一株具有双重噬菌体抗性的L-苯丙氨酸生产菌及其选育方法

摘要

本发明对容易受到噬菌体污染的WSH-Z06的宿主菌分别进行紫外线诱变处理、噬菌体淘汰培养，筛选到一株具有BP-1和BP-2双重抗性的大肠杆菌宿主菌，随后用编码L-苯丙氨酸合成酶基因的质粒(pAP-B03)转化宿主菌，得到抗噬菌体L-苯丙氨酸生产菌WSH-BR165(pAP-B03)；本发明将传统紫外诱变育种的优点与分子生物学改造的优点相结合，通过噬菌体淘汰培养的方法，高效率地筛选并构建出一株具有噬菌体BP-1、BP-2抗性的L-苯丙氨酸生产菌。

说明书

技术领域

本发明涉及一种具有双重噬菌体抗性的微生物及其选育方法，属于生物工程技术领域。 

背景技术

噬菌体污染是影响氨基酸发酵生产的关键因素之一。如果在生产中受到噬菌体的污染，会影响生产率，从而影响企业效益。其来源很多，在相对较长的发酵周期中，无论哪个环节发生污染，都会对整个过程造成影响。多年来，企业在噬菌体在生产过程对噬菌体的防治上积累了大量的经验，但选育抗噬菌体的生产菌株才是最有效的方法。 

本实验室前期开发了一株L-苯丙氨酸生产菌WSH-BR42(CCTCC M 2010008)，该菌株具有噬菌体BP-1(CCTCC M 2010054)抗性，但在实际生产中发现该菌种又受到了噬菌体BP-2(CCTCC M 2010055)的污染。 

利用诱变手段筛选抗噬菌体的菌株是选育抗性菌株的方法之一。由于现在所知的诱变方法已有很多，其对机理方面的要求也不高，人们在对诱变方法的选用上已有了很多的经验。但往往用诱变手段选育菌种具有一定的盲目性，是一件耗时耗力的工作。在筛选抗噬菌体抗性的大肠杆菌方面，本发明提出在诱变后培养阶段利用噬菌体淘汰培养的方法，就如何快速有效的获得目的菌株而言提供了一条新的途径。 

发明内容

本发明所要解决的一个技术问题是提供一株重组大肠杆菌WSH-BR165（pAP-B03），该菌株具有对重组大肠杆菌易感染噬菌体BP-1（CCTCC M 2010054，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2010年3月15日，地址：中国武汉，武汉大学，分类学命名为：大肠杆菌噬菌体（Bacteriophage））和BP-2的（CCTCC M 2010055，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2010年3月15日，地址：中国武汉，武汉大学，分类学命名为：大肠杆菌噬菌体（Bacteriophage））双重抗性；含有重组质粒，质粒上携带L-苯丙氨酸合成酶基因，现已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间2010年1月18日，地址：中国武汉，武汉大学，分类学命名为：大肠杆菌（Escherichia coli），保藏编号为 CCTCC M 2010013。 

所述噬菌体BP-1来源于本实验室前期开发的L-苯丙氨酸生产菌WSH-ZH06(含重组质粒pAP-B03，CCTCC M 2010009)受到噬菌体污染的裂解液，噬菌体BP-1已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间2010年3月15日，保藏编号为CCTCC M 2010054；噬菌体BP-2来源于本实验室开发的L-苯丙氨酸生产菌WSH-BR42(含重组质粒pAP-B03，CCTCCM 2010008)受到噬菌体污染的裂解液，WSH-BR42具有噬菌体BP-1的抗性，但不具有噬菌体BP-2的抗性，噬菌体BP-2已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间2010年3月15 日，保藏编号为CCTCC M 2010055。 

所述重组质粒为pAP-B03，其上携带L-苯丙氨酸合成的关键酶CM/PDT和DS的基因pheA^fbr和aroF，其中pheA^fbr基因来源于E.coli K12的突变株，aroF来源于E.coli K12(Enhanced L-phenylalanine biosynthesis by co-expression of pheA^fbr and aroF^wt.HaiyanZhou，Xianyan Liao，Tianwen Wang，Guocheng Du，Jian Chen.Bioresource Technology)。 

本发明所要解决的另外一个技术问题是提供了一种紫外线诱变育种、噬菌体淘汰培养以及分子生物学改造相结合的L-苯丙氨酸生产菌的选育方法。 

为解决上述技术问题，对容易受到噬菌体污染的WSH-Z06的宿主菌(EnhancedL-phenylalanine biosynthesis by co-expression of pheA^fbr and aroF^wt.Haiyan Zhou，XianyanLiao，Tianwen Wang，Guocheng Du，Jian Chen.Bioresource Technology)分别进行紫外线诱变处理、噬菌体淘汰培养，筛选到一株具有BP-1和BP-2双重抗性的大肠杆菌宿主菌，随后用编码L-苯丙氨酸合成酶基因的质粒(pAP-B03)转化上述大肠杆菌宿主菌，得到具有双重噬菌体抗性的L-苯丙氨酸生产菌WSH-BR165(pAP-B03)。 

所述紫外线诱变处理，具体方法为培养WSH-Z06的宿主菌，离心、洗涤菌体后在紫外照射10-60s进行诱变处理。 

所述噬菌体淘汰培养，具体方法为在紫外线诱变处理后，红灯下在培养皿中分别吸取一定含量菌液于装有30mL LB培养基和各1mL效价为10¹⁰pfu/mL的噬菌体BP-1和BP-2裂解液的三角瓶中培养6h，使得诱变后不具有噬菌体抗性的菌被淘汰，具有双重噬菌体抗性的菌得到富集。 

所述噬菌体抗性筛选，具体方法为：离心、收集、培养诱变后的菌体，挑取形态、大小、颜色各不相同的菌落逐一涂布单层平板，然后在平板的4个象限处分别各滴加5μL噬菌体BP-1和BP-2的裂解液，做好标记，培养24h后，挑取在4处滴加噬菌体的地方均没有出现噬菌斑的菌株。 

所述噬菌体裂解液BP-1，取样于受噬菌体污染的WSH-Z06(pAP-B03)发酵液，经过分离、培养后获得，具体方法为：发酵液离心后的上清液经0.22μm微孔滤膜过滤除菌，取出一定上清液放入装有肉膏蛋白胨培养基的试管中，同时加入一定量的WSH-Z06(pAP-B03)菌悬液，培养一段时间，待长出单个噬菌斑后，用接种针穿刺法挑取形态、大小不一的单个空斑分别接入含有敏感菌WSH-Z06的液体培养基中，37℃振荡培养16-24h。 

所述噬菌体裂解液BP-2，取样于受噬菌体污染的WSH-BR42(pAP-B03)发酵液，经过分离、培养后获得，具体方法为：发酵液离心后的上清液经0.22μm微孔滤膜过滤除菌，取出 一定上清液放入装有肉膏蛋白胨培养基的试管中，同时加入一定量的WSH-BR42(pAP-B03)菌悬液，培养一段时间，待长出单个噬菌斑后，用接种针穿刺法挑取形态、大小不一的单个空斑分别接入含有敏感菌WSH-Z06的液体培养基中，37℃振荡培养16-24h。 

所述噬菌体抗性检测培养基，采用肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，葡萄糖10g/L，NaCl 5g/L)，pH 7.0-7.2，琼脂2％。 

所述抗噬菌体L-苯丙氨酸生产菌，其优选培养基组成为： 

(1)种子培养基： 

使用LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L)，pH 7.0，固体培养基加2％的琼脂。 

(2)发酵培养基(g/L)： 

葡萄糖25，L-酪氨酸0.4，碳酸钙12.5，七水合硫酸镁3.0，二水合氯化钙0.015，磷酸二氢钾3.0，氯化钠1.0，硫酸铵5.0，七水合硫酸亚铁0.075，柠檬酸钠1.0，硫胺素(thiamine·HCl)0.075，硫酸卡那霉素0.04，微量元素溶液(TES)1.5mL/L，pH 7.0。 

TES溶液(g/L)：Al₂(SO₄)₃·18H₂O 2.0，CoSO₄·7H₂O 0.75，CuSO₄·5H₂O 2.5，H₃BO₃0.5，MnSO₄·H₂O 24，Na₂MoO₄·2H₂O 3.0，NiSO₄·6H₂O 2.5，ZnSO₄·7H₂O 15，用1N的HCl溶解。 

所述抗噬菌体L-苯丙氨酸生产菌，其发酵罐培养方法为： 

将37℃、200rpm下培养12h的种子以10％的接种量分别接入3L发酵罐中，发酵培养基体积为1.5L，通气量为1vvm，搅拌转速为400rpm，待DO降至20％，通过调节搅拌转速和通气量维持DO在20％以上；温度设定在33℃，菌体浓度达到OD₆₁₀＝3时，升温至37℃，用28％氨水控制pH在7.0左右，使用流加700g/L的葡萄糖溶液的方式维持培养基中残余葡萄糖浓度在5g/L左右。 

细胞干重(DCW)的测定方法为：取一定量的菌悬液置于10mL容量瓶中，加去离子水定容，摇匀，用722型可见分光光度计，于610nm处比色测OD值，利用细胞干重标准曲线算得细胞干重，若测摇瓶发酵培养中的菌体浓度则在定容前加2mL 2N的盐酸溶解菌悬液中的碳酸钙。 

L-苯丙氨酸浓度的测定方法采用氨基酸常用测定方法，高效液相色谱(HPLC)柱前衍生化方法进行测定(Rapid，accurate，sensitive，and reproducible HPLC analysis of aminoacids.Henderson，J.W.，Rieker，R.D.，Bidlingmeyer，B.A.，Woodward，C.，Agilent Technologies，USA，2000)。 

有益效果： 

本发明将传统紫外诱变育种的优点与分子生物学改造的优点相结合，通过噬菌体淘汰培养的方法，高效率地筛选并构建出一株具有噬菌体BP-1、BP-2抗性的L-苯丙氨酸生产菌；与之前的L-苯丙氨酸生产菌株相比，可以抵抗两种大肠杆菌噬菌体的感染，且细胞生长速度和L-苯丙氨酸产量不受影响，并且具有良好的遗传稳定性，提高了L-苯丙氨酸生产企业的经济效益。 

具体实施方式

实施例一：噬菌体BP-1的分离纯化 

菌株： 

本实验室前期开发的L-苯丙氨酸生产菌重组大肠杆菌WSH-Z06(pAP-B03)，保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏编号为CCTCC M 2010009。 

取某工厂受到噬菌体感染的重组大肠杆菌WSH-Z06(pAP-B03)发酵液4mL，8000rpm离心10min后，上清液经0.22μm微孔滤膜过滤除菌，取出100μL到50℃装有6mL上层肉膏蛋白胨培养基的试管中，同时加入WSH-Z06(pAP-B03)菌悬液100μL，立即混匀，倒入已凝固的底层培养基上，铺匀，置37℃培养箱内培养16-24h。待长出单个噬菌斑后，用接种针穿刺法挑取形态、大小不一的单个空斑分别接入含有WSH-Z06(pAP-B03)的液体培养基中，37℃振荡培养16-24h。重复上述步骤进行噬菌斑形态、大小的检验，直至得到纯化的噬菌体。 

噬菌体分离纯化培养基：肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，葡萄糖10g/L，NaCl 5g/L，pH 7.0-7.2，上层琼脂0.8％，下层琼脂2％)。 

噬菌体BP-1已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2010054。 

实施例二：噬菌体BP-2的分离纯化 

菌株： 

本实验室前期开发的L-苯丙氨酸生产菌重组大肠杆菌WSH-BR42(pAP-B03)，保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏编号为CCTCC M 2010008。 

取某工厂受到噬菌体感染的重组大肠杆菌WSH-BR42(pAP-B03)发酵液4mL，8000rpm离心10min后，上清液经0.22μm微孔滤膜过滤除菌，取出100μL到50℃装有6mL上 层肉膏蛋白胨培养基的试管中，同时加入WSH-BR42(pAP-B03)菌悬液100μL，立即混匀，倒入已凝固的底层培养基上，铺匀，置37℃培养箱内培养16-24h。待长出单个噬菌斑后，用接种针穿刺法挑取形态、大小不一的单个空斑分别接入含有WSH-BR42(pAP-B03)的液体培养基中，37℃振荡培养16-24h。重复上述步骤进行噬菌斑形态、大小的检验，直至得到纯化的噬菌体。 

噬菌体分离纯化培养基：肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，葡萄糖10g/L，NaCl 5g/L，pH 7.0-7.2，上层琼脂0.8％，下层琼脂2％)。 

噬菌体BP-2已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2010055。 

实施例三：紫外线诱变育种、噬菌体淘汰培养以及双抗性的筛选 

菌株： 

大肠杆菌宿主菌WSH-ZH06(前期构建，Enhanced L-phenylalanine biosynthesis byco-expression of pheA^fbr and aroF^wt.Haiyan Zhou，Xianyan Liao，Tianwen Wang，GuochengDu，Jian Chen.Bioresource Technology) 

从斜面上接一环大肠杆菌宿主菌WSH-ZH06菌种入LB种子培养基中(25mL/250mL锥形瓶)，在37℃、200rpm的条件下培养12h后，离心收集菌体，用生理盐水洗涤三次。取适量菌悬液于六只内置磁力搅拌子的培养皿中，放入紫外诱变箱(紫外灯与菌液距离为30cm，紫外灯为15瓦特)，分别在紫外灯下照射10s，20s，30s，40s，50s及60s。在红灯下，在每只培养皿中分别吸取1mL菌液于装有30mLLB和各1mL效价为10¹⁰pfu/mL的两种噬菌体裂解液的三角瓶中间培养6h，而后稀释、涂布LB平板，置于37℃培养箱中培养过夜，挑取形态、大小、颜色各不相同的菌落逐一涂布单层平板，然后在平板的4个象限处分别各滴加5μl噬菌体BP-1和BP-2裂解液，做好标记，培养24h后，挑取在4处滴加噬菌体的地方均没有出现噬菌斑的菌株6株，将每株菌分别在斜面培养基上连续传代10次，再分别检测各菌株每一代的噬菌体抗性，结果选出噬菌体抗性遗传稳定的菌株1株，命名为WSH-BR165。 

实施例四：将质粒转入具有双重噬菌体抗性的大肠杆菌 

菌株： 

具有噬菌体BP-1、BP-2双重抗性的大肠杆菌宿主菌WSH-BR165 

质粒： 

pAP-B03为本实验室自行构建(详见参考文献Enhanced L-phenylalanine biosynthesis byco-expression of pheA^fbr and aroF^wt.Haiyan Zhou，Xianyan Liao，Tianwen Wang，GuochengDu，Jian Chen.Bioresource Technology，2010，1) 

采用电转化的方法对大肠杆菌突变株WSH-BR165进行转化质粒pAP-B03。将WSH-BR165的对数期培养液100mL先用等量的水洗涤三次，再用等量的10％甘油洗涤三次，最后用1mL的10％甘油悬浮菌体。向电转化杯中加入50μl的菌悬液，再加入5μl的质粒，向电转杯提供2.5KV的电压5ms，立刻在电转杯中加入1mL的LB培养基，混匀后转入1.5mL的离心管里于37℃、200rpm条件下培养2h后，涂布含有硫酸卡那霉素的LB平板，置于37℃培养箱中培养过夜。待有单菌落长出，得到具有双重噬菌体抗性的L-苯丙氨酸生产菌WSH-BR165(pAP03)，将其接入含有硫酸卡那霉素的LB斜面上保藏备用。 

WSH-BR165(pAP03)已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2010013。 

实施例四：在添加噬菌体BP-2裂解液的条件下，WSH-BR165(pAP03)与WSH-BR42(pAP-B03)以及WSH-Z06(pAP-B03)产L-苯丙氨酸能力的比较 

菌株： 

WSH-BR165(pAP03)、WSH-ZH06(pAP03)、WSH-BR42(pAP-B03) 

优选培养基组成为： 

(1)种子培养基： 

使用LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L)，pH 7.0，固体培养基加2％的琼脂。 

(2)发酵培养基(g/L)： 

葡萄糖25，L-酪氨酸0.4，碳酸钙12.5，七水合硫酸镁3.0，二水合氯化钙0.015，磷酸二氢钾3.0，氯化钠1.0，硫酸铵5.0，七水合硫酸亚铁0.075，柠檬酸钠1.0，硫胺素(thiamine·HCl)0.075，硫酸卡那霉素0.04，微量元素溶液(TES)1.5mL/L，pH 7.0。 

TES溶液(g/L)：Al₂(SO₄)₃·18H₂O 2.0，CoSO₄·7H₂O 0.75，CuSO₄·5H₂O 2.5，H₃BO₃0.5，MnSO₄·H₂O 24，Na₂MoO₄·2H₂O 3.0，NiSO₄·6H₂O 2.5，ZnSO₄·7H₂O 15，用1N的HCl溶解。 

3L发酵罐中发酵培养基体积为1.5L，通气量为1vvm，搅拌转速为400rpm，待DO降至20％，通过调节搅拌转速和通气量维持DO在20％以上；温度设定为33℃，菌体浓度 达到OD₆₁₀＝3时，升温至37℃，用28％氨水控制pH在7.0左右，使用流加700g/L的葡萄糖溶液的方式维持培养基中残余葡萄糖浓度在5g/L左右，发酵至L-苯丙氨酸产量达到最大，结果见表一。 

表一 

表一数据表示，经过诱变后，虽然重组大肠杆菌L-苯丙氨酸产量略微降低，但发酵时间有所缩短，生产强度总体不变，并且具有了噬菌体BP-1和BP-2抗性。 

实施例五：在添加噬菌体BP-1和BP-2裂解液的条件下，WSH-BR165(pAP03)产L-苯丙氨酸能力的验证 

菌株： 

噬菌体BP-1，保藏编号为CCTCC M 2010054；噬菌体BP-2，保藏编号为CCTCC M2010055；WSH-BR165(pAP03)保藏编号为CCTCC M 2010013。 

3L发酵罐中发酵培养基(分别添加0.5％(v/v)的效价为10¹⁰PFU/mL的噬菌体BP-1和BP-2的裂解液)体积为1.5L。通气量为1vvm，搅拌转速为400rpm，待DO降至20％，通过调节搅拌转速和通气量维持DO在20％以上；温度设定为33℃，菌体浓度达到OD₆₁₀＝3时，升温至37℃，用28％氨水控制pH在7.0左右，使用流加700g/L的葡萄糖溶液的方式维持培养基中残余葡萄糖浓度在5g/L左右，发酵48小时，L-苯丙氨酸产量达到48g/L。