棉花真叶直接分化组织培养方法及其专用培养基

摘要

本发明公开了一种棉花真叶直接分化组织培养方法及其专用培养基。本发明提供的专用培养基是棉花叶片直接分化出胚性愈伤组织时所用的培养基，它是在MSB1基本培养液中，添加如下物质得到的培养基：KT、6-BA、2，4-D，IAA，葡萄糖和凝胶剂；上述KT的终浓度是0.005-0.15mg/L、6-BA终浓度是0.005-0.15mg/L、2，4-D的终浓度是0.0001-0.001mg/L、IAA的终浓度是0.001-0.02mg/L、葡萄糖的终浓度是25-35g/L、Gel rite的终浓度是1.8-2.5g/L。本发明的方法是利用田间棉株的叶片作为外植体建立组织培养体系，最终建立叶片直接诱导胚性愈伤组织的、稳定高效的组织培养体系。

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物组织培养领域，特别涉及一种大田棉花植株真叶组织培养方法其专用培养基。

背景技术

棉花组织培养中，体细胞胚发生和植株再生可分为4步：外植体脱分化诱导出愈伤组织、愈伤组织再分化为胚性愈伤组织、胚性愈伤组织培养出体细胞胚、体细胞胚萌发获得植株再生。从外植体脱分化生长出愈伤组织比较容易，没见受基因型限制的报道。从愈伤组织诱导分化出胚性愈伤组织，是棉花组织培养的瓶颈，受基因型限制的报道集中在胚性愈伤组织的诱导阶段。

基因型限制，首先表现在棉属中不同棉种的体细胞胚发生和植株再生能力不同。研究人员通过对多个棉种进行比较发现，只有陆地棉、雷蒙德氏棉、夏威夷棉能形成体细胞胚。董合忠和陈志贤比较了4个棉花栽培种的体细胞胚发生能力，发现陆地棉较易诱导体细胞胚，亚洲棉次之，海岛棉和非洲棉较差(董合忠1991；陈志贤，李淑君.1987)。棉属共有50个种，包括45个野生种，4个栽培种，迄今为止仅克劳茨基棉、戴维逊氏棉、陆地棉、海岛棉、亚洲棉、草棉、雷蒙德氏棉和夏威夷棉8个种获得了体细胞胚，其中陆地棉、海岛棉、亚洲棉、草棉和戴维逊氏棉获得了再生植株。

此外，在体细胞胚发生和植株再生能力上，各个棉花品种间也存在差异。Trolinder对陆地棉28个品种进行了研究，结果只有珂字312和T25具有较高的体细胞胚发生能力，而其它品种较难或不能进行体细胞胚发生(Trolinder N L，Xhixian C.)。董合忠等根据胚性愈伤组织成胚数量和发育成植株的多少将陆地棉品种分为四类：第一类是体细胞发生能力强，易成苗的品种，如珂字312、珂字201等；第二类是具有一定的体细胞胚发生能力，成苗数量中等，经多次继代筛选后可得到较多的体细胞胚和部分再生植株，如岱字15、岱字16等；第三类是体细胞胚发生能力差，畸形胚多，经长时间继代筛选后方可得到个别植株，如鲁棉1号、7号等；第四类是体细胞胚极难或不能发生，如斯字棉215、斯字506等。棉花种质资源丰富，目前仅珂字棉系列，中棉系列、鲁棉系列等少数品种获得了体细胞胚和再生植株。

研究表明陆地棉不同外植体类型之间在愈伤组织诱导和分化方面存在极大差异。因此，棉花组织培养体系的改良与外植体的筛选，历来是组织培养工作者的研究重点之一。棉花下胚轴比子叶或叶作外植体优越(Troloinder等1988)。子叶节附近是下胚轴最易形成愈伤组织的部分(Finer1984，张献龙等1990)。Finer等(1984)发现用成熟棉株的茎、叶、叶柄作外植体与用无菌苗相比，难以诱导愈伤组织。谭晓连等(1988)研究了盆栽拟似棉的叶、叶柄和茎在离体培养中的反应，发现采用茎最容易诱导体细胞胚胎发生和植株再生。未授粉胚珠产生的愈伤组织不如授粉胚珠(宋平，1987)。外植体的放置方向很重要，利用下胚轴作外植体时，必须使表皮与培养基接触，若使切口与培养基接触，会产生生长缓慢的红色愈伤组织(Price等)。下胚轴最易，中胚轴和上胚轴次之，子叶较差，叶片和茎段最差，近年来研究毛根能够再生，但难易程度缺少比较(焦改丽等，2002)；张海等(2002)报道了棉花子叶离体培养与植株再生，但再生频率不高。

不同研究者得出的结论有一定差异，可能与不同遗传型材料对诱导培养体系存在较大的差异有关。而总的来说，幼嫩组织比成熟组织易诱导棉花体细胞胚胎发生(迟吉娜，等2004)。张朝军等建立了棉花大田叶柄组织培养体系，并利用叶柄组织培养体系选育了高分化率材料(专利号ZL200610089439.1)。利用大田成熟植株组织或器官作为外植体建立组织培养体系，是棉花组织培养研究的热点之一。

目前应用于棉花愈伤组织诱导的基本培养基很多，如MS，LS，White，BT，BS，Hitsch，CM-1，SM，KM，P等，但以MS和LS应用较多。棉花不同外植体的组织培养用培养基，主要是基于MS培养基进行改良。

发明内容

本发明的目的在于提供一种棉花叶片直接诱导胚性愈伤组织的培养基。

本发明提供的棉花叶片直接诱导胚性愈伤组织的培养基，是在MSB1基本培养液中添加如下物质得到的培养基：KT、6-BA、2，4-D，IAA，碳源和凝胶剂；

所述培养基中KT的终浓度是0.005-0.15mg/L、6-BA终浓度是0.005-0.15mg/L、2，4-D的终浓度是0.0001-0.001mg/L、IAA的终浓度是0.001-0.02mg/L。

上述MSB1基本培养液是将硝酸铵减半、硝酸钾增加一半的MS培养基的无机盐与B5培养基的有机成分组成，其溶剂是水，溶质见表1。

表1.MSB1基本培养液的溶质

上述凝胶剂可以是琼脂粉、卡拉胶或Gel rite等组织培养常用固化剂，优选的是美国Sigma公司生产的Gel rite(sigma公司生产，货号是G1910)。当然也可以是琼脂粉，用量是6.5-7.0克/L，也可以是卡拉胶等组织培养常用凝胶剂，用量以2.2g/L Gel rite能达到的培养基硬度为基础，适当调整用量。

上述碳源可以是葡萄糖或蔗糖，胚性愈伤组织诱导阶段用葡萄糖，胚状体萌发阶段用蔗糖。

进一步，上述棉花叶片直接诱导胚性愈伤组织的培养基中KT为0.005-0.15mg/L、6-BA为0.005-0.15mg/L、2，4-D为0.0001-0.001mg/L，IAA为0.001-0.02mg/L，葡萄糖为25-35g/L和Gel rite为1.8-2.5g/L。

最优地，棉花叶片直接诱导胚性愈伤组织的培养基中KT为0.05mg/L、6-BA为0.1mg/L、2，4-D为0.005mg/L，IAA为0.005mg/L，葡萄糖为25g/L和Gel rite为2.2g/L。

本发明的另一目的在于提供一种生产棉花再生苗的方法。

本发明提供的生产棉花再生苗的方法，包括以下步骤：

1)将棉花叶片置于上述的棉花叶片直接诱导胚性愈伤组织的培养基中培养，得到胚性愈伤组织；

2)将步骤1)得到的胚性愈伤组织在胚状体萌发培养基中继代培养，获得胚状体，得到棉花再生苗。

上述的胚状体萌发培养基，是在MSB1基本培养液中，添加KT、6-BA、蔗糖和Gel rite得到的培养基，所述MSB1基本培养液溶剂是水，溶质见表1。

所述胚状体萌发培养基中KT的终浓度是0.001-0.15mg/L，6-BA的终浓度为0.005-0.15mg/L，蔗糖25-35g/L，Gel rite的终浓度是2.0-2.5g/L。

进一步，上述胚状体萌发培养基中KT的终浓度是0.001-0.1mg/L，6-BA的终浓度为0.005-0.15mg/L，蔗糖的终浓度为28-32g/L，Gel rite的终浓度是2.0-2.3g/L。

最优地，上述胚状体萌发培养基中KT的终浓度是0.01mg/L，6-BA的终浓度为0.01mg/L，蔗糖的终浓度为30g/L，Gel rite的终浓度是2.2g/L。

上述步骤1)中的棉花叶片是经过预处理的，所述预处理是将棉花叶片用0.1％的HgCl₂进行消毒，然后用无菌水冲洗至少一次。

上述棉花叶片可以是陆地棉的不同品种的真叶，不适合子叶、苞叶等部分。特别适合中棉所24、中棉所27、冀合713或冀合321，同时该方法也适合珂字棉312、珂字201，及中394、中091等易于组织培养的棉花材料。

本发明的方法是利用大田棉株的真叶作为外植体建立组织培养体系，最终建立叶片直接分化的、稳定高效的组织培养体系。该体系由叶片直接诱导分化出胚性愈伤组织，而不经过愈伤组织，有效的缩短了棉花组织培养周期，可以用于外源基因的快速遗传转化、也可以用于分化率遗传研究、易于组织培养的材料选育等方面。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1、棉花再生苗的获得及其统计观察

1、胚性愈伤组织的制备

1)外植体的预处理

取大田棉花植株的真叶作为外植体。将棉花叶片取回后，先准备8个经高温灭菌(121℃，14min)的培养皿，第1、6、7、8号培养皿中加入适量灭菌水(121℃，14min)，第2、3、4培养皿中加入质量百分浓度为0.1％的HgCl₂溶液。

其中棉花设置3个品种，分别是：

中棉所24，中国农业科学院棉花研究所科技贸易公司销售；

冀合321，中国农业科学院棉花研究所科技贸易公司销售；

中棉所27，中国农业科学院棉花研究所科技贸易公司销售。

预处理具体操作：先将从大田采摘的叶片在第1培养皿中冲洗一遍，然后依次移到第2、3、4培养皿中浸泡灭菌，在每个培养皿中浸泡1-2min，在质量百分浓度为0.1％HgCl₂中浸泡灭菌总时间在4-5min比较合适，由于叶片背面叶毛较多，灭菌时要充分搅动，以免在叶片表面形成小气泡，使灭菌不彻底，易造成污染；在第6、7、8号培养皿中各冲洗1次，要彻底冲洗掉残留的HgCl₂，残留的HgCl₂也可以造成叶片死亡、胚性愈伤组织诱导、生长困难等。冲洗后的叶片在主叶脉区域切成0.5cm×0.5cm左右的外植体备用(注意不要去除叶脉)。

2)胚性愈伤组织的获得

将步骤1)得到的备用外植体，在无菌条件下接到经高温灭菌的棉花叶片直接诱导胚性愈伤组织的培养基(简称EC1培养基)上(培养基配好后，倒入100ml三角瓶中，每瓶加约60ml，经高温灭菌后备用。灭菌条件是121℃，14min)，注意叶片正面向上，用叶片背面接触培养基。25天后，可观察到愈伤组织生长，35-60天后，可以获得胚性愈伤组织。

其中，EC1培养基是在MSB1基本培养液的基础上，加激动素(KT)、6-BA、2，4-D、IAA、葡萄糖、Gel rite(Sigma，货号：G1910)；其中，KT的终浓度是0.05mg/L、6-BA的终浓度是0.1mg/L、2，4-D的终浓度是0.005mg/L、IAA的终浓度是0.005mg/L、葡萄糖的终浓度是25g/L、Gelrite的终浓度是2.2g/L，调节pH至5.8，其中所述MSB1基本培养液的溶剂是水，溶质见表1。

培养条件是，将三角瓶放置在2000-4000lx的光照强度下培养，以3000lx光强较好；每天光培养14小时，暗培养10小时；培养室温度控制在20-30℃。

3)统计观察

实验设置三个品种，重复3次，每处理为一升培养基，分装在18个100ml的三角瓶中，每瓶接5片外植体。实验结果见下表2。从表2可以看出，中棉所24诱导率最高，冀合321次之，中棉所27最低。说明和无菌棉下胚轴一样，胚性愈伤组织的诱导存在基因型差异。

表2.不同材料叶片分化率统计

2、胚性愈伤组织分化成苗

1)胚状体萌发培养基的制备

胚状体萌发培养基(命名为SE1培养基)是在MSB1基本培养液的基础上添加KT、6-BA、蔗糖和Gel rite。其中：KT的终浓度是0.01mg/L，6-BA的终浓度是0.01mg/L，蔗糖的终浓度是30g/L，Gel rite的终浓度2.2g/L，调节pH为6.5，其中所述MSB1基本培养液的溶剂是水，溶质见表1。

2)分化苗的获得

将上述步骤1中制备的胚性愈伤组织置于上述步骤2的步骤1)中得到的胚状体萌发培养基中培养，培养条件是，将三角瓶放置在2000-4000lx的光照强度下培养，以30001x光强较好。每天光培养14小时，暗培养10小时。每40天继代一次，继代培养2-3次后，就可以得到再生苗。

3)统计观察

为了明确不同材料来源的胚性愈伤组织对成苗培养基的反应，选用中棉所24、中棉所27、冀合321三个棉花品种，每品种选取来自叶片的胚性愈伤组织20块，每块分接到3瓶成苗培养基上。下次继代时统计成苗数。继代培养时，每瓶继代一瓶，不扩繁。从表3结果可以看出，中棉所24、中棉所27与冀合321相比，成苗数较少。说明成苗培养阶段也存在基因型差异。

表3.不同材料胚性愈伤组织的成苗数

实施例2、棉花再生苗的获得及其统计观察

本实施例与实施例1的区别在于以下三点，其余步骤完全相同：

1、所用原材料仅为中棉所24，由中国农业科学院棉花研究所早熟育种课题组培育，由中国农业科学院棉花研究所科技贸易公司销售。

2、EC1培养基：在MSB1基本培养液的基础上添加了激动素(KT)、6-BA、2，4-D、IAA、葡萄糖、Gel rite；其中，KT的终浓度是0.005mg/L、6-BA的终浓度是0.005mg/L、2，4-D的终浓度是0.0001mg/L、IAA的终浓度是0.001mg/L、葡萄糖的终浓度是25g/L、Gel rite的终浓度是1.8g/L，调节pH至5.8。

3、SE1培养基：是在MSB1基本培养液的基础上添加KT、6-BA、蔗糖和Gel rite；其中：KT的终浓度是0.001mg/L，6-BA的终浓度是0.005mg/L，蔗糖的终浓度是25g/L，Gel rite的终浓度是2.0g/L，调节pH为6.2。

将实验结果见表4。从表2、表4可以看出，激素水平的降低，对胚性愈伤组织诱导率影响较小。从胚性愈伤组织诱导实验观察看出，胚性愈伤组织出现较晚，约30天后才观察到胚性愈伤组织。在继代培养阶段，由于胚性愈伤组织生长缓慢，导致在胚状体萌发阶段生长速度受限，获得再生植株的时间推后，数量减少。

表4中棉所24叶片的组织培养效果

实施例3、棉花再生苗的获得及其统计观察

本实施例与实施例1的区别在于以下三点，其余步骤完全相同：

1、所用原材料仅为中棉所24，由中国农业科学院棉花研究所早熟育种课题组培育，由中国农业科学院棉花研究所科技贸易公司销售。；

2、EC1培养基：在MSB1基本培养液的基础上添加了激动素(KT)、6-BA、2，4-D、IAA、葡萄糖、Gel rite；其中，KT的终浓度是0.15mg/L、6-BA的终浓度是0.15mg/L、2，4-D的终浓度是0.001mg/L、IAA的终浓度是0.02mg/L、葡萄糖的终浓度是35g/L、Gel rite的终浓度是2.5g/L，调节pH至5.8。

3、SE1培养基：是在MSB1基本培养液的基础上添加KT、6-BA、蔗糖和Gel rite；其中：KT的终浓度是0.1mg/L、6-BA的终浓度是0.15mg/L蔗糖的终浓度是35g/L、Gel rite的终浓度是2.5g/L，调节pH至6.5。

将实验结果见表5。从表2、表5可以看出，由于激素水平的升高，对胚性愈伤组织诱导率有较大影响。从胚性愈伤组织诱导实验观察看出，由于激素水平的增加，非胚性愈伤组织生长旺盛，一般在20天后即可观察到愈伤组织。愈伤组织的大量生长，影响了胚性愈伤组织的获得与生长。约30天后才在愈伤组织周围的部分区域观察到部分胚性愈伤组织。在继代培养阶段，由于愈伤组织生长较快，干扰了胚性愈伤组织的生长，使胚状体萌发阶段生长速度受限，获得再生植株的时间推后，数量减少。

表5中棉所24叶片的组织培养效果