猪苓人工栽培菌种和蜜环菌及猪苓菌种菌核化生产方法

摘要

本发明涉及中药材猪苓，具体地说是一种猪苓人工栽培菌种和伴生蜜环菌及猪苓菌种菌核化生产方法，猪苓菌种林研猪苓3号，伴生蜜环菌林研3号；猪苓菌种菌核化生产方法为，1)一级培养基为：10-50g玉米粉、10-20g蔗糖或葡萄糖、1-3g牛肉膏、15-22g琼脂、水1000ml；灭菌后接种猪苓菌种，培养得一级菌种；2)按重量比，以20-60％玉米馇、80-40％阔叶树木屑和/或直径0.1-2cm、长3-5cm小木段混合成二级培养基，加水搅拌均匀，培养基的含水量55-60％；灭菌后同时接种猪苓菌种一级种和蜜环菌，在20-25℃条件下培养30-45天，即得到可二级菌种。本发明生产成本低，菌核形成快。

说明书

技术领域

本发明涉及中药材猪苓，具体地说是一种猪苓人工栽培菌种和伴生蜜环菌及猪苓菌种菌核化生产方法。 

背景技术

猪苓是我国传统的稀有中药材，目前猪苓采用野生菌核作种半人工栽培技术(文献1.郭顺星，徐锦堂，萧培根.猪苓生物学研究进展。中国中药杂志，1996，(9)：515-517)。由于医药市场的扩大和出口，野生产品资源锐减，难以满足市场需求。采用野生菌核作种的栽培方式，需要大量的野生菌核(灰苓即猪苓的第2年产品)(文献2.许广波，傅伟杰.赵旭奎，我国猪苓研究的进展。菌物研究，2003，1(1)：58-61；文献3.许广波，傅伟杰，李如亮等.长白山区猪苓半人工栽培技术体系的研究。延边大学农学学报，2004，24(4)：241-244)，导致人工栽培种源困难，致使人工栽培成本上升，已成为制约猪苓人工栽培技术大面积实施的主要瓶颈(文献4.程显好.猪苓和蜜环菌人工培养及影响几种有效成分产生因素的研究。中国博士学位论文，2006-09-27：1-181；文献5.邢晓科.猪苓与伴生菌相互作用的研究。中国博士学位论文，2006-10-13：1-154)；同时由于中国蜜环菌种类多达14种，许多并不是猪苓栽培的适宜伴生菌(文献6.赵俊，赵杰.中国蜜环菌的种类及其在天麻栽培中的应用。食用菌学报，2007，14(1)：67-72；文献7.李福后，王伟霞，许冰.蜜环菌的研究进展。安徽农业科学2007，35(25)：7741-7742)。因此，研究选育猪苓菌种和配套的蜜环菌，对于开展猪苓人工大面积栽培生产具有重要的经济意义。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种生产成本低，菌核形成快猪苓人工栽培菌种和伴生蜜环菌及猪苓菌种菌核化生产方法。 

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为： 

一种猪苓人工栽培菌种，命名为：林研猪苓3号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC No.3109。分类名称：猪苓Grifulaumbelleta； 

一种蜜环菌，其为与猪苓菌配套的伴生菌，命名为：林研3号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC No.3108。分类名称：蜜环菌Armillaria mellea； 

所述猪苓菌种菌核化快速生产方法， 

1)一级培养基配方组成为：10-50g玉米粉、10-20g蔗糖或葡萄糖、1-3g牛肉膏、15-22g琼脂、水1000ml；灭菌后接种猪苓菌种，猪苓菌种与 培养基以体积比例为16-25∶100的比例混合，进行猪苓菌的一级培养，培养条件为20-27℃培养14-20天，在试管斜面上形成大量菌核，得一级菌种； 

2)按重量比，以20-60％玉米馇、80-40％阔叶树木屑和/或直径0.1-2cm、长3-5cm的小木段混合制成二级培养基，加水搅拌均匀，使培养基的重量含水量达55-60％；灭菌后同时接种猪苓菌种的一级种和蜜环菌，在20-25℃条件下培养30-45天，即得到可大量繁殖的二级菌种； 

猪苓菌种和蜜环菌于二级培养基中的接种量为，猪苓菌种和蜜环菌分别与培养基的体积比例为0.5-5∶100。 

将含水量55-60％的二级培养基装入聚丙烯塑料袋内，灭菌后接种步骤2)得到的二级菌种，在20-25℃条件下培养30-45天，即得到可大量繁殖的三级菌种。 

步骤2)中所采用的蜜环菌是采用一级培养基培养增殖后的蜜环菌，一级培养基配方组成为：10-50g玉米粉、10-20g蔗糖或葡萄糖、1-3g牛肉膏、15-22g琼脂水1000ml；灭菌后接种蜜环菌菌种，其培养条件为，将蜜环菌菌种与培养基以体积比例为16-25∶100的比例混合，20-27℃培养14-20天，得蜜环菌。 

所述二级培养基配制时，玉米馇需要预先用水浸泡12-16小时，进行预湿再与阔叶树木屑和/或小木段混合；所述阔叶树为柞树、板栗、枫树、榆树中的一种或多种。 

本发明具有如下优点： 

1.生产成本低。采用野生猪苓菌核半人工栽培法栽培，每亩猪苓菌核成本为15000元(按每亩用300kg野生菌核、栽培600穴计算)。由于猪苓菌核价格高，同时又难以保证生产大量需要和及时供应，极大地制约了猪苓大面积栽培。利用本发明方法生产的猪苓菌种进行人工栽培，每亩需要猪苓菌种300kg、成本600元、栽培600穴，其他菌棒等材料和成本与以往的栽培方法相同。 

采用本发明所生产的猪苓菌种进行人工栽培，每亩比传统方法可节省14400元，栽培成本是传统方法的4％，具有明显的经济效益，可高效、及时地满足大规模生产的需要。 

2.菌核形成快。以往培养猪苓菌种多采用PDA培养基为一级培养基，猪苓菌丝生长慢、形成菌核少，菌核形成需要30天以上。经过申请人对猪苓C、N源研究，所研制的猪苓菌种一级培养基配方，可在14天形成大量菌核，比PDA培养基快16天，同时解决了二级菌种的扩大培养配方和三级猪苓菌种繁殖技术。在二级种扩繁的同时接种猪苓菌和蜜环菌，在35-40天内能形成可供生产中应用的猪苓菌种，由于使用玉米粉和玉米馇、蔗糖木屑及小木段等低成本材料生产出可大量形成菌核的猪苓菌种，替代半人工栽培过程中使用的野生菌核，极大地降低了生产成本。 

一种猪苓人工栽培菌种，命名为：林研猪苓3号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC No.3109。分类名称：猪苓Grifulaumbelleta；保藏日期2009年05月25日；

一种蜜环菌，其为与猪苓菌配套的伴生菌，命名为：林研3号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC No.3108。分类名称：蜜环菌Armillaria mellea；保藏日期2009年05月25日； 

具体实施方式

以下实施例中采用的猪苓菌和蜜环菌为：辽宁省林科院经3年的研究，分离、培养、选育出适宜猪苓人工栽培技术使用的专用猪苓菌种林研猪苓3号(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC No.3109)和配套使用的蜜环菌林研3号(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC No.3108)。 

它们是从辽宁省宽甸县猪苓野生菌核中分离培养选育出适宜猪苓人工技术的专用猪苓菌种和配套使用的蜜环菌菌种，可以在培养室内大量扩繁生产， 

解决了以往猪苓人工栽培过程中采用野生菌核作种需要大量野生菌核的矛盾。国内未见猪苓人工选育的菌种和配套的亲和力强的蜜环菌菌株。同时由于中国蜜环菌种类多达14种，许多并不是猪苓栽培的适宜伴生菌。 

实施例1 

1、以10g玉米粉、20g蔗糖、3g牛肉膏、22g琼脂、水1000ml，配制一级培养基；在1.5个大气压、121℃条件下，灭菌20分钟； 

1)在无菌环境下接种猪苓菌种，猪苓菌种与培养基的体积比例为25∶100，20℃培养20天制成一级菌种，在试管斜面上形成大量菌核； 

2)以一级培养基配方灭菌后，直立试管冷却25℃，转接蜜环菌，菌种与培养基的体积比例为25∶100，培养条件同猪苓菌种，得蜜环菌菌种； 

2、以20％玉米馇、80％柞树木屑的重量比例配制成含水量60％的二级培养基，玉米馇使用前预先经12-16小时泡水预湿；然后将二级培养基装入罐头瓶并用聚丙烯薄膜封口，在121℃条件下，高压灭菌90分钟；待冷却到25℃以下，同时接种步骤“1”得到的猪苓一级菌种和蜜环菌菌种，接种的猪苓菌种和蜜环菌分别与培养基的体积比例为2∶100，在20℃条件下培养45天，即得到可大量繁殖的二级菌种； 

3、用聚丙烯槊料袋装入二级培养基，按步骤“2”的方法灭菌后，接种二级菌种并培养45天，接种的二级菌种与培养基的体积比例为2∶100，培养条件同步骤“2”的方法，即得到三级菌种。 

实施例2 

1、以50g玉米粉、10g葡萄糖、1g牛肉膏、15g琼脂、水1000ml，配制一级培养基；在1.5个大气压、121℃条件下，灭菌20分钟； 

1)在无菌环境下接种猪苓菌种，猪苓菌种与培养基的体积比例为20∶100，27℃培养20天制成一级菌种，在试管斜面上形成大量菌核； 

2)以一级培养基配方灭菌后，直立试管冷却25℃，转接蜜环菌，菌种与培养基的体积比例为20∶100，培养条件同猪苓菌种； 

2、以重量比例60％玉米馇、40％阔叶树枫树和榆树直径0.1-2cm、长3-5cm的小木段配制成含水量55％的二级培养基，玉米馇使用前预先经12-16小时泡水预湿；然后将二级培养基装入罐头瓶并用聚丙烯薄膜封口，在121℃条件下，高压灭菌90分钟；待冷却到25℃以下，同时接种步骤“1”得到的猪苓一级菌种和蜜环菌菌种，接种的猪苓一级菌种和蜜环菌分别与培养基的体积比例为4∶100，在25℃条件下培养30天，即得到可大量繁殖的二级菌种； 

3、用聚丙烯槊料袋装入二级培养基，按步骤“2”的方法灭菌后，接种二级菌种并培养35天，接种的二级菌种与培养基的体积比例为5∶100，培养条件同步骤“2”的方法，即得到三级菌种。 

实施例3 

1、以30g玉米粉、15g蔗糖或葡萄糖、2g牛肉膏、18g琼脂、水1000ml，配制一级培养基；在1.5个大气压、121℃条件下，灭菌20分钟； 

1)在无菌环境下接种猪苓菌种，猪苓菌种与培养基的体积比例为16∶100，25℃培养18天制成一级菌种，在试管斜面上形成大量菌核； 

2)以一级培养基配方灭菌后，直立试管冷却25℃，转接蜜环菌，菌种与培养基的体积比例为16∶100，培养条件同猪苓菌种； 

2、以30％玉米馇、70％板栗木屑的重量比例配制成含水量58％的二级培养基，玉米馇需要提前12-16小时泡水预湿；然后将二级培养基装入罐头瓶并用聚丙烯薄膜封口，在121℃条件下，高压灭菌90分钟；待冷却到25℃以下，同时接种步骤“1”得到的猪苓一级菌种和蜜环菌菌种，接种的猪苓一级菌种和蜜环菌分别与培养基的体积比例为1∶100，在23℃条件下培养40天，即得到可大量繁殖的二级菌种； 

3、用聚丙烯槊料袋装入二级培养基，按步骤“2”的方法灭菌后，接种二级菌种并培养40天，接种的二级菌种与培养基的体积比例为1∶100，培养条件同步骤“2”的方法，即得到三级菌种。 

本发明上述实例所获得的二级菌种或三级菌种即可用于猪苓生产性栽培。