用于光动力疗法和坏死肿瘤成像的RGD-(细菌)叶绿素缀合物

摘要

本发明提供与非坏死肿瘤区相比在坏死肿瘤区归巢和蓄积长久得多的RGD-叶绿素和RGD-细菌叶绿素缀合物，其用于微创肿瘤靶向成像、肿瘤靶向光动力疗法和/或坏死肿瘤的在线预后。

说明书

技术领域

本发明属于肿瘤学领域并涉及通过肿瘤靶向光动力学成像检测坏死肿瘤区以及使用光敏剂(特别是叶绿素和细菌叶绿素衍生物与含有RGD基序或RGD肽模拟物的肽的缀合物)通过肿瘤靶向光动力疗法治疗所述肿瘤。

定义和缩略语

Bchla：细菌叶绿素a：五环7，8，17，18-四氢卟啉，具有第5个碳环(isocyclic ring)，一个中心Mg原子，在17³位上有一个植基或牻牛儿基牻牛儿基，在13²位上有一个COOCH₃基团，在13²位上有一个H原子，在2、7、12、18位上有甲基，在3位上有一个乙酰基，在8位上有一个乙基，本文称为化合物1；Bphe：细菌脱镁叶绿素a(其中中心Mg被两个H原子置换的Bchl)；Bpheid：细菌脱镁叶绿甲酯酸a(由无中心金属原子的Bphe衍生，C-17²无甲酸)；Chl：叶绿素；红螺菌菌绿素(Rhodobacteriochlorin)：四环7，8，17，18-四氢卟啉，17位上有一个-CH₂CH₂COOH基团，在13位上有一个-COOH，在2、7、12、8位上有甲基，在3和8位上有乙基；Pd-Bpheid：Pd-细菌脱镁叶绿甲酯酸a；EC：内皮细胞；ECM：胞外基质；NIR：近红外；PDT：光动力疗法；RGD-4C：环状九肽CDCRGDCFC-NH₂；ROS：活性氧类。

整篇说明书中使用细菌叶绿素衍生物的IUPAC编号。使用该命名法，天然细菌叶绿素在13²和17²位携带两个羧酸酯，无论如何在13³和17³位上它们是被酯化的。

背景技术

癌症患者中，原发瘤和转移瘤的坏死和低氧与肿瘤侵袭性和预后差强相关。达到一定大小的实体瘤，生长速度超过其氧气供应，变得低氧并最终坏死。在位于距营养血管超过70μm的肿瘤区，间质氧压力降低，而距离超过150-180μm时，细胞变得几乎缺氧(Vaupel等，2001)。一般认为，坏死是由血管瓦解引起的慢性缺血和超过血管生成速度的快速肿瘤细胞生长的结果(Leek等，1999))。

实体瘤中的坏死区经历了形态改变。开始时，原有结构基本上保持，坏死细胞保持其整体形状，但却变成高度嗜酸性的。一段时间后，这种形式被液化性坏死所替代，其中细胞结构分解(Leek等，1999)。

坏死和低氧两者已被充公证实是预后差的标志。有研究提出，在上尿路移行细胞癌、恶性间皮瘤和肾细胞癌(RCC)中，将坏死作为癌症结果的独立预测物并且作为用于预后目的的极有力的工具(Edwards等，2003；Sengupta等，2005；Lee等，2007)。

在侵袭性乳腺癌中，坏死与高血管密度和血管生成、高水平局灶性巨噬细胞浸润和患者生存期缩短有关(Kato等，1997；Lee等，1997；Leek等，1999；Tomes等，2003)。中心性坏死，这是侵袭性乳腺癌的普遍特征，与结局差和肿瘤侵袭有关。研究表明，巨噬细胞被由低氧或垂死肿瘤细胞释放的趋化因子吸引至坏死肿瘤(Leek等，1999)。与非粉刺型(非侵袭性)原位管癌(DCIS)不同，在粉刺型(侵袭性)DCIS的管腔中发现大量坏死区(Cutuli等，2002)。在达360μm直径的DCIS病灶中心的坏死和低氧，在瘤细胞的性质和行为上有着明显的生物学差异。因此认为导管中坏死的存在与否可作为DCIS分级切实可行的标准(Bussolati等，2000)。

研究显示，这种肿瘤类型的大部分的坏死与低氧有关(Tomes等，2003)。低氧和缺氧使肿瘤细胞受到氧化应激。研究显示，长期的低氧条件提高突变率，加快肿瘤进程，增加血管生成和转移潜力并激活促生长信号转导途径。对氧化应激的适应常常使肿瘤细胞对某些治疗方式产生抗性(Brown等，2001)。

坏死与低氧之间的关联性得到了非常充分的证实，然而可能存在不会达到坏死的低氧条件，或者存在不一定反映急性或严重低氧的坏死(Dewhirst 1998)。低氧有若干种标记基因，其中有低氧诱导因子1(HIF1)、葡萄糖转运蛋白1和碳酸酐酶IX。只有检出所有三种标记才能确定坏死的分类(Tomes等，2003)，这使得通过基因表达来鉴定坏死区变得颇为复杂。

已知坏死和低氧条件在癌症疗法中产生大量问题。低氧肿瘤区对放射治疗具有相对抗性，因为放射攻击(radiation assault)推进不良，而且因为可最终存在于肿瘤体积(tumor volume)中的干细胞对治疗的反应不佳，导致了肿瘤再生长(Brown等，1998；Dean等，2005)。因为大多数化疗试剂因与循环细胞相互作用而致细胞死亡，所以因低氧造成的细胞停滞(cell arrest)导致对常规化学疗法产生抗性，使非增殖细胞或慢增殖细胞不受损害(Tannock，1978)。此外，低氧条件通常产生改变药物性质的酸性环境，使药物的活性降低(Tannock等，1989)。

实体瘤化学疗法的更多问题之一包括将治疗剂运输到肿瘤，尤其是运输到低氧和坏死区(domain)。肿瘤通常含有具有异质血流的不规则渗漏微血管和大的血管间距离。除不存在适当淋巴引流和高间质压力以外，这些特征使得扩散成为肿瘤中营养物和药物的血管外运输的最重要的机制。然而，由于无规则血管形成，所以比起正常组织中的细胞，许多肿瘤细胞位于距毛细血管更远的距离，这反映在细胞部位处抗肿瘤药的浓度不足中。而且，因缺乏淋巴引流引起的间质液压升高降低了对流摄取(convection uptake)，并进一步抑制药物(特别是大分子)分布到肿瘤细胞内(Minchinton等，2006)。

因此，在体内检测肿瘤内低氧和坏死区的能力极为重要。对低氧肿瘤区的了解可有助于选择正确的治疗法--或者通过在治疗前或治疗期间提高肿瘤氧合作用，或通过利用低氧的策略(Weinmann等，2004)。采用该方法，应用低氧激活的细胞毒素例如2-环丙基-吲哚并醌(indoloquinones)、AQ4N、替拉扎明(TPZ)和PR-104可有助于改进治疗效果(Brown等，2004；Lee等，2007；Patterson等，2007)。

组织病理学和免疫组织化学常常用来鉴定坏死和低氧；然而，它们是有创的，而且不能够进行原位检测。原位方法包括核磁共振成像(MRI)(Kamel等，2003；Metz等，2003)、血氧水平依赖性MRI(Kennan等，1997)、正电子发射断层摄影术(PET)(Lehtio等，2004)和弥散加权MRI(Lang等，1998)。

用于MRI的坏死亲和性造影剂(Necrosis-avid contrast agent，NACA)可分成卟啉型造影剂和非卟啉型造影剂。最为人所知的卟啉型NACA之一是大部分在坏死区边缘表现特异性坏死蓄积(necrosisaccumulation)的gadophrin-2。有研究认为蓄积机制以血清白蛋白(SA)运输为基础，但最新研究对这种方法提出了质疑(Hofmann等，1999；Ni等，2005)。

大多数恶性细胞在血管不存在时无法生长到临床可检测到的肿瘤块。这就是为什么达到一定大小(大约2-3mm³)的肿瘤必须转变成血管生成表型以支持其生长。向血管生成表型的转变可以表示血管生成因子和血管生成抑制物的表达失衡。血管生成因子的过量表达和血管生成抑制物的减量调节两者都是必需的并且足以诱导新血管生长，这两个过程通常同时发生以启动肿瘤血管生成(Cao，2005)。

肿瘤中代表血管的生化特征可包括血管生成相关分子，例如某些整联蛋白。细胞粘附受体的整联蛋白家族包括在胞外基质中或细胞表面上识别糖蛋白配体的截然不同的24种αβ异二聚体。整联蛋白家族的多个成员，包括α5β1、α8β1、αIIbβ3、αVβ3、αVβ5、αVβ6和αVβ8，均识别其配体内的Arg-Gly-Asp(RGD)基序。这些配体包括纤连蛋白、血纤蛋白原、玻连蛋白、冯维勒布兰德因子(von Willebrand factor)和许多其它大的糖蛋白(Takagi，2004)。因此，研究表明含有RGD基序的分子提供用于选择性摄取及随后成像并检测原发瘤病灶、坏死区和靶向疗法的新的机会。这个研究领域受到越来越多的注意。有大量有关使用RGD标记的成分用于成像的报道(Temming等，2005)。文献中报导的主要缺点是在4-5mm下肿瘤部位报告成分(reporting element)的浓度不够。这就是为什么RGD靶向成像的使用主要限于PET扫描这种更灵敏的方法。

了解肿瘤生长、转移形成、肿瘤-宿主相互作用和血管生成需要肿瘤模型，这可容易地跟踪肿瘤细胞，甚至在其各自水平上。用于直接测量肿瘤的最有意义的生物参数的现有方法仅可通过有创终点法(invasive end-point procedure)获得(Lyons，2005)。这类方法大多数包括组织病理学检查或免疫组织化学，它们是缓慢的、有创的，而且不一定是灵敏的方法(Yang等，2000)。因此，有必要引入能够直接显现肿瘤组织、无创的并且能够在细胞和分子两个水平上测量肿瘤相关参数的新方法。

近年来，已开发出若干无创性方法：MRI和光谱法、PET、单光子发射型计算层析X射线照相术(single photon emission computedtomography)和计算层析X射线照相术(Lyons，2005)。

有若干基于转基因的成像方法。这些方法使得无创性测量具有优良肿瘤特异性的多个生物参数、活的模型动物中的整体成像和转移检测成为可能。这些方法中有两种是：生物发光成像和荧光成像。

光学生物发光是以下列三种组分为基础：酶萤光素酶、底物萤光素和腺苷三磷酸(ATP)。在该方法中，不需要光激发来产生光发射。然而，如果这些组分之一不存在，则不能够检测。该方法由于良好的信噪比值而能够高通量地监测细胞存活力或细胞功能(Lyons，2005)。萤光素酶/萤光素方法的主要缺点是解剖和图像分辨率低，因此需要相当长的时间从麻醉动物中采集足够的光子以形成图像。再者，组织深度加大和外源递送底物的需要削弱了体内光发射(Yang等，2000；Lyons，2005)。此外，难以进行离体实验，因为ATP需要酶活性。重要的是，该方法包括主观参数化法，降低了它的定量价值。

通过光学荧光成像监测肿瘤进展的另一种方法是以用稳定的荧光蛋白(例如绿色荧光蛋白(GFP)和红色荧光蛋白(RFP))转染肿瘤细胞为基础。在该方法中，在可检出发射光之前需要外部激发。该方法的主要缺点是(1)随组织深度加大，激发光和发射光易于减弱，和(2)非标记细胞的自身荧光加大噪音(Lyons，2005)。主要优点包括：多个报道分子波长使得能够多重成像；与用于分析方法的多种离体方法(例如新鲜组织分析)高度兼容；对于成像不需要准备步骤，这使得它特别适于在活组织中进行肉眼观察；该方法是外部的并且是无创性的；该方法提供移植动物的内部生长肿瘤和转移的实时荧光光学成像，其可给出整体图像，而且还可给出从原发病灶和转移中提取的单细胞的图像(Yang等，2000；Lyons，2005)。整体成像是了解肿瘤发育最必须的工具之一。因此，通过用GFP或RFP对肿瘤细胞进行遗传标记，可获得原发瘤和转移瘤的外部整体成像(Yang等，2000)。

荧光标记法适于体内、新鲜组织和体外检测。采用表达荧光蛋白的肿瘤细胞能够使活的动物成像并跟踪不同时间点的肿瘤进展。RFP的发射波长比GFP的长，因此能够使显微镜可观察的肿瘤生长的灵敏度和分辨率更高(GFP激发波长-489nm，发射波长-508nm，RFP激发波长-558nm，发射波长-583nm)。

原位管癌(DCIS)包括出现恶变并在乳腺导管腔内蓄积的细胞的克隆增殖，无证据显示侵袭至附近乳腺间质和超过上皮基底膜以外。如果早期不接受治疗，非侵袭性DCIS病灶便非常有可能转变成危及生命的侵袭性疾病。在广泛使用乳房X线摄影术后，诊断患有早期DCIS的患者的数目激增，因此推荐的治疗方式从乳房切除术(接近100％治愈率)向保乳(BC)手术(BCS)转变，例如局部病灶切除术或乳腺微创手术(Kepple等，2004)，任选伴RT和内分泌辅助疗法。然而，最近发现与乳房切除术后相比，在BCS后，甚至当同时进行RT时，同侧(同一乳房)或对侧(另一乳房)两者的复发率都较高，特别是年龄≤40的患者(消退率25-35％；Bijker N等，2006；Cutuli等，2002)。此外，多病灶病变给部分切除带来困难，对于被发现对肿瘤完全消退是决定性的边缘的持续受累也是如此(Cellini等，2005)。此外，生理和心理负担以及局部病灶切除术和随后的RT的可能的美容结果都十分重要。在乳腺癌疗法中，这些缺点使现今DCIS的治疗和管理成为有争议的问题，并且激起对治疗和预后的新的和/或补充方式进行研究。

DCIS是一种恶性肿瘤的生物学异质形式，具有不同的临床表现、组织学特征、细胞特征和生物潜能。被归类为粉刺型(侵袭性)癌和非粉刺型(非侵袭性)癌，其中粉刺型是高级级别，具有可能更为侵袭性的亚型，在腺管腔内特征性地包含大的坏死区，细胞为明显的非典型细胞。预期大约2/3患有低级别到中等级别DCIS的患者罹患多病灶同侧疾病，不同病灶之间的间隔可达1cm(Cutuli等，2002)。高级别病灶往往连续的，间隔小于5mm(Cutuli等，2005)。

非侵袭性DCIS自然发展成为侵袭性乳腺肿瘤可能要花15-20年，累及14-60％的确诊女性(Burstein等，2004)。实际上，DCIS似乎代表了乳腺癌发展的某个阶段，其中界定侵袭性乳腺癌的许多分子事件已经存在(Cutuli等，2002；Holland等，1990)。准确地讲，如果不治疗，则约30％的低级别病灶将发展成侵袭性癌症(Sanders等，2005)。直径大于2.5cm的病灶常常伴发可能不超过0.1mm的隐匿性微小侵袭性肿瘤(microinvasive tumor)。肿瘤边缘的受累情况提供重要的预后标志。接近切缘(小于1mm)或阳性边缘、高级别和/或粉刺型坏死区与较大的复发风险有关。

像许多其它癌症一样，在乳腺癌中，新血管形成(血管生成)在局部肿瘤进展和远距离转移发展中起着主要作用(Boehm-Viswanathan，2000；Kieran等，2003)。发现与周围的正常组织相比，DCIS组织中的微血管密度(MVD)显著较高(Guidi等，1994；Guidi等，1997；Guinebretière等，1994)。具有最高血管密度的纤维囊性病灶与较大的乳腺癌风险有关(Guidi等，1994；Guidi等，1997；Guinebretière等，1994)。侵袭性DCIS病灶的组织病理学检查结果与MVD提高和血管内皮生长因子(VEGF)表达增加有关(Guidi等，1997；Schneider等，2005)。临床病理相关性也证实了血管生成在乳腺癌发展中的重要作用，使之成为DCIS疗法和预后的颇有吸引力的靶标(Folkman，1997；Krippl等，2003；Relf等，1997)。由套叠引起的血管共选择、生长(Patan等，1996)、血管拟态和血管发生是天然存在的过程，可降低肿瘤对典型血管生成的依赖。特别重要的是几乎完全依赖于血管发生的炎症性乳腺癌的研究结果，似乎是因为癌细胞无能力与内皮细胞结合。

DCIS对极致密血管床的极度依赖使抗血管生成(抑制新血管形成)和抗血管(现有血管的闭塞/破坏)疗法(Shimizu等，2005；Thorpe，2004)成为局部BC疗法的诱人选择(Schneider等，2005；Folkman，1996)。事实上，抗血管生成药物例如贝伐单抗(一种抗VEGF-A受体抗体)和SU011248(一种VEGF受体酪氨酸的抑制剂)正处于II期临床试验中。有趣的是，发现他莫昔芬也具有抗血管生成活性。然而，日趋增多的大量证据说明抗血管生成方法的不足。这些不足包括需要长期治疗、“抗性-抗性理论(resistance to resistance theory)”(Schneider等，2005；Streubel等，2004)和药代动力学抗性(pharmacokinetic resistance)的部分失效。根据这些障碍，抗血管方法目前似乎更有前景，预期不需要长期治疗就能根除整个肿瘤(Folkman，2004)。血管靶向治疗的一种有前景的新兴手段是通过光动力疗法(VTP)。

同样地，靶向顺磁金属(具有适度驰豫性(relaxivity))、发射正电子的化学实体(例如⁶⁴Cu)，或针对DCIS的致密血管床的荧光探针，将开启检测相关病灶、边缘界定和预后的新途径，正如下文中所述。研究表明乳腺癌病灶的荧光检测在至多10mm的深度是有效的(Britton，2006)。用Gd作为造影剂的动态MRI以肿瘤血管系统的渗漏增加为基础，目前用于乳腺肿瘤定位(Rankin，2000)。然而，目前使用的MRI受可用造影剂积分时间(integration time)短的限制，所述造影剂短暂停留但不被肿瘤组织选择性摄取。

光动力疗法(PDT)在选定的治疗部位产生突发的细胞毒性活性氧类(ROS)。由于其寿命短，ROS毒性局限于发光部位。PDT通常由5个步骤组成：1.静脉内(IV)给予光敏剂；2.使所需浓度的光敏剂到达靶组织的一段时间；3.用高强度激光(对于连续照射高达1W)通过用于深层组织照射的细(0.4mm以下直径)光导纤维经皮或经间质照射靶组织，由此局部产生细胞毒性的ROS；4.出现肿瘤坏死并根除肿瘤；

5.组织重塑和愈合。

血管靶向PDT(VTP)的目的在于在受治疗组织血管内产生ROS，这可通过在给予致敏物(sensitizer)后随即通过组织照射，或通过使用不会从循环中溢出的致敏物来完成。我们的实验室已开发出几代细菌叶绿素致敏物(本文称为“Bchl衍生物”或“BchlD”)。合成的化合物(Rosenbach-Belkin等，1996；US 5,650,292)，在能够使光深入穿透受治疗者组织的NIR(750-765nm)中具有非常强的吸收，确保了以高能流率(20mW-1W)在圆柱状纤维周围达4cm的治疗直径。在照射时，通过循环BchlD在肿瘤中和附近产生局部高浓度的ROS(OH-和O₂^-根)，导致在照射数分钟内血液凝固和肿瘤血管穿孔，随后肿瘤血管系统完全停滞。用一些Bchl衍生物，观察到内皮细胞直接中毒(Gross等，2003；Mazor等，2005)。究其原因还在研究之中，与周围正常组织的血管相比，肿瘤血管反应显著较快较激烈。治疗功效导致高的治愈率(60-90％动物存活)(Mazor等，2005)。重要的是，静脉内注射的致敏物很快从受治疗动物的循环中清除(T1/2约为数分钟至数小时，(Mazor等，2005))，避免了长期的皮肤毒性，并在需要时允许重复治疗。在患者的局限性前列腺癌的II期临床试验中，其中放射疗法失败(Weersink等，2005)，基于BchlD的VTP总的来讲导致50-60％受治疗患者中肿瘤病灶成功根除以及组织重塑。在动物模型和人的二次治疗(II/III期临床试验)中，每疗程似乎产生类似或较高的治愈率(取决于药物和光剂量)，在2-3疗程后，提高预期的总体成功率达约90％。重要的是，在使用较高剂量致敏物的动物研究中发现每个疗程都有显著较高的治愈率。

肿瘤的光动力疗法(PDT)包括给予光敏剂和局部光照射的组合，两者本身是无害组分，但是在分子氧存在下，它们能够产生可以消除细胞的细胞毒性活性氧类(ROS)。作为二元治疗方式，当与常用的化学疗法或放射疗法相比时，PDT允许较高的特异性，并且具有较高选择性而又并非毁灭性的潜力(Dougherty等，1998)。

近年来本发明的发明人(Zilberstein等，2001；Schreiber等，2002；Gross等，1997；Zilberstein等，1997；Rosenbach-Belkin等，1996；Gross等，2003a；Koudinova等，2003；Preise等，2003；Gross等，2003b)及在以下专利公布号中报导了在PDT中应用新的细菌叶绿素(Bchl)衍生物作为致敏物：US 5,726,169、US 5,650,292、US5,955,585、US 6,147,195、US 6,740,637、US 6,333,319、US6,569,846、US 7,045,117、DE 41 21 876、EP 1 24 6826、WO2004/045492、WO 2005/120573。Bchl衍生物的光谱、光物理学和光化学使之成为最佳集光分子，具有优于现用于PDT的其它致敏物的明显优势。这些Bchl衍生物大部分是极性的，并且在循环中停留非常短的时间，几乎不外渗到其它组织中(Brandis，2003；Mazor等，2005)。因此，这些化合物是血管靶向PDT(VTP)良好的候选分子(candidate)，这有赖于在血管内短时(5-10分钟)与光短暂相遇，并且有赖于肿瘤血管对PDT产生的细胞毒性ROS的较高敏感性。

由我们的研究小组进行的最新研究表明，最初的光敏作用是血管内快速发展成缺血性闭塞且在照射期间停滞。这个过程还促进光化学诱导的脂质过氧化作用(LPO)和主要局限于肿瘤血管系统的早期内皮细胞死亡(Koudinova等，2003)。由于自由基链反应的光独立性发展连同进行性低氧，LPO和细胞死亡扩展到血管区室以外以覆盖整个肿瘤间质组织，直到在PDT后24小时左右达到肿瘤完全坏死。因此，PDT的最初作用是阻断供血并诱导低氧，其以第二种方式引发以肿瘤根除告终的一系列分子和病理生理学事件。重要的是，该方法取决于正常血管和肿瘤血管对所产生的ROS的反应之间的差异。

相同申请人的国际申请号WO 2008/023378(通过引用其整体结合到本文中，如同全部公开于本文中一样)，公开了卟啉、叶绿素和细菌叶绿素(Bchl)衍生物与含有RGD基序的肽或与RGD肽模拟物的新缀合物及其在体内光动力疗法以及诊断肿瘤和不同血管疾病(例如年龄相关性黄斑变性)的方法中的用途。具体地讲，Bchl衍生物c(RGDfK)-Pd-MLT(化合物24)在原发瘤的异种移植物中蓄积高达4-8μM，并长时间保持在肿瘤部位，能够实现信号蓄积和良好的信噪比。

荧光标记法适于体内、新鲜组织和体外检测。c(RGDfK)-Pd-MLT在近红外(NIR)处具有能够检出的固有荧光。c(RGDfK)-2H-MLT具有高达3倍的发光能力，因此可以成为甚至更好的靶向成像的候选分子。在此项研究中，我们披露了这些分子开启了在人乳腺腺癌模型中精确检测肿瘤边缘和坏死的可能性。检测肿瘤边缘和坏死是迄今为止在肿瘤治疗中存在的两个最具有挑战性的问题。此外，两者是在治疗后肿瘤再生长的可靠预测物。因此，预期在未来临床应用时，前述RGD衍生物适用于在手术台上检测肿瘤和坏死。

发明概述

根据本发明的研究现已发现，与非坏死肿瘤区相比，上述WO2008/023378中披露的RGD-(细菌)叶绿素缀合物在坏死肿瘤区的归巢和蓄积长久得多。

因此，本发明涉及所述RGD-细菌叶绿素和RGD-叶绿素缀合物用于微创肿瘤靶向成像、肿瘤靶向光动力疗法和/或坏死肿瘤的在线预后(on-line prognosis)的用途及其方法。

附图简述

图1表示用于用红色荧光蛋白(RFP)转染肿瘤细胞系的质粒。1A：pDsRed2-N1质粒(Clontech，Palo Alto，CA)，1B：pDsRed-Monomer-Hyg-C1(Clontech，Palo Alto，CA)，1C：修饰pDsRed-Monomer-Hyg-C1。

图2A-2B表示在暴露3秒钟后用荧光显微镜(Nikon，放大倍数X10)检出的图1的转染细胞的荧光克隆。2A：MDA-MB-231RFP克隆1(G418抗性)。2B：MDA-MB-231RFP克隆3(潮霉素抗性)。

图3A-3B表示切离的肿瘤图像和MDA-MB-231-RFP肿瘤横截面的组织学分析(H&E染色)。3A：大肿瘤(约1cm³)。3B：小肿瘤(约0.5cm³)(ND-坏死区，VD-有活力区)。

图4A-4B表示下述化合物13在MDA-MB-231-RFP常位肿癌(orthotopic tumor)(肿瘤大小约1cm3)中的蓄积。给小鼠注射化合物13。药物注射后从15分钟到24小时拍摄图像。4A(上图)：红色荧光成像。4B(下图)：NIR荧光成像。

图5A-5B表示化合物13在MDA-MB-231-RFP常位肿瘤(肿瘤大小约1cm³)中的蓄积。给小鼠注射化合物13。药物注射后从第1天到第7天拍摄图像。5A(上图)：红色荧光成像。5B(下图)：NIR荧光成像。

图6A-6B表示化合物13在MDA-MB-231-RFP常位肿瘤(肿瘤大小约0.5cm³)中的蓄积。给小鼠注射化合物13。药物注射后从20分钟到24小时拍摄图像。6A(上图)：红色荧光成像。6B(下图)：NIR荧光成像。

图7A-7B表示化合物13在MDA-MB-231-RFP常位肿瘤(肿瘤大小约0.5cm³)中的蓄积。给小鼠注射化合物13。药物注射后从第1天到第3天拍摄图像。7A(上图)：红色荧光成像。7B(下图)：NIR荧光成像。

图8是表示与旁侧(collateral side)相比肿瘤中化合物13荧光信号测量值的曲线图。在9只动物的肿瘤和旁侧测量了荧光信号，单位为光子/秒/cm²。化合物13注射后从15分钟到216小时采集结果。提供了每个时间点上全部动物的平均结果以及肿瘤和旁侧之间的荧光比。

图9A-9B表示化合物24在MDA-MB-231-RFP常位肿瘤(肿瘤大小约1cm³)中的蓄积。给小鼠注射化合物24。药物注射后从1小时到24小时拍摄图像。9A(上图)：红色荧光成像。9B(下图)：NIR荧光成像。

图10A-10B表示化合物24在MDA-MB-231-RFP常位肿瘤(肿瘤大小约1cm³)中的蓄积。给小鼠注射化合物24，药物注射后从第1天到第7天拍摄图像。10A(上图)：红色荧光成像。10B(下图)：NIR荧光成像。

图11A-11B表示化合物24在MDA-MB-231-RFP常位肿瘤(肿瘤大小约0.5cm³)中的蓄积。给小鼠注射化合物24，药物注射后从20分钟到24小时拍摄图像。11A(上图)：红色荧光成像。11B(下图)：NIR荧光成像。

图12A-12B表示化合物24在MDA-MB-231-RFP常位肿瘤(肿瘤大小约0.5cm³)中的蓄积。给小鼠注射化合物24，药物注射后从第1天到第2天拍摄图像。12A(上图)：红色荧光成像。12B(下图)：NIR荧光成像。

图13A-13B表示化合物13在MLS-mBanana常位肿瘤(肿瘤大小约1cm³)中的蓄积。给小鼠注射化合物13。药物注射后从1小时至24小时拍摄图像。13A(上图)：红色荧光成像。13B(下图)：NIR荧光成像。

图14A-15B表示化合物13在MLS-mBanana常位肿瘤(肿瘤大小约1cm³)中的蓄积。给小鼠注射化合物13。药物注射后从第1天到第4天拍摄图像。14A(上图)：红色荧光成像。14B(下图)：NIR荧光成像。

图15A-15B表示化合物13在MLS-mBanana常位肿瘤(肿瘤大小约0.5cm³)中的蓄积。给小鼠注射化合物13。药物注射后从10分钟到24小时拍摄图像。15A(上图)：红色荧光成像。15B(下图)：NIR荧光成像。

图16A-16B表示化合物13在MLS-mBanana常位肿瘤(肿瘤大小约0.5cm³)中的蓄积。给小鼠注射化合物13。药物注射后从第1天到第4天拍摄图像。16A(上图)：红色荧光成像。16B(下图)：NIR荧光成像。

图17A-17B表示化合物13在人卵巢MLS-mBanana原发坏死肿瘤和无坏死肿瘤中蓄积的比较。化合物13注射后2天拍摄图像。拍摄化合物13的体内整体NIR荧光的图像。17A：无坏死肿瘤(约0.5cm³)。17B：坏死肿瘤(约1cm³)。

图18A-18B表示化合物25在MDA-MB-231-RFP常位肿瘤(肿瘤大小约1cm³)中的蓄积。给小鼠注射化合物25，药物注射后从5分钟到24小时拍摄图像。18A(上图)：红色荧光成像。18B(下图)：NIR荧光成像。

图19A-19B表示化合物25在MDA-MB-231-RFP常位肿瘤(肿瘤大小约1cm³)中的蓄积。给小鼠注射化合物25，药物注射后从第1天到第3天拍摄图像。19A(上图)：红色荧光成像。19B(下图)：NIR荧光成像。

图20A-20B表示化合物25在MDA-MB-231-RFP常位无坏死肿瘤(肿瘤大小约0.5cm³)中的蓄积。给小鼠注射化合物25，药物注射后从10分钟到24小时拍摄图像。20A(上图)：红色荧光成像。20B(下图)：NIR荧光成像。

图21A-21B表示化合物25在MDA-MB-231-RFP常位无坏死肿瘤(肿瘤大小约0.5cm³)中的蓄积。给小鼠注射化合物25，药物注射后从第1天到第3天拍摄图像。21A(上图)：红色荧光成像。21B(下图)：NIR荧光成像。

图22A-22D表示当在给予游离c(RGDfK)后1小时给予时，化合物13在常位人乳腺MDA-MB-231-RFP原发瘤(肿瘤大小约0.5cm³)中蓄积的竞争测定法。在给予化合物13后24小时拍摄图像。22A、22B-红色荧光成像；22C、22D-NIR荧光成像。22A、22C：在给予游离c(RGDfK)后1小时给予化合物13(竞争)。22B、22D：对照，只给予化合物13。

图23A-23F表示药物注射后10分钟测定的在MDA-MB-231-RFP常位肿瘤的活力区对比坏死区中化合物13的蓄积。23A、23B和23C(上图)，分别是整个动物的体内整体照片、红色荧光图像和NIR荧光图像；23D、23E和23F(下图)，分别是切离肿瘤(将肿瘤切成两半)(ND-坏死区，VD-有活力区)的照片、红色荧光图像和NIR荧光图像。

图24A-24F表示药物注射后1小时测定的在MDA-MB-231-RFP常位肿瘤的活力区对比坏死区中化合物13的蓄积。图24A、24B、24C(上图)和24D、24E、24F(下图)分别如上述图23A、23B、23C和23D、23E、23F中所述。

图25A-25F表示药物注射后4小时测定的在MDA-MB-231-RFP常位肿瘤的活力区对比坏死区中化合物13的蓄积。图25A、25B、25C(上图)和25D、25E、25F(下图)分别如上述图23A、23B、23C和23D、23E、23F中所述。

图26A-26F表示药物注射后24小时测定的在MDA-MB-231-RFP常位肿瘤的活力区对比坏死区中药物化合物13的蓄积。图26A、26B、26C(上图)和26D、26E、26F(下图)分别如上述图23A、23B、23C和23D、23E、23F中所述。

图27A-27F表示药物注射后3天测定的在MDA-MB-231-RFP常位肿瘤的活力区对比坏死区中化合物13的蓄积。图27A、27B、27C(上图)和27D、27E、27F(下图)分别如上述图23A、23B、23C和23D、23E、23F中所述。

图28A-28F表示药物注射后5天测定的在MDA-MB-231-RFP常位肿瘤的活力区比对坏死区中化合物13的蓄积。图28A、28B、28C(上图)和28D、28E、28F(下图)分别如上述图23A、23B、23C和23D、23E、23F中所述。

图29A-29F表示药物注射后7天测定的在MDA-MB-231-RFP常位肿瘤的活力区对比坏死区中化合物13的蓄积。图29A、29B、29C(上图)和29D、29E、29F(下图))分别如上述图23A、23B、23C和23D、23E、23F中所述。

图30A-30F表示药物注射后9天测定的在MDA-MB-231-RFP常位肿瘤的活力区对比坏死区中化合物24的蓄积。图30A、30B、30C(上图)和30D、30E、30F(下图)分别如上述图23A、23B、23C和23D、23E、23F中所述。

图31A-31F表示注射后7天测定的在中心性坏死的MLS-mBanana肿瘤中化合物13的蓄积。图31A、32B、33C(上图)和34D、35E、36F(下图))分别如上述图23A、23B、23C和23D、23E、23F中所述。

图32A-32F表示药物注射后7天测定的在MLS-mBanana肿瘤的非中心性坏死中化合物13的蓄积。图30A、30B、30C(上图)和30D、30E、30F(下图)分别如上述图23A、23B、23C和23D、23E、23F中所述。

图33A-33D表示切离肿瘤图像和MDA-MB-231-RFP肿瘤横截面的组织学分析(H&E染色)。33A：肿瘤横切片表面照片(肉眼可见外观)。33B：横切片表面的组织学图像(显微镜可见外观)。33C：33B中被圈区域的中等放大倍数图(medium power view)。33D：坏死和有活力组织间界面区域的高放大倍数图(high power view)。

图34A-34B表示人MDA-MB-231-RFP对PDT的局部反应的代表性实例。在具有MDA-MB-231-RFP异种移植物(约0.5cm³)的小鼠背部经静脉内注射7.5mg/kg化合物13，8小时后透过皮肤照射。34A：从第0天(治疗前)和治疗后1、4、7、12和90天拍摄的照片。34B：体内整体红色荧光成像。

实施本发明的方式

本发明的主要目的是提供将致敏物特别靶向坏死肿瘤的坏死区的光敏剂缀合物。肿瘤靶向光动力疗法(PDT)具有一些优于用常规化学疗法靶向肿瘤的优势。第一，在常规被靶向药物蓄积期间，它常常是有活性的，除非它是前药，而被靶向光敏剂直到局部照射后才有活性。第二，常规被靶向药物可结合并同样作用于归巢地址存在的不需要的靶标，而靶向光敏剂只在相关照射部位被激活。

因此，从大的方面来看，本发明涉及含RGD的肽或RGD肽模拟物与叶绿素或细菌叶绿素光敏剂的缀合物在微创肿瘤靶向成像、肿瘤靶向PDT和/或坏死肿瘤的在线预后中的用途。

术语“含RGD的肽”或“RGD肽”在本文中可互换使用，是指含有Arg-Gly-Asp(RGD)序列的肽，亦称为RGD基序。本文使用的术语“RGD肽模拟物”是指模拟肽并具有RGD基序的化合物，特别是非肽化合物。

已知RGD肽与细胞的整联蛋白受体相互作用，具有启动细胞信号转导过程的潜力并影响多种疾病。出于这些原因，整联蛋白RGD结合部位被视为颇有吸引力的药物靶标。

含RGD的肽可为线性肽或环肽，由4-100个、优选5-50个、5-30个、5-20个或者更优选5-10个氨基酸残基组成。在一个优选的实施方案中，RGD肽由4、5、6、7、9或25个、最优选由5个氨基酸残基组成。

本文所使用的术语“氨基酸”包括20种天然存在的氨基酸以及非天然氨基酸。

适用于本发明的天然氨基酸的实例包括但不限于Ala、Arg、Asp、Asn、Cys、His、Gln、Glu、Gly、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val。

非天然氨基酸的实例包括但不限于4-氨基丁酸(Abu)、2-氨基己二酸、二氨基丙(Dap)酸、羟赖氨酸、高丝氨酸、高缬氨酸、高亮氨酸、正亮氨酸(Nle)、正缬氨酸(Nva)、鸟氨酸(Om)、TIC、萘丙氨酸(Nal)、Phe的环-甲基化衍生物、Phe的卤化衍生物或邻甲基-Tyr。

本文中的术语“氨基酸”还包括修饰氨基酸例如发生在体内翻译后的修饰，例如羟脯氨酸、磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸；D-修饰；氨基端基团或Lys的游离氨基的酰化或烷基化、优选甲基化；羧端基团或者Asp或Glu的游离羧基的酯化或酰胺化；以及Ser或Tyr的羟基的酯化或醚化。

术语“氨基酸”包括D-氨基酸和L-氨基酸两者。因此，用于本发明缀合物的肽可以是全D-氨基酸(甘氨酸除外)、全L-氨基酸或L，D-氨基酸。为了防止肽被生物体中的酶切割，氨基酸的D-修饰和肽键的N-烷基化是最有利的。在本发明中，D-氨基酸用小写字母表示，如本文使用的SEQ ID NO：1的肽环RGDfK中的D-苯丙氨酸‘f’残基。

本发明还包括环肽。肽可以通过多种方法环化，例如形成二硫化物、硫化物，尤其在N端和C端或氨基酸侧链的羧基和氨基官能团之间形成内酰胺。环化可通过本领域已知的任何方法获得，例如通过酰胺键形成，例如通过在链中的各个位置(-CO-NH或-NH-CO键)上掺入Glu、Asp、Lys、Om、二氨基丁(Dab)酸、二氨基丙(Dap)酸。主链-主链间的环化还可以通过掺入式H-N((CH₂)_n-COOH)-C(R)H-COOH或H-N((CH₂)_n-NH₂)-C(R)H-COOH的修饰氨基酸来获得，其中n＝1-4，且其中R是氨基酸的任何天然或非天然的侧链。

环化还可通过掺入两个Cys残基经形成S-S键而获得。另外的侧链-侧链间环化可通过形成式-(CH₂)_n-S-CH₂-CO-的相互作用键而获得，其中n＝1或2，这是可行的，例如通过加入Cys或高Cys以及其游离SH基团与例如溴乙酰化Lys、Om、Dab或Dap反应。

在一些实施方案中，RGD肽可以是US 6,576,239、EP 0927045和WO 2008/023378中所披露的肽，通过引用其整体结合到本文中，如同全部公开于本文一样。

在一个优选的实施方案中，按照本发明使用的肽是SEQ ID NO：1的环戊肽RGDfK，其中‘f’表示D-Phe残基。

在另一个优选的实施方案中，肽是本文用来提高RGD基序在结合整联蛋白受体中的重要性的SEQ ID NO：2的环戊肽RADfK。本发明又一个有用的环肽是SEQ ID NO：9的九肽CDCRGDCGC，本文称为‘RGD-4C’，其含有4个半胱氨酸残基，在分子中形成两个二硫键。

RGD基序的天冬氨酸残基非常易被化学降解，导致丧失生物活性，而这种降解可通过二硫键经环化来防止。在稳定性提高的同时，与线性肽相比，环肽在抑制玻连蛋白对细胞的附着方面具有较高能力。合成肽中RGD序列两侧残基的数目和性质对该序列如何被各整联蛋白受体识别具有重大影响。芳族残基可能在使整联蛋白的结合部位有利于接触方面特别重要。靶向αvβ₃的环状RGD肽被不依赖于液相胞吞途径的整联蛋白内化，所述途径不改变细胞表面功能整联蛋白受体的数目。此外，环状RGD肽在溶酶体中于15分钟后达到饱和的过程中保持或降解，只有少部分可离开溶酶体并达到细胞胞质。

在其它优选的实施方案中，RGD肽选自以下环肽：(i)四肽环RGDK(SEQ ID NO：3)、五肽环RGDf-n(Me)K(SEQ ID NO：4)，其中f表示D-Phe，f和K之间的肽键是甲基化的；以及五肽环RGDyK(SEQID NO：5)，其中y表示D-Tyr。

在另一个实施方案中，含RGD的肽是线性的，可选自六肽GRGDSP(SEQ ID NO：6)、七肽GRGDSPK(SEQ ID NO：7)和25聚物(GRGDSP)4K(SEQ ID NO：8)。在一个更优选的实施方案中，线性肽是GRGDSP。

在本发明的一个实施方案中，RGD肽通过其外围的官能团(例如COOH)与光敏剂叶绿素或细菌叶绿素大环直接连接，与RGD肽的氨基末端基团或游离氨基形成酰胺CO-NH₂基团。

在另一个实施方案中，RGD肽通过间隔臂/桥连基与光敏剂大环连接，间隔臂/桥连基例如但不限于被末端官能团例如OH、COOH、SO₃H、COSH或NH₂取代的C₁-C₂₅亚烃基(hydrocarbylene)、优选C₁-C₁₀亚烷基或亚苯基，因此形成醚、酯、酰胺、硫代酰胺或磺酰胺基团。

在一些实施方案中，光敏剂与RGd肽模拟物缀合。

在一个优选的实施方案中，RGD肽模拟物是包含被11个原子的链间隔开来的胍和羧基端基的非肽化合物，至少5个所述原子为碳原子，且所述链包含一个或多个O、S或N原子并且可被以下基团任选取代：氧代、硫代、卤素、氨基、C₁-C₆烷基、羟基或羧基，或者所述链的一个或多个原子可形成3-6元碳环或杂环。该类型的化合物参见相同申请人的WO 93/09795和WO 2008/023378，通过引用其整体结合到本文中，如同全部公开于本文中一样。

在一个优选的实施方案中，上述RGD肽模拟物在链中包含N原子并且被氧代基团取代。在一个更优选的实施方案中，RGD肽模拟物具有下式：

H₂N-C(＝NH)NH-(CH₂)₅-CO-NH-CH(CH₂)-(CH₂)₂-COOH或-NH-RGD-CO-NH-(CH₂)₂-哌嗪子基-(CH₂)₂-NH-。

用于本发明的光敏剂是叶绿素或细菌叶绿素衍生物，其可以是天然的叶绿素或细菌叶绿素或者叶绿素或细菌叶绿素的合成的非天然衍生物，包括这样化合物，其中在大环中和/或在外围经过修饰，和/或中心Mg原子可不存在或被适用于诊断目的和/或PDT目的的其它金属原子置换。

在一个优选的实施方案中，本发明涉及其中光敏剂为式I、式II或式III的叶绿素或细菌叶绿素的缀合物及其药学上可接受的盐和旋光异构体：

其中

M表示2H或选自以下的原子：Mg、Pd、Pt、Co、Ni、Sn、Cu、Zn、Mn、In、Eu、Fe、Au、Al、Gd、Dy、Er、Yb、Lu、Ga、Y、Rh、Ru、Si、Ge、Cr、Mo、P、Re、Tl和Tc及其同位素和放射性同位素；

X为O或N-R₇；

R₁、R’₂和R₆各自独立地为Y-R₈、-NR₉R’₉或-N⁺R₉R’₉R”₉A^-；

或者式II中的R₁和R₆与它们所连接的碳原子一起形成包含RGD肽或RGD肽模拟物的环；

Y为O或S；

R₂为H、OH或COOR₉；

R₃为H、OH、C₁-C₁₂烷基或C₁-C₁₂烷氧基；

R₄为-CH＝CR₉R’₉、-CH＝CR₉Hal、-CH＝CH-CH₂-NR₉R’₉、-CH＝CH-CH₂-N⁺R₉R’₉R”₉A^-、-CHO、-CH＝NR₉、-CH＝N⁺R₉R’₉A^-、-CH₂-OR₉、-CH₂-SR₉、-CH₂-Hal、-CH₂-R₉、-CH₂-NR₉R’₉、-CH₂-N⁺R₉R’₉R”₉A^-、-CH₂-CH₂R₉、-CH₂-CH₂Hal、-CH₂-CH₂OR₉、-CH₂-CH₂SR₉、-CH₂-CH₂-NR₉R’₉、-CH₂-CH₂-N⁺R₉R’₉R”₉A^-、-COCH₃、C(CH₃)＝CR₉R’₉、-C(CH₃)＝CR₉Hal、-C(CH₃)＝NR₉、-CH(CH₃)＝N⁺R₉R’₉A-、-CH(CH₃)-Hal、-CH(CH₃)-OR₉、-CH(CH₃)-SR₉、-CH(CH₃)-NR₉R’₉、-CH(CH₃)-N⁺R₉R’₉R’₉A^-或-C≡CR₉；

R’₄为甲基或甲酰基；

R₅为＝O、＝S、＝N-R₉、＝N⁺R₉R’₉A^-、＝CR₉R’₉或＝CR₉-Hal；

R₇、R₈、R₉、R’₉和R”₉各自独立地为：

(a)H；

(b)C₁-C₂₅烃基；

(c)C₁-C₂₅烃基、优选C₁-C₂₅烷基、烯基或炔基、更优选C₁-C₁₀或C₁-C₆烷基，其被一个或多个选自以下的官能团取代：卤素、硝基、氧代、OR、SR、桥氧基(epoxy)、桥硫基(epithio)、-CONRR’、-COR、COOR、-OSO₃R、-SO₃R、-SO₂R、-NHSO₂R、-SO₂NRR’-NRR’、＝N-OR、＝N-NRR’、-C(＝NR)-NRR’、-NR-NRR’、-(R)N-C(＝NR)-NRR’、O←NR-、＞C＝NR、-(CH₂)_n-NR-COR’、-(CH₂)_n-CO-NRR’、-O-(CH₂)_n-OR、-O-(CH₂)_n-O-(CH₂)_n-R、-PRR’、-OPO₃RR’、-PO₂HR和-PO₃RR’，其中R和R’各自独立地为H、烃基或杂环基，R”为烃基或杂环基；

(d)C₁-C₂₅烃基、优选C₁-C₂₅烷基、更优选C₁-C₁₀或C₁-C₆烷基，其被一个或多个选自以下的官能团取代：带正电荷的基团、带负电荷的基团、在生理条件下转化成带正电荷的基团的碱性基团和在生理条件下转化成带负电荷的基团的酸性基团；

(e)C₁-C₂₅烃基、优选C₁-C₂₅烷基、更优选C₁-C₁₀或C₁-C₆烷基，其含有一个或多个杂原子和/或一个或多个碳环或杂环部分；

(f)C₁-C₂₅烃基、优选C₁-C₂₅烷基、更优选C₁-C₁₀或C₁-C₆烷基，其含有一个或多个杂原子和/或一个或多个碳环或杂环部分且被上述(c)和(d)中定义的一个或多个官能团取代；

(g)C₁-C₂₅烃基、优选C₁-C₂₅烷基、更优选C₁-C₁₀或C₁-C₆烷基，其被氨基酸、肽、优选RGD肽、蛋白质、单糖、寡糖、多糖的残基或多齿配体及其与金属的螯合物取代；或者

(h)氨基酸、肽(优选RGD肽或RGD肽模拟物)、蛋白质、单糖、寡糖、多糖的残基或多齿配体及其与金属的螯合物；

R₇还可为-NRR’，其中R和R’各自为H或C₁-C₂₅烃基、优选C₁-C₂₅烷基、更优选C₁-C₁₀或C₁-C₆烷基，其被带负电荷的基团优选SO₃^-任选取代；

当R₁、R’₂和R₆各自独立地为Y-R₈时，R₈还可为H⁺或阳离子R⁺₁₀；

R⁺₁₀为金属、铵基团(ammonium group)或有机阳离子；

A^-为生理上可接受的阴离子；

m为0或1；

在7-8位上的虚线表示任选的双键；

且式I、式II或式III的所述叶绿素或细菌叶绿素衍生物含有至少一个含RGD的肽残基。

在一个实施方案中，在7-8位上的虚线表示双键，光敏剂是式I、式II或式III的叶绿素。式I化合物分别为叶绿素a和b，其中M为Mg，在17³位上的R₁为植基氧基，在13²位上的R₂为COOCH₃，在13²位上的R₃为H原子，R₅为O，在3位上的R₄为乙烯基，在7-8位上的虚线表示双键，或者在7位上的R’₄为甲基且在8位上的R₄为乙基，或者在7位上的R’₄为甲酰基且在8位上的R₄为乙基，叶绿素a和b的衍生物可具有不同的金属原子和/或不同的取代基R₁、R₂、R₃、R₄、R’₄和/或R₅。

在另一个实施方案中，7-8位是氢化的，光敏剂为式I、式II或式III的细菌叶绿素。式I化合物为细菌叶绿素a，其中M为Mg，17³位上的R₁为植基氧基或牻牛儿基牻牛儿基氧基，在13²位上的R₂为COOCH₃，在13²位上的R₃为H原子，R₅为O，R₄在3位上为乙酰基且在8位上为乙基，在7-8位上的虚线不存在，且细菌叶绿素a的衍生物可具有不同的金属原子和/或不同的取代基R₁、R₂、R₃、R₄和/或R₅。

本文所使用的术语“烃基”是指任何直链或支链、饱和或不饱和、无环或环状(包括芳族)烃基原子团，其具有1-25个碳原子、优选1-20个、更优选1-6个、最优选2-3个碳原子。烃基可为烷基，优选1-4个碳原子，例如甲基、乙基、丙基、丁基；或烯基、炔基、环烷基、芳基(例如苯基)或芳烷基(例如苄基)，或者在式I、式II或式III化合物的17位，它是衍生自天然Chl和Bchl化合物的原子团，例如牻牛儿基牻牛儿基(2，6-二甲基-2，6-辛二烯基)或植基(2，6，10，14-四甲基-十六碳-14-烯-16-基)。

本文所使用的术语“碳环部分”是指在环中只含碳原子的单环或多环化合物。碳环部分可以是饱和的(即环烷基)，或不饱和的(即环烯基)，或芳族的(即芳基)。

本文使用的术语“烷氧基”是指基团(C₁-C₂₅)烷基-O-，其中C₁-C₂₅烷基如上定义。烷氧基的实例为甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、己氧基、-OC₁₅H₃₁、-OC₁₆H₃₃、-OC₁₇H₃₅、-OC₁₈H₃₇等。本文使用的术语“芳氧基”是指基团(C₆-C₁₈)芳基-O-，其中C₆-C₁₈芳基如上定义，例如苯氧基和萘氧基。

本文使用的术语“杂芳基”或“杂环部分”或“杂芳族基”或“杂环基”是指衍生自含有1-3个选自O、S和N的杂原子的单环或多环杂芳族环的原子团。具体实例为吡咯基、呋喃基、噻吩基、吡唑基、咪唑基、唑基、噻唑基、吡啶基、喹啉基、嘧啶基、1，3，4-三嗪基、1，2，3-三嗪基、1，3，5-三嗪基、苯并呋喃基、异苯并呋喃基、吲哚基、咪唑并[1，2-a]吡啶基、苯并咪唑基、苯并噻唑基和苯并唑基。

任何“碳环”、“芳基”或“杂芳基”可被以下一个或多个原子团取代：例如卤素、C₆-C₁₄芳基、C₁-C₂₅烷基、硝基、OR、SR、-COR、-COOR、-SO₃R、-SO₂R、-NHSO₂R、-NRR’、-(CH₂)_n-NR-COR’和-(CH₂)_n-CO-NRR’。要理解的是，当多环杂芳族环被取代时，取代基可在任何碳环和/或杂环中。

本文使用的术语“卤素”是指氟、氯、溴或碘。

在本发明的一个实施方案中，缀合物中的光敏剂是式I、式II或式III的叶绿素或细菌叶绿素，其含有至少一个带负电荷的基团和/或至少一个在生理pH下转化成带负电荷的基团的酸性基团。

本文中定义的“带负电荷的基团”是衍生自酸的阴离子，包括羧酸根(COO^-)、硫代羧酸根(COS^-)、磺酸根(SO₃^-)和磷酸根(PO₃^2-)，“在生理条件下转化成带负电荷的基团的酸性基团”包括羧酸基(-COOH)、硫代羧酸基(-COSH)、磺酸基(-SO₃H)和磷(-PO₃H₂)酸基。具有在生理条件下转化成一个或多个带负电荷的基团的BChl衍生物参见相同申请人的WO 2004/045492，通过引用其整体结合到本文中，如同全部公开于本文一样。

在一个更优选的实施方案中，本发明缀合物中的光敏剂是式II的叶绿素或细菌叶绿素，其中R₆为-NR₉R’₉，R₉为H，R’₉为被SO₃H或其碱性盐取代的C₁-C₁₀烷基。缀合物最优选包含式II的细菌叶绿素衍生物，其中R₆为-NH-(CH₂)₂-SO₃K或-NH-(CH₂)₃-SO₃K。

在本发明的另一个实施方案中，缀合物中的光敏剂是式I、式II或式III的叶绿素或细菌叶绿素，其含有至少一个带正电荷的基团和/或至少一个在生理pH下转化为带正电荷的基团的碱性基团。

本文中定义的“带正电荷的基团”是指衍生自含N基团或不含N的基团的阳离子。由于肿瘤内皮的特征在于阴离子部位的数目增多，因此带正电荷的基团或在生理条件下转化成带正电荷的基团的碱性基团可提高本发明缀合物的靶向效率。

本文使用的“衍生自含N基团的阳离子”是指例如但不限于铵-N⁺(RR’R”)、肼-(R)N-N⁺(R’R”)、铵氧基(ammoniumoxy)O←N⁺(RR’)-、亚胺(iminium)＞C＝N⁺(RR’)、脒(amidinium)-C(＝RN)-N⁺R’R”或胍-(R)N-C(＝NR)-N⁺R’R”基团，其中R、R’和R”各自独立地为H、烃基、优选如本文中定义的C₁-C₆烷基、苯基或苄基、或杂环基，或者在铵基团中，R、R’和R”中的一个可为OH，或者铵基团中R、R’和R”中的两个，或者肼铵氧基、亚胺脒或胍基团中的R和R’，与它们所连接的N原子一起形成3-7元饱和环，其任选含有一个或多个选自O、S或N的杂原子且任选在另外的N原子上被进一步取代，或者所述阳离子衍生自杂芳族环中含有一个或多个N原子的化合物。

在一个更优选的实施方案中，本发明的缀合物含有式-N⁺(RR’R”)的铵基团，其中R、R’和R”各自独立地为H或任选取代的如本文中定义的烃基或杂环基，或者其中之一可为OH。-N⁺(RR’R”)铵基团可为仲铵(secondary ammonium)，其中原子团R、R’或R”中的任两个为H；叔铵，其中R、R’或R”中仅一个为H；或季铵，其中R、R’或R”中的每一个为任选取代的如本文中定义的烃基或杂环基。当R、R’或R”中的一个为OH时，该基团为羟基铵基团。优选铵基团为季铵基团，其中R、R’和R”各自为C₁-C₆烷基，例如甲基、乙基、丙基、丁基、己基。铵基团在分子中可为端基，或者它可存在于分子的烷基链中。

在肼-(R)N-N⁺(R’R”)、脒-C(＝NR)-N⁺R’R”和胍-(R)N-C(＝NR)-N⁺R’R”基团中，R、R’和R”各自可独立地为H或烃基或杂环基，或者R’和R”与它们所连接的N原子一起形成如本文定义的3-7元饱和环。这类基团的实例包括其中R为H，R’和R”各自为C₁-C₆烷基(例如甲基、乙基、丙基、丁基、己基)的基团。

在铵氧基O←N⁺(RR’)-和亚胺＞C＝N⁺(RR’)基团中，R和R’各自可独立地为H或烃基、优选C₁-C₆烷基、或杂环基，或者R和R’与它们所连接的N原子一起形成如本文定义的3-7元饱和环。

在另一个优选的实施方案中，叶绿素或细菌叶绿素衍生物含有式-N⁺(RR’R”)的环状铵基团，其中R、R’和R”中的两个与N原子一起形成下文中定义的3-7元饱和环。

本文中定义的由R、R’和R”中的两个与它们所连接的N原子一起形成的“3-7元饱和环”可以是只含N的环，例如氮杂环丙烷、吡咯烷、哌啶、哌嗪或氮杂或者它可含有选自O和S的其它杂原子，例如吗啉或硫代吗啉。哌嗪环中另外的N原子可被烷基(例如C₁-C₆烷基)任选取代，该烷基可被卤素、OH或氨基取代。衍生自所述饱和环的基团包括丫丙啶吡咯烷哌啶哌嗪吗啉硫代吗啉和氮杂

如本文定义的“衍生自含N杂芳族原子团的阳离子”是指衍生自N-杂芳族化合物的阳离子，其可为任选含有O、S或额外N原子的单环或多环化合物。阳离子衍生自其中的环应含有至少一个N原子并且为芳族，但是其它环(如有的话)，可以是部分饱和的。N-杂芳族阳离子的实例包括吡唑咪唑唑噻唑吡啶嘧啶喹啉异喹啉1，2，4-三嗪1，3，5-三嗪和嘌呤

带正电荷的基团还可以是基团但不含氮，例如但不限于[-P⁺(RR’R”)]、[-As⁺(RR’R”)]、氧[-O⁺(RR’)]、锍[-S⁺(RR’)]、硒[-Se⁺(RR’)]、碲[-Te⁺(RR’)]、锑[-Sb⁺(RR’R”)]或铋[-Bi⁺(RR’R”)]基团，其中R、R’和R”各自独立地为H、烃基或杂环基，优选C₁-C₆烷基(例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基或己基)，或芳基，优选苯基。

式-P⁺(RR’R”)基团的实例包括其中R、R’和R”各自为甲基、乙基、丙基、丁基或苯基，或者R为甲基、乙基、丙基、丁基或己基以及R’和R”均为苯基的基团。式-As⁺(RR’R”)钟基团的实例包括其中R、R’和R”各自为甲基、乙基、丙基、丁基或苯基的基团。式-S⁺(RR’)锍基团的实例包括其中R和R’各自为甲基、乙基、丙基、丁基、苯基、苄基、苯乙基、或取代烃基的基团。

本文中定义的“在生理条件下转化为带正电荷的基团的碱性基团”从理论上讲至少是在生理条件下可产生如本文定义的带正电荷的基团的任何碱性基团。应当注意的是，本文使用的生理条件不仅仅是指血清，而且还是指机体内不同的组织和细胞区室。

这类含N碱性基团的实例包括而不限于可产生铵基团的任何氨基、可产生亚胺基团的任何亚胺基团、可产生肼基团的任何肼基团、可产生铵氧基基团的任何氨基氧基(aminoxy)、可产生脒基团的任何脒基团、可以产生胍基团的任何胍基团，所有基团如本文中定义。其它实例包括膦基和巯基。

因此，本发明的缀合物可含有至少一个在生理条件下转变为带正电荷的基团的碱性基团，例如-NRR’、-C(＝NR)-NR’R”、-NR-NR’R”、-(R)N-C(＝NR)-NR’R”、O←NR-或＞C＝NR，其中R、R’和R”中的每一个独立地为H、烃基，优选C₁-C₂₅烷基，更优选C₁-C₁₀或C₁-C₆烷基，或杂环基，或者R、R’和R”中的两个与N原子一起形成3-7元饱和环，其任选含有O、S或N原子且任选在另外的N原子上被进一步取代，或者碱性基团为含N杂芳族原子团。

3-7元饱和环可以是氮杂环丙烷、吡咯烷、哌啶、吗啉、硫代吗啉、氮杂或哌嗪，其在额外N原子上被C₁-C₆烷基任选取代，该烷基被卤素、羟基或氨基任选取代，且含N杂芳族原子团可以是吡唑基、咪唑基、唑基、噻唑基、吡啶基、喹啉基、异喹啉基、嘧啶基、1，2，4-三嗪基、1，3，5-三嗪基或嘌呤基。

具有带正电荷的基团或在生理条件下向其转变的基团的BChl衍生物参见相同申请人的WO 2005/120573，通过引用其整体结合到本文中，如同全部公开于本文一样。

在一个实施方案中，光敏剂为式II的叶绿素或细菌叶绿素，且R₆为碱性基团-NR₉R’₉，其中R₉为H，R’₉为被碱性基团-NRR’或-NH-(CH₂)_2-6-NRR’取代的C₁-C₆烷基，其中R和R’各自独立地为H、被NH₂任选取代的C₁-C₆烷基或者R和R’与N原子一起形成5-6元饱和环，其任选含有O或N原子且在另外的N原子上任选被-(CH₂)_2-6-NH₂进一步取代。

在另一个实施方案中，光敏剂为式II的细菌叶绿素，且R₆为-NH-(CH₂)₃-NH-(CH₂)₃-NH₂、-NH-(CH₂)₂-1-吗啉代或-NH-(CH₂)₃-哌嗪子基-(CH₂)₃-NH₂。

在一个进一步的实施方案中，R₁和R₆一起形成包含RGD肽或RGD肽模拟物的环。

在另一个实施方案中，光敏剂为式III的叶绿素或细菌叶绿素，且X为-NR₇，R₇为-NRR’，R为H，R’为被SO₃-或其碱性盐取代的C₁-C₆烷基，光敏剂优选为细菌叶绿素，且X为-NR₇，R₇为-NH-(CH₂)₃-SO₃K。

在另一个实施方案中，R₇、R₈、R₉或R’₉各自为被一个或多个-OH基团取代的C₁-C₆烷基。例如，光敏剂为式II的叶绿素或细菌叶绿素且R₆为-NR₉R’₉，R₉为H，R’₉为HOCH₂-CH(OH)-CH₂-。

在另一个实施方案中，光敏剂为式II的叶素或细菌叶绿素，且R₆为-NR₉R’₉，R₉为H，R’₉为被多齿配体或其与金属的螯合物取代C₁-C₆烷基。多齿配体的实例包括而不限于EDTA(乙二胺四乙酸)、DTPA(二亚乙基三胺五乙酸)或大环配体DOTA。在一个优选的实施方案中，多齿配体为DTPA，R₆为-NH-(CH₂)₃-NH-DTPA，金属为Gd。

阳离子R₈⁺可以是衍生自碱金属或碱土金属的一价或二价阳离子，例如K⁺、Na⁺、Li⁺、NH₄⁺、Ca²⁺，更优选K⁺；或R₈⁺为衍生自胺或含N基团的有机阳离子。

如本文中的定义，R₇、R₈、R₉和R’₉中定义的C₁-C₂₅烃基可被一个或多个选自以下的官能团任选取代：卤素、硝基、氧代、OR、SR、桥氧基、桥硫基、氮杂环丙烷、-CONRR’、-COR、COOR、-OSO₃R、-SO₃R、-SO₂R、-NHSO₂R、-SO₂NRR’-NRR’、＝N-OR、＝N-NRR’、-C(＝NR)-NRR’、-NR-NRR’、-(R)N-C(＝NR)-NRR’、O←NR-、＞C＝NR、-(CH₂)_n-NR-COR’、-(CH₂)_n-CO-NRR’、-O-(CH₂)_n-OR、-O-(CH₂)_n-O-(CH₂)_n-R、-PRR’、-OPO₃RR’、-PO₂HR、-PO₃RR’；一个或多个带负电荷的基团，例如COO^-、COS^-、-OSO₃^-、-SO₃^-、-OPO₃R^-、-PO₂H^-、-PO₃^2-和-PO₃R^-；和/或一个或多个带正电荷的基团，例如-P⁺(RR’R”)、-As⁺(RR’R”)、-O⁺(RR’)、-S⁺(RR’)、-Se⁺(RR’)、-Te⁺(RR’)、-Sb⁺(RR’R”)、-Bi⁺(RR’R”)、O←N⁺(RR’)-、＞C＝N⁺(RR’)、-N⁺(RR’R”)、-(R)N-N⁺(RR’R”)、-(R)N-C(＝HN)-N⁺RR’R”、-C(＝NH)-N⁺(RR’R”)、或N-杂芳族阳离子，例如吡唑咪唑唑噻唑吡啶喹啉嘧啶1，2，4-三嗪1，3，5-三嗪和嘌呤其中n为1-6的整数，R、R’和R”各自独立地为H、烃基或杂环基，或者R、R’和R”中的两个与它们所连接的N原子一起形成3-7元饱和环，其任选含有一个或多个选自O、S或N的杂原子且任选在另外的N原子上被进一步取代。R₇、R₈、R₉和R’₉中定义的C₁-C₂₅烃基还可被单糖、寡糖或多糖残基(例如糖基)、或氨基酸残基、肽或蛋白质、优选RGD-肽取代。另外，R₈、R₉和R’₉各自可独立地为单糖、寡糖或多糖的残基(例如糖基)，或氨基酸残基、肽或蛋白质，或多齿配体例如DTPA、DOTA、EDTA等及其与金属的螯合物。

在基团OR和SR中，当R为H时，该基团分别表示羟基和巯基，当R不是H时，则代表醚和硫化物。在基团-PRR’中，当R和R’为H时，表示膦基。在基团-COR中，当R为H时，表示醛的甲酰基-CHO，而当R不是H时，它便是酮的残基，例如烷基羰基和芳基羰基。在基团COOR中，当R不是H时，这便是羧酸酯基团，例如烷氧基羰基和芳氧基羰基。同样地，在基团-OSO₃R、-SO₃R、-SO₂R、-OPO₃RR’、-PO₂HR和-PO₃RR’中，当R和R’不是H时，表示酯。

在本发明的一个优选的实施方案申，光敏剂是未金属化的，即M为2H。在其它优选的实施方案中，光敏剂为如上文中定义的金属化的，M更优选为Pd、Cu或Mn，最优选为Pd或Cu。

在本发明的一些优选实施方案中，光敏剂为式I、式II或式III、更优选式II的Bchl，M为2H、Cu、Mn或Pd。在其它实施方案中，光敏剂为式I、式II或式III、更优选式II的Chl，M为2H、Cu或Mn。

在一些优选的实施方案中，缀合物包含式II的光敏剂Bchl，其中M为Pd、Mn、Cu或2H；m为0；R₁为NH-P，其中P为与NH-直接连接或通过间隔物连接的含RGD的肽或RGD肽模拟物的残基；R’₂为甲氧基；R₄在3位上为乙酰基且在8位上为乙基；R’₄为甲基；R₆为-NH-(CH₂)_n-SO₃^-Me⁺，其中n为2或3，Me⁺为Na⁺或K⁺。

在本发明的一个最优选的实施方案中，缀合物包含式II的Bchl，其中M为2H，R₁为NH-P，其中P为SEQ ID NO：1的含RGD的肽c(RGDfK)的残基，R’₂为甲氧基，R₄在3位上为乙酰基且在8位上为乙基，R’₄为甲基，R₆为-NH-(CH₂)₂-SO₃K，本文称为化合物13或c(RGDfK)-2H-MLT。

在另一个最优选的实施方案中，M为Pd，R₁、R’₂、R₄、R’₄、R₆如上定义，P为SEQ ID NO：1的c(RGDfK)，本文称为化合物24或c(RGDfK)-Pd-MLT。

在一个更优选的实施方案中，M为Mn，R₁、R’₂、R₄、R’₄、R₆如上定义，P为c(RGDfK)，本文称为化合物14或c(RGDfK)-Mn-MLT，或者M为Cu，该缀合物在本文中称为化合物15或c(RGDfK)-Cu-MLT。

在又一个更优选的实施方案中，式II中Bchl的M为2H，R’₂、R₄、R’₄和R₆如上定义，R₁为NH-P，其中P为SEQ ID NO：2的C(RADfK)，本文称为化合物45或c(RADfK)-2H-MLT，或者P为SEOID NO：5的c(RGDyK)。

在其它更优选的实施方案中，M为2H，R₁、R’₂、R₄、R’₄和R₆如上定义，P为选自以下的线性肽：SEQ ID NO：6的GRGDSP或SEQID NO：7的GRGDSPK或SEQ ID NO：8的(GRGDSP)4，最优选P为GRGDSP，该缀合物在本文中称为化合物26或线性GRGDSP-2H-MLT。

在还更优选的实施方案中，在式II的Bchl中，M为Pd，m为0，R₁为NH-P，其中P为c(RGDfK)，R’₂为甲氧基，R₄在3位上为乙酰基且在8位上为乙基，R’₄为甲基，和R₆为-NH-(CH₂)₃-SO₃K，或者P为SEQ ID NO：4的环肽RGDf-n(Me)K，和R₆为-NH-(CH₂)₂-SO₃K。

另外更优选的实施方案涉及与SEQ ID NO：7的线性肽GRGDSPK或SEQ ID NO：8的(GRGDSP)₄的缀合物，其中式II的Bchl的中心金属原子为Pd；m、R’₂、R₄、R’₄如上定义，R₁为HH-P，且R₆为-NH-(CH₂)₂-SO₃K。

在甚至还更优选的实施方案中，缀合物包含式II的Bchl，其中M为Pd；m、R’₂、R₄、R’₄如上定义，R₁为NH-CH[(-(CH₂)₂-CO-NH-P]₂，其中P为SEQ ID NO：5的含RGD的肽c(RGDyK)的残基，且R₆为-NH-(CH₂)₂-SO₃K，本文称为化合物36或c(RGDyK)₂-2H-MLT。

在本发明另外两个更优选的实施方案中，在式II的Bchl中，M为Pd或2H；m为0；R₁为NH-P，其中P为c(RGDfK)(SEQ ID NO：1)的残基，R’₂为甲氧基；R₄在3位上为乙酰基且在8位上为乙基；R’₄为甲基，R₆为-NH-CH₂-CH(OH)-CH₂OH。

在再一个更优选的实施方案中，缀合物包含如上所述的RGD肽，优选与式II的Bchl缀合的c(RGDfK)，其中M为2H；m、R₁、R’₂、R₄、R’₄如上定义，且R₆为NH-(CH₂)₃-NH-(CH₂)₃-NH₂、-NH-(CH₂)₂-吗啉代或-NH-(CH₂)₃-哌嗪子基-(CH₂)₃-NH₂。

另外更优选的实施方案涉及包含式II的Bchl的缀合物或其与Gd的螯合物，其中M为2H；m为0；R₁为NH-c(RGDfK)，R’₂为甲氧基，R₄在3位上为乙酰基且在8位上为乙基，R’₄为甲基；且R₆为-NH-(CH₂)₃-NH-CO-DTPA。

本发明还涉及优选的缀合物，其包含式II的光敏剂Bchl，其中M为Pd或2H；m为0；R₁为NH-P，其中P为与NH-直接连接或通过间隔物连接的RGD肽模拟物的残基；R’₂为甲氧基；R₄在3位上为乙酰基且在8位上为乙基；R’₄为甲基；且R₆为-NH-CH₂-CH(OH)-CH₂-OH或-NH-(CH₂)₂-SO₃K。

在本发明的另一个实施方案中，缀合物包含式III的Bchl，其中M为Pd；R₁为NH-P，其中P为与NH-直接连接或通过间隔物连接的含RGD的肽或RGD肽模拟物的残基；R₄在3位上为乙酰基且在8位上为乙基；R’₄为甲基；X为N-R₇，且R₇为-NH-(CH₂)₃-SO₃^-Me⁺，其中Me⁺为Na⁺或K⁺。

在另一个实施方案中，缀合物包含式I的Bchl，其中M为Mn；R₁为NH-P，其中P为与NH-直接连接或通过间隔物连接的含RGD的肽或RGD肽模拟物的残基；R₂为OH；R₃为COOCH₃，R₄在3位上为乙酰基且在8位上为乙基；R’₄为甲基；且R₅为O。在更优选的实施方案中，M为2H或Mn，P为SEQ ID NO：1的含RGD的肽c(RGDfK)或SEQ ID NO：3的c(RGDK)的残基。

在另一个实施方案中，缀合物包含式II的Chl，其中M选自Mn、Cu或2H；R₁为NH-P，其中P为与NH-直接连接或通过间隔物连接的含RGD的肽或RGD肽模拟物的残基；R₄在3位上为乙烯基且在8位上为乙基；R’₄为甲基；且R₆为-NH-(CH₂)₂-SO₃^-Me⁺，其中Me⁺为Na⁺或K⁺。

在更优选的实施方案中，在式II的Chl中，M为2H或Cu或Mn，R₄、R’₄和R₆如上定义，光敏剂与SEQ ID NO：1的五环的含RGD的肽c(RGDfK)缀合。

在另一个实施方案中，R₁和R₆一起形成包含-NH-RGD-CO-NH-(CH₂)₂-NH-或-NH-RGD-CO-NH-(CH₂)₂-哌嗪子基-(CH₂)₂-NH-的环。在一个实施方案中，缀合物包含式II的Bchl，其中m为0；R’₂为甲氧基；R₄在3位上为乙酰基且在8位上为乙基；R’₄为甲基；且R₁和R₆两个一起形成包含-NH-RGD-CO-NH-(CH₂)₂-NH-的环，且M为Pd或M为2H，或者R₁和R₆一起形成包含-NH-RGD-CO-NH-(CH₂)₂-哌嗪子基-(CH₂)₂-NH-的环，且M为Pd。

工业实用性

对于在本发明中的应用，将缀合物配制在包含药学上可接受的载体的药物组合物中。

在一个实施方案中，药物组合物用于光动力疗法(PDT)，更准确地讲是用于肿瘤靶向PDT。在另一个实施方案中，药物组合物用于诊断目的，用于坏死肿瘤区的可视化。

可按照本发明，通过使中心金属原子适合特定的技术，来应用若干诊断技术。

对于通过动态荧光成像进行的坏死肿瘤区诊断，光敏剂中的M为2H或选自Pd和Zn的金属。

对于通过放射性诊断技术进行的坏死肿瘤区诊断，光敏剂中的M为选自以下的放射性同位素：⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、^99mTc、⁶⁷Ga、²⁰¹Tl、¹⁹⁵Pt、⁶⁰Co、¹¹¹In和⁵¹Cr。在一个实施方案中，放射性诊断技术是正电子发射断层摄影术(PET)，且M为⁶⁴Cu或⁶⁷Cu。在另一个实施方案中，放射性诊断技术是单光子发射断层摄影术(SPET)，且M为选自以下的放射性同位素：^99mTc、⁶⁷Ga、¹⁹⁵Pt、¹¹¹In、⁵¹Cr和⁶⁰Co。

对于通过分子核磁共振成像(MRI)进行的坏死肿瘤区诊断，M为选自以下的顺磁金属：Mn³⁺、Cu²⁺、Fe³⁺、Eu³⁺、Gd³⁺和Dy³⁺，或者光敏剂被多齿配体的金属螯合物取代，所述金属如前文中定义。

在一个实施方案中，本发明涉及用于通过动态荧光成像使坏死肿瘤区成像的方法，所述方法包括：

(a)给予疑似患有带有坏死区的肿瘤的受治疗者本发明的缀合物，其中M为2H或选自Pd和Zn的金属；

(b)在给予缀合物后至少24-48小时期间以1-8小时的时间间隔照射受治疗者并测定可疑区域的荧光，其中在24-48小时或更长时间后具有荧光的区域表示存在坏死肿瘤区。

在一个优选的实施方案中，用于上述方法的缀合物是化合物13或化合物24，肿瘤是乳腺肿瘤或卵巢肿瘤，在药物(缀合物)注射后3-8天，优选5-8天可观察到坏死区。

在另一个实施方案中，本发明提供用于通过放射性诊断技术诊断坏死肿瘤区的方法，所述方法包括：

(a)给予疑似患有肿瘤的受治疗者本发明的缀合物，其中M为选自以下的放射性同位素：⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、^99mTc、⁶⁷Ga、²⁰¹Tl、¹⁹⁵Pt、⁶⁰Co、¹¹¹In或⁵¹Cr。

(b)在给予缀合物后至少24-48小时期间以1-8小时的时间间隔用成像扫描仪对受治疗者进行扫描，测定可疑区域的放射水平，其中在24-48小时或更长时间具有放射性的区域表示存在坏死肿瘤区。

本发明还提供用于诊断坏死肿瘤区的分子核磁共振成像(MRI)方法，所述方法包括以下步骤：

(a)给予疑似患有肿瘤的受治疗者如本文定义的缀合物，其中M为选自以下的顺磁金属：Mn³⁺、Cu²⁺、Fe³⁺、Eu³⁺、Gd³⁺或Dy³⁺；和

(b)通过在所述给药之前(零时)在患者体内产生目标靶区的至少一幅MR图像以及在所述给药之后至少24-48小时、优选96小时在第二个或更多个时间点上产生一幅或多幅MR图像，而对患者进行核磁共振成像；和

(c)对数据进行加工和分析以诊断所述坏死肿瘤区的存在与否。

本发明还提供在手术前用于对肿瘤边缘作图的方法，所述方法包括给予有需要的受治疗者本文中定义的缀合物，在给予缀合物后头2-24小时，对受治疗者进行照射，并使肿瘤、优选乳腺肿瘤成像而进行扫描，因此在手术准备中给肿瘤边缘作图。

本发明还提供用于局部乳腺癌、尤其原位管癌(DCIS)的微创治疗、检测和预后策略，所述策略包括(i)给予受治疗者本文中定义的缀合物，优选RGD-Bchl缀合物，从而RGD-Bchl缀合物特异性归巢并蓄积在坏死肿瘤区，(ii)通过以高精度用于肿瘤检测和肿瘤边缘界定的上述任何方法对用RGD-BChl衍生物治疗的受治疗者进行肿瘤靶向成像，以及通过MRI、荧光和PET SCAN方法预后；和(iii)允许保乳和重塑的局部坏死区的肿瘤靶向光动力疗法(PDT)。

用于本发明的RGD肽-光敏剂缀合物特别适用于坏死肿瘤的肿瘤靶向PDT，并可用于治疗癌性疾病。

因此，在一个实施方案中，本发明的缀合物可用于肿瘤领域以通过癌前状态和若干癌症类型的PDT用于治疗，所述癌症类型例如但不限于黑素瘤、前列腺、脑、结肠、卵巢、乳腺、结肠直肠、头颈部、由乳腺癌引起的胸壁肿瘤、皮肤、肺、食道和膀胱癌和肿瘤。所述化合物可用于治疗原发移性坏死肿瘤以及转移性坏死肿瘤。

在一个优选的实施方案中，该方法用于治疗局部乳腺癌，尤其原位管癌。

本发明提供用于坏死肿瘤的肿瘤光动力疗法的方法，所述方法包括：(a)给予有需要的个体本发明的RGD肽-光敏剂缀合物；和(b)在注射缀合物后至少24小时，优选2、3、4、5、6、7或8天，通过本文所述的任何方法，在确定存在坏死区后照射肿瘤局部及其坏死区。

在一个方面，本发明涉及检测肿瘤坏死的新的方法，所述方法以荧光Chl/Bchl-RGD缀合物在坏死肿瘤区的选择性摄取和长期蓄积为基础。Chl/Bchl致敏物与归巢于内皮和肿瘤细胞的特异性受体的配体缀合。然后，一旦Chl/Bchl以足够高的浓度蓄积和并从周围组织清除后，便通过照射肿瘤体积和紧接的附近，开始以光动力学的方式产生ROS。

化合物24的Bchl组分在近红外线(NIR)处具有可以检测固有荧光。使用化合物24的最新实验显示，在原发瘤的异种移植物中蓄积高达4-8uM。化合物24长时期保留在肿瘤部位，使得信号蓄积和良好的信噪比成为可能。该分子的这些能力可能取决于Bchl和血清白蛋白之间的相互作用，使该分子成为定向成像和最终定向疗法的良好的候选分子。另一种Bchl衍生物化合物13，具有高达3倍的发光能力，因此可以是甚至更好的靶向成像的候选分子。这些分子开启了在人乳腺腺癌模型中精确检测肿瘤边缘和坏死的可能性。检测肿瘤边缘和坏死是迄今为止在肿瘤治疗中存在的两个最具有挑战性的问题。此外，两者是在治疗后肿瘤再生长的可靠预测物。因此，预期在未来的临床应用时，前述RGD衍生物适用于在手术台上检测肿瘤和坏死。

本发明引进了实现与RGD肽缀合的Chl/Bchl衍生物在有活力肿瘤组织中短暂停留后在坏死肿瘤区长期蓄积的新的方法。蓄积的化合物可用于有活力(在给药后短期内)或坏死(在较长时间内)肿瘤区的体内成像，以及用于通过PDT的肿瘤疗法、通过改变Bchl中心金属或通过与小的治疗剂进一步缀合的化疗或同位素放射疗法。以化合物13和化合物24为例对新的方法进行了说明。已把c(RGDfK)鉴定为在血管生成中上调的αvβ₃和αvβ₅整联蛋白的高度特异性配体。化合物25部分提供在NIR时具有强自身荧光的缀合物，使之适用于在组织摄取后的荧光成像。

实验数据表明，RGD部分是化合物13和化合物24在小的(无坏死)肿瘤和大的(坏死)肿瘤两者中的特异性蓄积中必不可少的，因为对于未缀合的化合物25，没有观察到短期或长期的蓄积。此外，经治疗小鼠的化合物25的总体清除率比缀合化合物的显著较快。通过本文描述的竞争实验对RGD待定机制作出补充，其中在化合物13后不久或同时注射过量的游离c(RGDfK)，防止了稍后被肿瘤组织摄取。

在坏死和无坏死肿瘤之间观察到在化合物13蓄积中的巨大差异。因此，还没有发展成坏死的小的MDA-MB-231-RFP肿瘤(约0.5cm³)显示-在药物注射后1-6.5小时内化合物13在肿瘤中快速蓄积，随后是快速(＜24小时)清除。在稍后的时间内，当大部分剩余药物限于清除器官(主要是肾但也可以是肝)中时，在肿瘤中仅可检出非常少量的药物。与其它器官相比，自药物注射后48小时起，已发展成坏死的大的MDA-MB-231-RFP(＞1cm³)肿瘤显示出较慢的达到峰值肿瘤浓度比的蓄积。自药物注射后24小时起，肿瘤质量中的平均药物浓度仅轻微降低。这些结果对于坏死肿瘤区是普遍的，但因肿瘤类型而有所不同。此外，对于化合物24，在坏死和无坏死肿瘤中的蓄积方式之间观察到类似差异，不同之处在于在肝中观察到较慢的清除率，使化合物13成为用于临床应用的更好的候选分子。

或许，在乳腺癌模型和卵巢癌肿瘤模型中，本文所观察到的化合物13在坏死区和无坏死区的蓄积速率之间的差异，与两个肿瘤类型的微环境的不同性质有关。在乳腺肿瘤观察到肿瘤体积和微血管密度之间的相反关系：随着肿瘤体积增加，每立方厘米的微血管密度显著降低。因此，整联蛋白的浓度变得按比例地降低，因此整联蛋白依赖性药物蓄积的速率应按比例地降低。

所提供的数据最突出的特征是药物荧光从活力部位明显转移至坏死肿瘤体积，其由给予化合物13后不同时间坏死MDA-MB-231-RFP肿瘤的切离肿瘤荧光成像得到证实。根据药物蓄积对RGD部分的依赖性，多步骤蓄积是可能的，其中第一步包括化合物25部分(2H-MLT)从血清白蛋白分子中解离，被微血管系统、有活力的肿瘤细胞及或许巨噬细胞或嗜中性粒细胞中的αvβ₃整联蛋白有效摄取。据信该步骤后接着是化合物13被动转运或胞转迁移进入坏死区，并且在此长时间缺乏从中的引流作用(drainage)。在无坏死肿瘤中，药物通过由整个肿瘤构成的有活力区域快速蓄积，但是因为不存在坏死，所以药物快速清除。当注射化合物24时，切离肿瘤荧光结果与化合物13获得的结果类似。

在其它肿瘤模型(即MLS-mBanana、人卵巢癌)中，观察到坏死和无坏死肿瘤的蓄积率的类似差异。然而，在速率和蓄积方式上存在一些变化，可能反映了不同的肿瘤类型。化合物13在无坏死MLS-mBanana肿瘤中快速蓄积，然后慢慢清除掉。在坏死肿瘤中药物在第一小时内在有活力边缘达到最大浓度，然后转移到坏死区，在给药后24小时在此达到最大浓度。与MDA-MB-231-RFP相比，在MLS-mBanana中以高浓度快速蓄积，反映了在MLS-mBanana细胞中整联蛋白受体的较高浓度。

用化合物13治疗的动物的大肿瘤和小肿瘤的组织学分析似乎支持所提出的蓄积方式，并提供了一些有关潜在机制的线索。在头几小时内有活力肿瘤区和化合物13荧光有非常好的重叠，在给药后24小时和更长时间，13的荧光和坏死区间有非常好的重叠。

有许多药物和造影剂在与淋巴引流差和静脉回流慢有关的肿瘤中蓄积的报道。之前有研究提出这种现象，称为高通透性和保持(EPR)作用，作为以非特异性方式靶向肿瘤组织的方法。有可能的是，EPR说明了化合物13或化合物24在坏死区和无坏死肿瘤中的蓄积方式。最近有研究提出，血清白蛋白(SA)-药物络合物通过肿瘤血管系统渗透到间质肿瘤组织中以说明这类蓄积(Tanaka，Shiramoto等，2004)。文献中有若干实例显示，分子与SA缀合导致将分子递送至肿瘤甚至递送至坏死区。事实上，本发明的发明人之前指出带负电荷的水溶性Bchl衍生物对SA具有高亲和力。因此，在给药后化合物13或化合物24可能通过Bchl部分与SA缔合，在血液中循环，并通过如上阐释的EPR作用与SA一起渗入(extravagate)到肿瘤组织中。如果那样的话，预期化合物25作为突出的化学实体在坏死区蓄积，然而，由于化合物25在所研究的肿瘤中的保留短暂，可排除通过EPR作用蓄积的可能性。

或者，当Bchl-RGD衍生物遇到αVβ3或αVβ5整联蛋白时，它可从SA载体上脱落，并且以比SA分子更高的亲和力通过RGD组成部分与整联蛋白结合。在这种最初的连接后，化合物13或化合物24可通过胞吞扩散至上皮细胞，或跨越上皮细胞进行胞转。药物直接迁移到胞外基质(ECM)中也是可能的。在这些情况下，根据浓度梯度进行的药物移动将趋向于坏死区，在此化合物13或化合物24开始达到其最低浓度。

曾提出的c(RGDfK)-2H/Pd-MLT与整联蛋白的相互作用可能意味着在坏死肿瘤区的蓄积是嗜中性粒细胞/巨噬细胞依赖性的。相当一段时间就已知活化的嗜中性粒细胞和巨噬细胞表达整联蛋白。组织学结果表明，嗜中性粒细胞停留在坏死区(虽然大部分在边缘中)。由文献得知，在侵袭性乳腺癌中存在高的巨噬细胞浸润(Leek，Landers等，1999)。对于NACA(Necrosis Avid Contrast Agents，坏死亲和性造影剂)，发现从坏死病灶中的最终清除在给药后要花几天，对应于天然愈合过程，期间坏死组织日渐被浸润，被炎性细胞(主要是嗜中性粒细胞、单核细胞和/或巨噬细胞)吞噬，并且被肉芽组织代替。因此，认为坏死中保留的NACA将通过吞噬作用与坏死材料一道被清除掉。因此，在NACA-坏死结合后第二次巨噬细胞摄取也可解释其局部富集。因此有人提出，有可能是坏死区的吸引及在其中的保留依赖于聚集在坏死区的嗜中性粒细胞和/或巨噬细胞的吸引。

荧光Chl/Bchl在坏死区的可能的靶向和长期保留，使得它们能够被早期检出，并且有助于预测肿瘤预后和治疗方式。此外，它开启了递送引发低氧的药物的途径。

下面通过下列非限制性实施例对本发明进行说明。

实施例

材料与方法

(i)化合物-按照相同申请人的WO 2008/023378中所述，制备Bchl衍生物、RGD-肽及其缀合物。本文这些缀合物和化合物用与WO2008/023378相同的阿拉伯数字表示(化合物45除外)。

化合物13[c(RGDfK)-2H-MLT]：3¹-氧代-15-甲氧基羰基甲基-红螺菌菌绿素13¹-(2-磺乙基)酰胺-17³-c(RGDfK)酰胺钾盐。

化合物14[c(RGDfK)-Mn-MLT]：锰(III)3¹-氧代-15-甲氧基羰基甲基-红螺菌菌绿素13¹-(2-磺乙基)酰胺-17³-(环RGDfK)酰胺钾盐。

化合物15[c(RGDfK)-Cu-MLT]：铜(II)3¹-氧代-15-甲氧基羰基甲基-红螺菌菌绿素13¹-(2-磺乙基)酰胺-17³-(环RGDfK)酰胺钾盐。

化合物24[c(RGDfK)-Pd-MLT]：钯3¹-氧代-15-甲氧基羰基-甲基-红螺菌菌绿素13¹-(2-磺乙基)酰胺-17³-c(RGDfK)酰胺钾盐。

化合物25[2H-MLT]：3¹-氧代-15-甲氧基羰基甲基-螺红菌-菌绿素13¹-(2-磺乙基)酰胺钾盐。

化合物26[线性GRGDSP-2H-MLT]：3¹-氧代-15-甲氧基羰基甲基-红螺菌菌绿素13¹-(2-磺乙基)酰胺-17³-(GRGDSP)酰胺钾盐。

化合物36[c(RGDyK)₂-2H-MLT]：3¹-氧代-15-甲氧基羰基甲基-红螺菌菌绿素13¹-(2-磺乙基)酰胺-17³-双(环RGDfK)酰胺钾盐。

化合物45[c(RADfK)-2H-MLT]：3¹-氧代-15-甲氧基羰基甲基-红螺菌菌绿素13¹-(2-磺乙基)酰胺-17³-(环RADfK)酰胺钾盐。

(ii)细胞系--从美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)获得MDA-MB-231人乳腺癌细胞。MLS-pRSETB-mBanana转染的抗嘌罗霉素的人卵巢癌细胞由Michal Neeman教授(Department ofBiological Regulation，Weizmann Institute of Science，Rehovot，Israel)惠赠。

(iii)用红色荧光蛋白(RFP)转染的MDA-MB-231--两种质粒用于转染：携带新霉素抗性基因的pDsRed2-N1(Clontech，Palo Alto，CA)(图1A)，及携带潮霉素抗性基因的修饰的pDsRed-Monomer-Hyg-C1(Clontech，Palo Alto，CA)，其中图1B中所示质粒的DsRed-Monomer基因被pDsRed2(得自pDsRed2-N1质粒，图1C)替换。对于转染，按照生产商的方案使用Lipofectamine^TM 2000(Invitrogen^TM)。

(iv)组织培养--将MDA-MB-231-RFP细胞在补充了1mmol/L丙酮酸钠、10％胎牛血清(FCS)、250μg/ml潮霉素、0.06mg/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素的RPMI 1640培养基中维持。细胞在潮湿环境(5％CO₂，95％空气)中在37℃下生长成为单层细胞。将MLS-mBanana细胞在补充了1mmol/L丙酮酸钠、10％胎牛血清(FCS)、10μg/ml嘌罗霉素、0.06mg/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素的MEM-α培养基中维持。细胞在潮湿环境(5％CO₂，95％空气)中在37℃中生长成单层细胞。

(v)动物--遵照Weizmann Institute of Science(Rehovot，Israel)的机构动物管理与使用委员会的准则(1996)，在动物设施中关养雌性CD1裸小鼠(7-8周龄，约25g)，并且按任意进食饮水处理。

(vi)小鼠肿瘤模型--MDA-MB-231-RFP荧光人乳腺癌细胞和MLS-mBanana荧光人卵巢癌细胞(5×10⁶的100μl盐水溶液)用胰蛋白酶消化，在分会合时收集，然后接种到雌性小鼠背部和乳房脂垫。使肿瘤生长成为两种所需大小--坏死肿瘤(约1cm³，3-4周内)和无坏死肿瘤(约0.5cm³，1-2周内)。

(vii)整体荧光成像--通过腹膜内注射30μl 85∶15氯胺酮∶赛拉嗪的混合物使小鼠麻醉。对于监测乳房脂垫中的药物蓄积，按15mg药物/kg体重将化合物13、化合物25或化合物24经静脉内注射到小鼠尾静脉。通过体内光学成像系统100(Xenogen Corp.，Alameda，CA)监测红色荧光蛋白(RFP)、pRSETB-mBanana和光敏剂荧光。用于肿瘤成像的主滤片组包括500-550nm下的激发滤片和575-650nm下的发射滤片；用于减去组织自体荧光的背景滤片组包括460-490nm下的激发滤片和575-650nm下的发射滤片。药物成像主滤片组包括665-695nm下的激发滤片和810-875nm下的发射滤片。图像在相同的曝光时间内获得，用线条彩色标尺说明以供进行定性比较。

(viii)坏死肿瘤中的荧光信号测量--从整体体内图像标出肿瘤边缘(目标区(ROI))，圈出边缘内的荧光信号用光子/秒表示。在旁侧用相同的ROI测量光子/秒。另外，对于背景测量，在3只未治疗小鼠中测量肿瘤和旁侧ROI，取平均值。将各个ROI的荧光测量值除以面积得到归一化萤光信号强度，单位为光子/秒/cm²。化合物13注射后从15分钟到216小时收集信号测量值。在每个时间点上，减去背景，计算得到平均，计算得到肿瘤边缘和旁侧荧光之间的比率。

(ix)化合物13和游离c(RGDfK)结合之间的竞争测定法--在注射化合物13(140nmol)之前1小时给小鼠注射过量(8.5μmol)的游离c(RGDfK)肽。对照组只注射化合物13(140nmol)。化合物13注射后24小时拍摄荧光照片。按(vii)中所述使用荧光成像主滤片组。

(x)切离肿瘤荧光成像--将15mg/kg化合物13经静脉内注射到小鼠尾静脉中。处死小鼠，切除肿瘤，切开两半，使用Xenogen系统在不同的时间间隔成像：对于MDA-MB-231-RFP为10分钟、1小时、4小时和24小时、3天、5天和7天，对于MLS-mBanana为7天。用于荧光成像的滤片组见(vii)。

(xi)组织学--在切除实验后，将肿瘤在3.7％甲醛中固定，并包埋在石蜡块中。切片在标准条件下用苏木精-伊红(H&E)染色。

(xii)PDT方案--将7.5mg/kg或15mg/kg化合物13注射到被麻醉的小鼠静脉内。照射肿瘤10分钟或30分钟。药物光照间隔为药物注射后8小时或24小时。使用755nm二极管激光器以100mW/cm²(CeramOptec，Germany)进行经皮照射。在避光对照组中，将药物注射到小鼠静脉内，将小鼠放入无光笼内24小时。在光照对照组中，小鼠不注射药物，但用100mW/cm²照射10分钟。在PDT后头两天内，按需给小鼠止痛(每天2.5mg/kg氟尼辛(Flunexin))。

实施例1.用荧光蛋白转染肿瘤细胞

为了建立以稳定方式表达RFP的细胞系，进行了转染步骤。可通过荧光显微镜和其它荧光成像方法在体内和体外(组织/细胞)对这类细胞系进行检测。选择已知产生自发性中心性坏死的人乳腺癌MDA-MB-231细胞系用于此目的。使用两种质粒(图1A、图1C)，获得稳定克隆后，通过荧光显微镜检测(见图2A-2B)。由修饰的pDsRed-Monomer-Hyg-C1质粒所产生的克隆(图1C)发出较强荧光。选出用修饰的pDsRed-Monomer-Hyg-C1转染的克隆3(图2B)以进一步使用。

组成型表达RFP的转染细胞在体外和体内的荧光强度不随着时间的变化而降低。未转染的细胞无红色自体荧光。

实施例2.坏死肿瘤模型--组织病理学分析

为了证实MDA-MB-231-RFP细胞产生合适的坏死模型，使MDA-MB-231-RFP肿瘤发展成两种大小。按照材料与方法部分(xi)中所述进行了组织学和组织病理学分析。结果见图3A和图3B。约1cm³的大肿瘤具有非常显著的坏死区(图3A)，而约0.5cm³的小肿瘤没有坏死区(图3B)。

实施例3.原发坏死MDA-MB-231-RFP异种移植物肿瘤中化合物13摄取的体内荧光成像

对化合物13在坏死MDA-MB-231-RFP肿瘤(≥1cm³)的蓄积方式进行了体内检查。图4A-4B和图5A-5B说明采用Xenogen系统，在CD-1雌性裸小鼠的乳房垫中，化合物13在常位人乳腺MDA-MB-231-RFP原发瘤中的荧光信号蓄积。使用上文材料与方法部分(vii)中所述的滤片组，同时记录了整体动物图像。每1-1.5小时以及在注射化合物13后24小时(图4A-4B)，然后接下来7天中每24小时(图5A-5B)获取动态荧光图像达9小时。在注射化合物13后不久，可检测整个动物体的NIR荧光，这反映出循环中的高药物浓度。在注射后头9小时观察到从循环中快速清除，随之在肝中蓄积，在某种程度上在肿瘤中蓄积(图4B)。次日，化合物13保持在肿瘤中的蓄积，而从肝中完全清除，提供了在≥3天直到注射后的7天跟踪期间结束时的肿瘤成像(图5B)，之后极缓慢地清除。整个实验中肿瘤大小和位置不变，正如红色体内整体图像中所见(图4A和图5A)。在肿瘤大小≥1cm³的9只研究动物中观察到类似结果。

实施例4.在原发无坏死MDA-MB-231-RFP异种移植物肿瘤中化合物13摄取的体内荧光成像

接着在≤0.5cm³的无坏死肿瘤中对相同参数进行了研究。图6A-6B和图7A-7B表示来自移植了MDA-MB-231-RFP的CD-1雌性裸小鼠中的化合物13和RFP的荧光信号。采用如上所述的系统并按与实施例3相同的时间间隔对药物蓄积方式成像，但只限于3天，因为到那时药物完全清除。这些无坏死肿瘤中的蓄积方式与坏死肿瘤中所观察到的显著不同。在注射后约2小时在肿瘤中及在肝中后不久(药物注射后3.5小时)，化合物13NIR荧光达到峰值(图6B)。与得自坏死肿瘤的化合物13的分辨荧光不同，注射后2天，从无坏死肿瘤中几乎无法观测到荧光(图7A)。在16只动物的平均荧光测量值中，药物注射后1-6.5小时检出峰值肿瘤荧光。

实施例5.MDA-MB-231-RFP坏死肿瘤中化合物13摄取和清除的动力学

为了半定量地评价化合物13在坏死肿瘤中的蓄积方式，计算得到化合物13在9只小鼠的坏死肿瘤中的平均荧光信号，并相对于216小时在若干时间点上作图(图8)。自注射后12小时起向前，与旁侧的等同对照区相比，来自肿瘤的荧光信号变得特别地强。肿瘤和旁侧之间的荧光比及时增加并在距192小时约8小时之时达到稳定期。

实施例6.化合物24在常位MDA-MB-231-RFP原发坏死异种移植物肿瘤中的摄取

采用实施例3中所描述的相同实验设置，对金属化缀合物24(c(RGDfK)-Pd-MLT)在坏死原发MDA-MB-231-RFP肿瘤中的体内蓄积方式进行了研究。

结果见图9A-9B和图10A-10B，结果表明在注射化合物24后不久可测出荧光，反映了循环中药物浓度高。在注射后头8小时观察到循环快速清除，随之在肝中蓄积，以及在某种程度上在肿瘤中蓄积(图9B)。次日，化合物24保持在肿瘤中蓄积，然而，观察到未完全从肝中清除(图10B)。显然，从注射后约3天起，化合物24可用作肿瘤的选择性成像分子，其后具有极缓缓的清除率。然而，比起化合物13，它的特异性略微较小。肿瘤大小和位置在整个实验中没有改变，如红色体内整体图像所见一样(图9A和10A)。这些肿瘤大小≥1cm³的结果是在3只动物中观察的。

实施例7.化合物24在常位MDA-MB-231-RFP原发无坏死异种移植物肿瘤中的摄取

如上文实施例4中所述，采用与实施例6中规定相同的时间间隔，在移植在CD-1雌性裸小鼠中的MDA-MB-231-RFP无坏死肿瘤(约0.5cm³)中对来自化合物24和RFP的荧光信号进行了研究，但只限于2天，因为到那时药物完全从肿瘤中清除。结果见图11A-11B和1图12A-12B，结果表明对于化合物13，在无坏死肿瘤中的蓄积方式显著不同于在坏死肿瘤中所观察到的方式。在注射后约2.5小时的肿瘤中和在肝中后不久(药物注射后5.5小时，图11B)，化合物24NIR荧光达到峰值。与来自坏死肿瘤的化合物24的分辨荧光不同，在注射后24小时从无坏死肿瘤中几乎无法观察到荧光(图12B)。在药物注射后1-4.5小时检测峰值肿瘤荧光(5只动物的平均荧光测量值)。

实施例8.化合物13在植入在小鼠乳房垫中的MLS-mBanana原发坏死肿瘤中的摄取

为了证实上述实验中所获得的概括性结果，在从MLS-mBanana人卵巢癌细胞系中产生的不同肿瘤类型中，对化合物13在坏死区中的蓄积进行了进一步研究。图13A-13B和图14A-14B所示结果表明，采用如材料与方法部分(vii)中所述的Xenogen系统，化合物13的荧光信号在经皮下(s.c.)移植到CD-1雌性裸小鼠乳房垫中的人卵巢MLS-mBanana原发瘤中蓄积。按与上文实施例3中所述相同的时间间隔监测蓄积方式，限于4天，因为药物到那时完全清除。在注射后不久，从肝和肿瘤中大多检测到化合物13NIR发出荧光。在注射后头8小时发生从循环中快速清除，随之在肝和肿瘤中蓄积(图13B)。2天后，化合物13保持在肿瘤中的蓄积而从肝中完全清除，提供无环境干扰的肿瘤选择性成像(图14B)。从MLS-mBanana坏死肿瘤中的清除比从MDA-MB-231-RFP坏死肿瘤中的清除显著较快，在第3天几乎完成。在整个实验中肿瘤大小和位置没有改变，正如红色体内整体图像中所观察的一样(图13A和14A)。这些结果是在肿瘤大小≥1cm³的3只动物中观察的。

实施例9.化合物13在植入小鼠乳房垫的MLS-mBanana原发无坏死肿瘤中的摄取

鉴于显示无长期药物蓄积的无坏死MDA-MB-231-RFP肿瘤的结果，对MLS-mBanana无坏死肿瘤中的长期蓄积进行了研究。图15A-15B和图16A-16B中所示结果表示化合物13在MLS-mBanana无坏死肿瘤中的荧光信号。按照材料与方法部分(vi)中所述，使用与实施例4中所述相同的时间间隔，限于4天，因为到那时药物几乎完全清除，对蓄积方式进行了监测。无坏死肿瘤中的蓄积方式与坏死肿瘤的有些相似。在注射后1小时的肿瘤中化合物13NIR荧光达到峰值(图15B)。从第1小时起对肝中的蓄积进行了检测。

当在同一线性荧光标尺上比较坏死和无坏死肿瘤时，坏死肿瘤中的化合物13浓度似乎比图17A-17B中所显示的无坏死的高得多。在

药物注射后1-3.5小时检测出峰值肿瘤荧光(4只动物的平均荧光测量值)。

实施例10.化合物13蓄积依赖于c(RGDfK)部分

为了确定化合物13的肿瘤摄取和所得到的NIR荧光信号的蓄积是否由RGD部分驱动，进行了两个实验。在第一个实验中，对在化合物13注射后不同时间的荧光信号的蓄积与注射游离2H-MLT(化合物25)的CD1裸小鼠的进行了比较，所述CD1裸小鼠在乳房垫中移植了MDA-MB-231-RFP的无坏死(≤0.5cm³)和坏死(约1cm³)肿瘤。第二个实验在化合物13和游离c(RGDfK)之间进行了竞争测定法。

10.1化合物25在MDA-MB-231-RFP原发坏死和无坏死肿瘤中的摄取化合物25初次注射后每1-1.5小时持续8.5-9小时和在24小时(图18A-18B和图20A-20B)及余下3天每24小时(图19A-19B和图21A-21B)获取坏死和无坏死肿瘤的动态荧光图像。在注射后5-10分钟，化合物25NIR荧光信号在肿瘤中达到最大浓度，如果观察到任何浓度的话。荧光信号值比化合物13的最大观察值(在长得多的时间间隔下)小约2个数量级。在注射后20分钟荧光信号值已降到无意义。同时，荧光信号大部分在肝和在心脏蓄积。在3只具有坏死肿瘤的动物(图18B)和2只无坏死肿瘤的动物(图20B)中观察到相同的作用方式。

10.2与MDA-MB-231-RFP原发无坏死肿瘤结合的化合物13和游离c(RGDfK)之间的竞争测定法

为了证实特异性结合，通过游离c(RGDfK)配体进行了试图阻断化合物13蓄积的实验。如实施例3中所述在有或没有之前注射c(RGDfK)时给予化合物13。结果见图22A-22D。当在给予游离c(RGDfK)后给予化合物13时，在24小时后在肿瘤中来检测到蓄积(图22C)，而当只给予化合物13时，在对照组中，可在肿瘤中检测出蓄积(图22D)，说明化合物13通过c(RGDfK)部分与肿瘤结合。

实施例11.化合物13在MDA-MB-231-RFP坏死肿瘤区中的特异性蓄积

坏死和无坏死乳腺肿瘤异种移植物植入乳房垫中显著不同的动态荧光图，激发了对肿瘤组织学与化合物13荧光信号蓄积之间的关系进行研究。因此，在注射化合物13后的规定时间切除肿瘤，并切成两半。在若干时间点(注射后10分钟、1小时、4小时和24小时、3天、5天和7天)使用材料与方法部分(vii)中所述的Xenogen系统拍摄图像。图23-29所示结果表示化合物13在不同时间点的荧光蓄积。对于每个时间点，测试了3只动物。药物注射后从10分钟到4小时，仅观察有活力区域的药物荧光(图23-25)。4小时后，存在向坏死区的某种扩散。自注射后3天起，蓄积方式回复(reverted)：荧光完全转移到坏死区，其中有一些残余荧光扩散到周围有活力的细胞中(图27F)。5天和7天同样观察到这些结果(图28-29)。重要的是，在注射后24小时，从坏死区已清楚观察到特异性肿瘤荧光，具有较强的药物荧光，但与3天间隔的相比，肿瘤边界的界线不是十分清晰(图26F)。在这组实验中表明，随着时间推移，化合物13从有活力区向坏死区移动，并在该处长时间特异性蓄积。

实施例12.化合物24在MDA-MB-231-RFP坏死肿瘤区中的特异性蓄积

鉴于所观察到的化合物13的蓄积方式，对其它Bchl衍生物进行了测定。监测了化合物24的蓄积方式，并获得类似结果。药物注射后9天切离肿瘤的结果见图30A-30F。采用如上所述的Xenogen系统拍摄图像。如图30F中所见，药物注射后9天，药物清晰存在于坏死肿瘤区。在全部研究动物中观察到这些结果(N＝3)。当在药物注射后3天和5天切离肿瘤时，也观察到类似结果(每个时间点N＝3)。

实施例13.化合物13在MLS-mBanana坏死肿瘤区中的特异性蓄积

在MDA-MB-231-RFP肿瘤的坏死区中观察到的化合物13和化合物24的蓄积，为研究这种现象的普遍性及其在疗法和成像中的可能应用提供了动力。因此，使用不同类型的肿瘤-MLS-mBanana人卵巢癌。这里结果有些不同。在大多数情况下，该肿瘤类型的坏死方式不是中心性的，也就是说，存在广泛弥散性坏死，它不是特别局限于肿瘤中部或从肿瘤的一个部位产生。在这些情况下，蓄积并不如此长久。在观察到中心性坏死的几个病例中，蓄积方式与MDA-MB-231-RFP肿瘤中的相似。图31-32表示药物注射后7天所获得的结果。正如所见，当观察到中心性坏死时，药物清晰地存在于肿瘤的坏死区(图31F)当无中心性坏死时，则不存在(图32F)。

实施例14.坏死肿瘤的切离肿瘤图像和组织切片

切离MDA-MB-231-RFP坏死肿瘤，将肿瘤的组织切片染色(苏木精和伊红(H&E))。图33A-33D表示药物注射4小时后切离的有活力肿瘤和坏死肿瘤区的组织切片。这些观察结果可补充之前所获得的RFP和化合物13组织分布成像。如图33A中所见，大部分质量由不透明黄褐色坏死组织组成。从图33B中可见，可注意肉眼可见特征和显微镜可见特征之间的关系。坏死组织在中部是嗜酸性到高嗜酸性的，具有广泛的核溶解及较少的核固缩和核裂。有轻微多病灶嗜中性粒细胞浸润至坏死组织，大部分在坏死区边缘。有活力区域限于肿瘤外围。它们由无序增殖的瘤细胞组成，排列成密集的细胞层(图33D)。瘤细胞为圆形变为不规则，具有高核质比和不规则泡状核。对于有活力和坏死区两者，注射后4小时化合物13的荧光令人满意地与组织学结果一致(图25F)。对于所研究的坏死肿瘤，包括没有注射药物的对照肿瘤，都获得相似关联性。

实施例15.使用化合物13进行体内PDT研究

一般来讲，对于体内PDT研究，如上所述将将荧光MDA-MB-231-RFP乳腺癌细胞或MLS-mBanana卵巢癌细胞经皮下接种到雌性小鼠背部或乳房脂垫，使之生长至坏死(≥1cm³)或无坏死(约0.5cm³)大小，来产生小鼠肿瘤模型。以7.5-15mg/kg之间的不同浓度，经静脉内给麻醉小鼠注射药物。照射肿瘤10分钟或30分钟，药物光照间隔为药物注射后4-24小时之间。

为了获得最佳治疗条件，采用几个方案研究化合物13对CD-1裸小鼠中的MDA-MB-231-RFP肿瘤的作用，结果概括于表1。

如表1中所见，似乎对于坏死和无坏死肿瘤两者，7.5mg药物/kg体重和10分钟照射提供最佳光动力治疗结果。图34A-34B中所示结果表明完全治愈无坏死MDA-MB-231-RFP肿瘤。治疗后1天检查出水肿，接着是轻微坏死，然后在4天后为更大规模的坏死。到第7天，观察到肿瘤变平(flattering)。PDT后90天伤口愈合，动物被治愈。如之前RFP荧光中所述，使用Xenogen系统，同样对结果进行了研究。90天后，没有肿瘤荧光信号。

表1：治疗MDA-MB-231-RFP肿瘤的PDT方案的结果

实施例16.在裸小鼠/大鼠乳房中建立局限性原位管癌(DCIS)模型

在小鼠和大鼠中使用若干细胞系来建立DCIS模型。首先，在大鼠乳房垫中等成功植入(同位)与F-344大鼠同源的MADB106细胞。迄今为止已使用该模型筛选用不同RGD-Bchl衍生物进行PDT随后发展为抗肿瘤、长期免疫力的功效。使用有关大鼠乳房癌肿瘤的同一方案，同位植入两个人细胞系和另一个小鼠细胞系，并获得在肺和淋巴节中转移。头两个细胞系hT47D和HCC1395为按照ATCC规程和文献(Gazdar等，1998)生长的腺管癌细胞系(HCC1395是1期原发腺管癌，这近可能地接近DCIS)，并作为同种异体移植物注射到裸动物的乳房垫。第三个(4T1)是将细胞注射到尾静脉后几周产生肺转移的小鼠乳房细胞系。这种细胞系的多样性使我们能够研究(Bchl衍生物/Bchl-RGD)-PDT对作为乳腺癌模型的原发病灶、局部复发病灶和乳腺癌远端转移的作用。4T1细胞用萤光素酶以及其它两种细胞系转染。4T1用pDsRed1-C1的转染目前正在进行当中。这类荧光能够：(1)评价使用基于Bchl-RGD的荧光或MRI检测的准确性；(2)以非常高的灵敏度及时监测对整个动物进行Bchl-PDT时肿瘤的生长和消退。

实施例17.建立作为一般概念的坏死蓄积概念

存在在发育时发生中心性坏死的肿瘤类型。选择两种这类肿瘤用于研究从下列细胞系中发生的肿瘤：人DCIS MCF7乳腺癌、人DCISMCF10DCIS(Tait等、2007)、人成胶质细胞瘤U87、人炎症性乳腺癌(IBC)WIBC-9(Shirakawa等、2001)和RCC。

按照上文材料与方法部分(iii)中所述，使用修饰的pDsRed-Monomer-Hyg-C1质粒和Lipofectamine^TM 2000转染试剂(Invitrogen^TM)对选定的细胞系进行转染。将细胞同位植入(1-5×10⁶细胞，按照各个细胞类型的要求)，如有可能，或经皮下植入CD-1裸小鼠内，使之生长到所需要的极限尺寸(约1cm³)并发生坏死。用组织学的方法跟踪坏死区。根据坏死区参数、生长率和成像，选择从上述细胞系开发的两个合适的肿瘤模型用于进一步研究。

对于整体荧光成像，如上所述使小鼠麻醉，将化合物13经静脉内注射到尾静脉(15mg/kg)。通过如上所述的成像系统(Xenogen)监测药物和肿瘤的荧光。

对于切离肿瘤荧光成像，经静脉内将15mg/kg化合物13小鼠注射到尾静脉。然后在不同时间点上处死小鼠，切离肿瘤，切成两半。按照上文中材料与方法部分(x)和(xi)，进行了切离肿瘤的成像及其用于评价坏死区的组织染色。预期化合物13在肿瘤中心性坏死区的蓄积不依赖于细胞系来源。

实施例18.与不同RGD部分缀合的化合物25的蓄积方式

为了进一步确立RGD寻靶的关系，使用不同的RGD肽和阴性对照研究在MDA-MB-231-RFP肿瘤中的蓄积方式。

把MDA-MB-231-RFP细胞同位植入(5×10⁶细胞)CD-1雌性裸小鼠中，使之生长到1cm³的坏死大小。将小鼠麻醉，并经静脉内将15mg/kg的化合物26(线性GRGDSP-2H-MLT)、化合物45(c(RADfK)-2H-MLT)和化合物36(c(RGDyK)₂-2H-MLT)注射到尾静脉。分别按上文材料与方法部分(vii)、(x)和(xi)中所述，进行了药物在整个动物中的体内荧光成像和切离肿瘤荧光成像及组织学分析。

实施例19.其它Bchl-RGD衍生物在坏死区的蓄积

为了研究坏死中的蓄积方式对于具有治疗和/或成像潜力的所有Bchl-RGD衍生物是否是一般范例，对另外的Bchl-RGD衍生物进行了研究。准确地讲，对化合物15(c(RGDfK)-Cu-MLT)和化合物14(c(RGDfK)-Mn-MLT)衍生物进行了研究。

将MDA-MB-231-RFP细胞同位植入(5×10⁶细胞)CD-1雌性裸小鼠中，并使之生长到1cm³的肿瘤大小。

在其中Bchl荧光因金属化(例如Cu和Mn)而被猝灭的情况下，按照Brandis等人(Brandis等，2005)所述方法，采用ELAN-6000仪器(Perkin Elmer，CT)，通过电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)测定了肿瘤和非肿瘤组织中的化合物浓度。

实施例20.生物分布测定法

该实验旨在定量测定在机体不同器官中药物扩散和蓄积的进程，以公正方式证实了药物事实上最终在肿瘤内蓄积。

经静脉内给带有MDA-MB-231-RFP肿瘤的麻醉小鼠注射化合物13，15mg/kg。在注射后的几个时间点处死小鼠。采集组织(血液、肾、肝、皮肤、脂肪、肌肉、脾、肠、脑、心脏、肺和肿瘤)，装入预称重小瓶中并冷冻。将组织样品匀浆，在甲醇(约1ml甲醇/100mg组织)中提取药物。然后通过荧光分析对样品的药物含量进行了分析。

通过荧光强度测量对化合物13在各种组织中的蓄积进行了定量测定，使用测定不同浓度化合物13的乙醇溶液的荧光强度获得校正曲线作为参比，对药物浓度进行了评价。将上述实施例3中获得的不同时间点的体内NIR荧光图像与生物分布测定法中提取物的荧光强度进行了比较。结果用来验证体内测量。

预期在体内和体外荧光测量值之间存在线性关系。还预期定量分析将更准确地表明肿瘤和正常组织中不同的蓄积和清除。这类测定法可能对临床领域十分有益。

实施例21.用于成像和治疗的具有放射性同位素的金属化RGD-细菌叶绿素衍生物

另一种治疗选择是药物的中心金属被放射性金属置换。其中M具有较长寿命的(对于疗法而言)的这类RGD-M-Bchl衍生物的蓄积可用于肿瘤的放射疗法。还可以其中药物以低浓度停留在体内但在坏死区越来越多地蓄积的这种间隔给予药物。

可通过本发明的发明人的实验室开发的方法，将Cu掺入药物中，使得2H-Bchl-RGD在环境温度下在10-20分钟内进行定量的金属化。所得化合物非常稳定，并且在生理条件下不会发生脱金属化。

预期可证实放射性化合物在肿瘤组织中蓄积，并且可在一次或两次治疗后观察到肿瘤消退。

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