代培养的成骨肉瘤细胞相似，在NOD/SCID小鼠上致瘤能力强。其在NOD/SCID小鼠体内移植模型致瘤稳定，产生的移植瘤病理形态与成骨肉瘤病人原代标本相似。体内模型很好的模拟了成骨肉瘤临床发生和发展的过程。

本发明改进和优化组织标本的处理过程，尽量保证组织细胞活力。首先建立NOD/SCID体内移植模型，经多次体内传代后再开始体外建系。进行严格筛选工作，在建立约19个原代培养物中筛选出3个稳定体内外传代的细胞系。建立的成骨肉瘤细胞系(well5、well2和LZJ)在体外稳定传代两年以上，性状稳定，形态、免疫表型和染色体遗传学等特征与常用的成骨肉瘤细胞系相似。另外，建立的成骨肉瘤细胞系具有致瘤能力强，生长活力好等特点。NOD/SCID小鼠成瘤稳定，瘤体病理形态与病人原代肿瘤组织相似，同时该动物模型对成骨肉瘤常用化疗药物敏感，很好的模拟了临床病人骨肉瘤的临床转轨。

附图说明

下面结合说明书附图，对本发明进一步详细说明。

图1A：成骨肉瘤病人手术前瘤体大致外观图；图1B：成骨肉瘤病人诊断CT图像。

图2A：将病人标本消化成单细胞悬液后注射入NOD/SCID小鼠皮下，成功建立跨物种移植模型，所示瘤体体积较大，长约30mm；图2B：颈椎脱臼法处死小鼠后，解剖取出瘤块，将其剪成小碎块后，消化成单细胞悬液，接种至培养基，进行细胞培养。

图3：长期体外稳定培养的细胞系：well2、well5、LZJ的光镜相差图像(4X、20X)，细胞形态大而粗壮、梭形，与常用成骨肉瘤细胞系相似。

图4A：建立的well5成骨肉瘤细胞系染色体数量异常，畸变明显；图4B：建立的LZJ成骨肉瘤细胞系染色体数量异常，畸变明显。

图5：在无血清培养的条件下，well2、well5、LZJ分别具有能在体外sphere-forming的能力。

图6：所示病人原代标本LZJ P0和NOD/SCID小鼠跨物种移植模型LZJ P1的病理形态相似，此模型很好得反映了成骨肉瘤在病人体内的发生、发展。

具体实施方式

本发明所公开的人成骨肉瘤细胞系，已保藏在武汉：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：武汉大学，保藏日期为2009年10月29日，其命名和保藏编号分别为：(1)命名为：人成骨肉瘤细胞系well2；保藏编号：CCTCC-C200961；(2)命名为人成骨肉瘤细胞系well5；保藏编号：CCTCC-C200962；(3)命名人成骨肉瘤细胞系LZJ；保藏编号：CCTCC-C200963。

I、主要收集瑞金医院07-08年间初发成骨肉瘤病人的原代标本，去除坏死组织和血块，剪碎肉瘤组织，用胶原酶消化成单细胞悬液，一部分用培养液重悬后加入至细胞培养皿进行体外培养，另一部分直接皮下植入NOD/SCID小鼠，待肿瘤形成。

II、观察NOD/SCID小鼠成瘤情况，对移植后产生的瘤体进行病理和免疫表型等分析。将肿瘤移植物制备单细胞悬液，在体外不断长期稳定传代，去除死细胞和杂细胞。

III、建立的人成骨肉瘤细胞系(well2：CCTCC-C200961；well5：CCTCC-C200962；LZJ：CCTCC-C200963)在体外稳定传代两年以上，细胞形态大而粗壮、梭形，与常用成骨肉瘤细胞系相似，并且能在体外无血清培养体系下形成成骨肉瘤细胞球。