动物血液样品中痕量烟草特有N-亚硝胺(TSNAs)的分析方法

摘要

一种动物血液样品中痕量烟草特有N-亚硝胺的分析方法，其特征在于：将动物血液样品放入加有EDTA-k2饱和水溶液的离心管内，10000rpm离心，取上层血浆加入NNN-d4、NNK-d4、NAT-d4、NAB-d4、NNAL-d3混合内标溶液，静置30min沉淀蛋白后，取上层液过滤，采用LC-MS/MS分析检测样品中烟草特有N-亚硝胺的含量。本发明的优点在于：能准确测定动物血液复杂基质样品中烟草特有N-亚硝胺(TSNAs)及其代谢物的含量，与现有技术相比具有操作简单，灵敏度高，结果可靠的特点，开创了一种新的用于动物血液复杂基质样品中烟草特有N-亚硝胺(TSNAs)及其代谢物测定的方法。

说明书

技术领域

本发明涉及动物血液复杂基质中烟草特有N-亚硝胺（TSNAs）的分析方法。该方法利用同位素标记物作为内标物，采用高效液相色谱-质谱（HPLC-MS/MS）对动物血液中痕量TSNAs及其代谢产物进行检测，揭示TSNAs在动物体内的代谢规律。

背景技术

吸烟与健康问题日益引起人们极大关注，烟叶和卷烟烟气中的一些有害成分，特别是具有强致癌性的烟草特有N-亚硝胺（TSNAs）,更加引起各国科学家们的极大关注[刘万峰，王应元．烟草中烟草特有亚硝胺的研究进展. 中国烟草科学, 2002，（2）:11-15]。研究TSNAs在动物体内的代谢产物和代谢过程，开展TSNAs的代谢历程研究，可为TSNAs的毒性抑制研究提供依据，为缓解吸烟与健康矛盾提供技术支持。

烟草中主要存在四种形式的N-亚硝胺：挥发性N-亚硝胺、非挥发性N-亚硝胺、烟草特有N-亚硝胺和亚硝化的氨基酸。卷烟烟气中已发现的亚硝胺达35种，而烟草特有N-亚硝胺的研究最早开始于20世纪60年代初期且最受关注，这是因为部分TSNAs具有致癌活性，它们对吸烟者和被动吸烟者的健康可能有不利影响。目前已经鉴定出8种TSNAs，其中N-亚硝基去甲基烟碱(NNN)、N’-亚硝基新烟草碱(NAT)、N-亚硝基假木贼碱（NAB）和4-(N-甲基亚硝基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)在烟草中的含量比其它几种TSNAs要高；现已证明NNN和NNK是TSNAs 中致癌性最强者，NNK及其主要代谢物4- (N-甲基-N-亚硝基氨基)-1-(3-吡啶基)-丁醇（NNAL）是目前为止烟气中发现的唯一胰腺癌致癌物。

对TSNAs的检测通常使用薄层色谱法、极谱法、紫外-可见分光光度法、液相色谱法和气相－热能分析检测法等[J.D. Adams, K.D. Brunnemann, D. Hoffmann. Chemical studies on tobacco smoke. LXXV. Rapid method for the analysis of tobacco-specific N-nitrosamines by gas-liquid chromatography with a thermal energy analyzer. J. Chromatogr.1983, 256:347.]。近年来液相色谱－质谱联用（HPLC-MSⁿ）方法[D. Kavvdias, G. Scherer, J. Shepperd, F. Cheung, G. Errington, M. McEwan. Dermination of tobacco-specific N-nitrosamines in urine of smokers and nonsmokers. The CORESTA Congress, Shanghai, China, 2008]开始应用于烟草和烟气中TSNAs及其代谢物的分离分析。由于复杂生物基质样品中TSNAs及其代谢物含量水平仅为ng级、甚至更低，因此应用液相色谱串联质谱法（HPLC-MSⁿ）进行测定具有很大的优势。但是HPLC-MS方法也存在一定缺陷，如在定量分析过程中由于内标物与待测物不一致，导致在样品前处理时待测物与内标物存在歧视现象，使得测定结果存在偏差，而选用同位素标记物作为内标物可以有效消除这种歧视现象，提高定量分析的准确度。

发明内容

本发明的目的正是针对上述现有技术所存在的问题，而专门开发的一种动物血液复杂基质中烟草特有N-亚硝胺（TSNAs）的分析方法，本方法针对上述不足之处，同时还可以大幅度减少样品收集后进行繁琐地固相萃取纯化、溶剂浓缩等过程，可以直接并准确的测定动物血液复杂基质中TSNAs的含量，该方法操作简单，灵敏度高，结果可靠。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：动物血液样品中痕量烟草特有N-亚硝胺的分析方法,将动物血液样品放入加有乙二胺四乙酸二钾（EDTA-k2）饱和水溶液的离心管内，10000 rpm离心，取上层血浆加入NNN-d4、NNK-d4、NAT-d4、NAB-d4、NNAL-d3混合内标溶液，静置30 min沉淀蛋白后，取上层液过滤，采用LC-MS/MS分析检测样品中烟草特有N-亚硝胺的含量。

该方法具体包括以下步骤：

a、动物血液样品收集；

b、混合内标溶液配制：以同位素标记物NNN-d4、NNK-d4、NAT-d4、NAB-d4、NNAL-d3作为内标物，配制浓度均为50 ng/mL的混合内标溶液。具体配制方式如下：准确称取NNN-d4、NNK-d4、NAT-d4、NAB-d4、NNAL-d3各10 mg, 分别置于5个1000 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得浓度为10 μg/mL的 NNN-d4、NNK-d4、NAT-d4、NAB-d4、NNAL-d3的内标储备溶液，各移取5 mL内标储备溶液置于一支1000mL容量瓶中，用50/50（体积比） 乙腈/水溶液稀释至刻度，摇匀，配制得浓度均为50 ng/mL的混合内标溶液。

c、混合标准溶液配制：分别称取NNN，NNK，NAT、NAB、NNAL，配制具有浓度梯度的NNN，NNK，NAT、NAB、NNAL系列混合标准溶液，并各加入1ml浓度为50ng/ml的混合内标溶液。具有浓度梯度的NNN，NNK，NAT、NAB、NNAL系列混合标准溶液具体配制方式如下：准确称取NNN，NNK，NAT、NAB、NNAL 各10 mg，分别置于5个100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得浓度为100 μg/mL的 NNN、NNK、NAT、NAB、NNAL的标准储备溶液。移取10 mL的NNN、NNK、NAT、NAB、NNAL标准储备溶液，均置于同一支100 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，得一级混合标准溶液；移取1 mL一级混合标准溶液，置于另一100 mL容量瓶中，用50/50（体积比） 乙腈/水溶液稀释至刻度，摇匀，得二级混合标准溶液；取0.01、0.10、0.50、1.00、2.00、5.00、10.0和25.0 mL二级混合标准溶液，分别置于100 mL容量瓶中，各加入1 mL二级混合内标溶液，用50/50（体积比） 乙腈/水溶液稀释至刻度，摇匀，得到浓度均为0.125、0.250、0.50、1.00、2.00、5.00、10.0和25.0 ng/mL 的NNN、NNK、NAT、NAB、NNAL系列混合标准溶液。

d、标准曲线绘制：将TSNAs系列（NNN，NNK，NAT、NAB、NNAL）标准溶液按由低到高浓度顺序进行HPLC-MS/MS分析，并以各TSNAs与其内标的峰面积比（Y）对其相应的浓度（X，ng/mL）进行线性回归分析，得到各TSNAs的工作曲线回归方程和相关系数；

e、样品前处理：将动物血液样品放入加有0.1 mL乙二胺四乙酸二钾（EDTA-k2）饱和水溶液的1.5 mL离心管内，10000 rpm离心，取上层血浆0.5 mL加入0.5 mL 浓度为50ng/ml的混合内标（NNN-d4、NNK-d4、NAT-d4、NAB-d4、NNAL-d3）溶液，静置30 min沉淀蛋白后，取上层液过滤，进行HPLC-MS/MS分析；

f、数据处理和分析，对动物血液中痕量TSNAs及其代谢产物进行检测，揭示TSNAs在动物体内的代谢规律。

本发明依据的测试原理在于：将动物血液样品直接进行处理，然后加入同位素标记物内标溶液，进行HPLC-MS/MS分析，测定动物血液复杂基质样品中烟草特有N-亚硝胺（TSNAs）及其代谢物的含量，揭示TSNAs在动物体内的代谢规律。

这一实验设计能准确测定动物血液复杂基质样品中烟草特有N-亚硝胺（TSNAs）及其代谢物的含量，与现有技术相比具有操作简单，灵敏度高，结果可靠的特点，开创了一种新的用于动物血液复杂基质样品中烟草特有N-亚硝胺（TSNAs）及其代谢物测定的方法。

 

附图说明

图1 为实施例1中的动物血液中NNN的浓度随时间变化趋势图。

图2为实施例1的动物血液中NNK的浓度随时间变化趋势图。

图3为实施例1的动物血液中NAT的浓度随时间变化趋势图。

图4为实施例1的动物血液中NAB的浓度随时间变化趋势图。

图5为实施例1的动物血液中NNAL的浓度随时间变化趋势图。

图6为实施例2中的动物血液中NNN的浓度随时间变化趋势图。

图7为实施例2的动物血液中NNK的浓度随时间变化趋势图。

图8为实施例2的动物血液中NAT的浓度随时间变化趋势图。

图9为实施例2的动物血液中NAB的浓度随时间变化趋势图。

图10为实施例2的动物血液中NNAL的浓度随时间变化趋势图。

图11为实施例3中的动物血液中NNN的浓度随时间变化趋势图。

图12为实施例3的动物血液中NNK的浓度随时间变化趋势图。

图13为实施例3的动物血液中NAT的浓度随时间变化趋势图。

图14为实施例3的动物血液中NAB的浓度随时间变化趋势图。

图15为实施例3的动物血液中NNAL的浓度随时间变化趋势图。

具体实施方式

本发明结合以下实施例做进一步描述，但并不限制本发明。

实施例1

购买5只雄性日本大耳朵白兔，要求体重3-4千克，健康无病，灌胃给药前禁食12小时，一次给药量：NNK 1.5 mg，NNN 1.02 mg，NAT 1.05 mg，NAB 1.26 mg。给药后开始计时，采用耳缘静脉的采血方式，每10 min采血样1 mL，连续采血10次，血液样品放入加有0.1 mL乙二胺四乙酸二钾（EDTA-k2）饱和水溶液的1.5 mL离心管内，10000 rpm离心，取上层血浆0.5 mL加入0.5 mL 1 ng/mL的内标乙腈溶液，静置30 min后，过滤，LC-MS/MS分析检测。

色谱条件

色谱柱：Agilent Extend-C18柱 (100×4.6mm i.d., 1.8 μm，美国)。

柱温：50 ℃；流动相：A：水（含0.1%甲酸铵，质量分数），B：乙腈（含0.1%甲酸，体积分数）；流速：0.2 mL/min；梯度洗脱条件见表1；进样量：10 μL；柱平衡时间为6min。

质谱条件

离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描模式：正离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM）；电喷雾电压（Ion Spray Voltage,IS）：5000V；雾化气（GS1,N2）：55psi；辅助加热气流速（GS2,N2）：50psi；气帘气流速（Curtain gas, CUR,N2）：15psi；碰撞气流速（Collision gas, CAD，N2）：6psi；离子源温度（TEM）：550℃；扫描时间（Dwell Time）：50ms；EP（Entrance Potential）：10V；CXP（Collision Cell Exit Potential）：9V，各TSNAs的多反应监测（MRM）参数见表2。

标准曲线建立

准确称取NNN，NNK，NAT、NAB、NNAL 各10 mg，分别置于5个100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得浓度为100 μg/mL的 NNN、NNK、NAT、NAB、NNAL的标准储备溶液。移取10 mL的NNN、NNK、NAT、NAB、NNAL标准储备溶液，均置于同一支100 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，得一级混合标准溶液；移取1 mL一级混合标准溶液，置于另一100 mL容量瓶中，用50/50（体积比） 乙腈/水溶液稀释至刻度，摇匀，得二级混合标准溶液；同理，配制得浓度均为50 ng/mL的NNN-d4、NNK-d4、NAT-d4、NAB-d4、NNAL-d3二级混合内标甲醇溶液。取0.01、0.10、0.50、1.00、2.00、5.00、10.0、25.0 mL二级混合标准溶液，分别倾入100 mL容量瓶中，各加入1 mL二级混合内标溶液，用50/50（体积比） 乙腈/水溶液稀释至刻度，摇匀，得到浓度均为0.125、0.250、0.50、1.00、2.00、5.00、10.0、25.0 ng/mL NNN、NNK、NAT、NAB、NNAL系列混合标准溶液。将TSNAs系列标准溶液按由低到高浓度顺序进样分析，并以各TSNAs与其内标的峰面积比（Y）对其相应的浓度（X，ng/mL）进行线性回归分析，得到各TSNAs的工作曲线回归方程和相关系数见表3。

测定结果：将样品测定的分析物实际峰面积与内标峰面积比，与相应得线性回归方程进行拟和，计算出分析物的含量见表4。

实施例2

本实施例基本同于实施例1，仅是对动物给药量不同，为NNK 1.05 mg，NNN 0.5 mg，NAT 0.52 mg，NAB 0.56，结果见表5。

实施例3

本实施例基本同于实施例1，仅是对动物给药量不同，为NNK 2.05 mg，NNN 1.51 mg，NAT 1.45 mg，NAB 1.58，结果见表6。