褐飞虱体内类酵母共生菌的离体培养方法以及专用培养基

摘要

褐飞虱体内类酵母共生菌的离体培养方法以及专用培养基，属于微生物培养技术领域。其专用培养基包括31种褐飞虱类酵母共生菌所需的营养物质；其培养方法包括褐飞虱成虫饲养、褐飞虱卵巢处理、培养液的制备及离体培养等。运用本发明的培养方法，从褐飞虱体内分离到两株类酵母菌株，为进一步研究类酵母共生菌的遗传学背景，类酵母共生菌与寄主褐飞虱之间相互利用营养关系以及改造共生菌以控制褐飞虱的为害提供基础。并且本发明中涉及的专用培养基配伍合理，为离体继代培养褐飞虱类酵母共生菌提供必要的营养基础。本发明的方法也为其他同翅目昆虫体内类酵母共生菌的分离培养提供了技术支撑。

说明书

技术领域

本发明属于微生物培养技术领域，具体涉及褐飞虱体内类酵母共生菌的离体培养方法以及专用培养基。

背景技术

褐飞虱Nilaparvata lugens St?l是我国及东南亚国家水稻生产上的一种重要远距离迁飞性害虫，严重威胁我国水稻的安全生产，在我国每年发生面积约1300-2000万hm²，约占水稻种植面积的50%，年均损失稻谷10-15亿kg。种植抗虫品种和使用化学杀虫剂是控制褐飞虱为害最为经济有效的防治方法，但由于抗虫品种的大面积种植以及化学杀虫剂的大量使用，导致田间褐飞虱新致害性的出现和抗药性的产生。研究表明，同翅目昆虫，如飞虱、蚜虫、叶蝉等体内普遍存在共生菌，这些共生菌与寄主昆虫互惠互利、协同进化，在昆虫的生长发育、繁殖过程中起着十分重要的作用。褐飞虱共生菌是一种类酵母菌（yeast-like symbiotes，简称YLS），隶属于子囊菌亚门核菌纲的假丝酵母属（Candida），通常存在于腹部脂肪体内，呈长梭形、杆状、卵形和球状，营芽孢生殖，并以卵母细胞垂直传递的方式直接传给子代。这些共生菌在褐飞虱致害性变异、胚胎腹节分化、体内甾醇类物质代谢、氨基酸和维生素合成与供给、氮素循环和蛋白质合成等过程中起重要的作用。褐飞虱体内共生菌种群存在多样性和动态变化以及在外界逆境条件下共生菌可以发生遗传变异。取食抗虫品种以及农药、高温、抗生素等方法处理褐飞虱导致体内共生菌数量显著下降。共生菌遗传基因的易变性使其遗传背景容易发生变化或突变。在褐飞虱适应抗虫品种、形成新致害性种群的过程中，共生菌的遗传物质可能已发生了变异。此种变异可能导致褐飞虱对水稻抗性品种致害性发生改变。因此，在褐飞虱致害性变异过程中，类酵母共生菌可能起着比寄主本身更为重要的作用。由于类酵母共生菌属于单细胞生物，在进行基因工程改造时比对宿主昆虫进行操作要方便的多。因而利用基因工程方法转化类酵母共生菌，降低其在宿主营养及生殖方面所起的作用，不仅可以降低褐飞虱的发生率，找出产生褐飞虱致害性的变化位点，而且可以减少植物病毒的传播。建立褐飞虱类酵母共生菌离体培养技术为转化类酵母共生菌遗传学背景，使其在与抗虫水稻品种的互作中，遗传学背景不易发生变化，为延长抗虫水稻品种的田间使用寿命等试验的进一步开展奠定了基础。由于类酵母共生菌和宿主褐飞虱相互融合，采用分离宿主脂肪体细胞进行培养的方法很难排除来自虫体内环境的污染，昆虫体内类酵母共生菌的离体培养在褐飞虱（Socho等，1981）和烟草窃蠹（Noda等，1996）上虽有报道，但两者均采用虫体进行培养的方法，易造成污染，也未提及具体的培养基配方，且不能获得体外继代培养共生菌的目的。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种褐飞虱类酵母共生菌的离体培养方法及其专用培养基的技术方案，该发明能够获得褐飞虱体外继代培养的类酵母共生菌菌株，为研究褐飞虱适应抗虫品种过程中类酵母共生菌的遗传学背景以及改造共生菌控制褐飞虱的为害提供基础。

所述的培养褐飞虱体内类酵母共生菌的专用培养基，其特征在于包括以下重量配比的组份：

L－天冬氨酸 10－50mg/L、L－精氨酸－氢氧化物10－100mg/L、L－天冬酰氨酸10－50 mg/L、L－丙氨酸10－50 mg/L、B－丙氨酸10－50 mg/L、L－胱氨酸－氢氧化物1－5 mg/L、L－谷氨酸10－100 mg/L、L-谷酰氨酸10－100 mg/L、L－氨基乙酸10－100 mg/L、L－组氨酸100－500 mg/L、L－异亮氨酸1－10 mg/L、L－亮氨酸1－10 mg/L、L－赖氨酸－氢氧化物50－100 mg/L、L－甲硫氨酸1－10 mg/L、L－脯氨酸10－50 mg/L、L－苯丙氨酸10－50 mg/L、DL－丝氨酸50－150 mg/L、L－酪氨酸1－10 mg/L、L－色氨酸5－50 mg/L、L－苏氨酸10－50 mg/L、L－缬氨酸5－50 mg/L、葡萄糖10－100 mg/L、链霉素硫酸盐5－50 mg/L、苹果酸50－100 mg/L、α－酮戊二酸10－50 mg/L、琥珀酸1－10 mg/L、反丁烯二酸1－10 mg/L、核黄素0.001－1 mg/L、泛酸钙0.001－1mg/L、叶酸0.001－1mg/L和烟酸0.001－1mg/L。

所述的培养褐飞虱体内类酵母共生菌的专用培养基，其特征在于包括以下重量配比的组份：

L－天冬氨酸 20－40mg/L、L－精氨酸－氢氧化物20－80mg/L、L－天冬酰氨酸20－40mg/L、L－丙氨酸20－40 mg/L、B－丙氨酸20－40 mg/L、L－胱氨酸－氢氧化物2－4 mg/L、L－谷氨酸20－80 mg/L、L－谷酰氨酸20－80 mg/L、L-氨基乙酸20－80 mg/L、L－组氨酸200－400 mg/L、L－异亮氨酸2－8 mg/L、L－亮氨酸2－8 mg/L、L－赖氨酸－氢氧化物60－90 mg/L、L－甲硫氨酸2－8mg/L、L－脯氨酸20－40 mg/L、L－苯丙氨酸20－40 mg/L、DL－丝氨酸60－140 mg/L、L－酪氨酸2－8 mg/L、L－色氨酸10－40 mg/L、L－苏氨酸20－40 mg/L、L－缬氨酸10－40 mg/L、葡萄糖20－80 mg/L、链霉素硫酸盐10－40 mg/L、苹果酸60－90 mg/L、α－酮戊二酸20－40 mg/L、琥珀酸2－8 mg/L、反丁烯二酸2－8 mg/L、核黄素0.005－0.5 mg/L、泛酸钙0.005－0.5mg/L、叶酸0.005－0.5mg/L和烟酸0.005－0.5mg/L。

所述的培养褐飞虱体内类酵母共生菌的专用培养基，其特征在于包括以下重量配比的组份：

L－天冬氨酸 25－35mg/L、L－精氨酸－氢氧化物30－70mg/L、L－天冬酰氨酸25－35mg/L、L－丙氨酸25－35 mg/L、B－丙氨酸25－35 mg/L、L－胱氨酸－氢氧化物2－3 mg/L、L－谷氨酸30－70 mg/L、L－谷酰氨酸30－70 mg/L、L-氨基乙酸30－70 mg/L、L－组氨酸250－350 mg/L、L－异亮氨酸3－7 mg/L、L－亮氨酸3－7 mg/L、L－赖氨酸－氢氧化物70－80 mg/L、L－甲硫氨酸3－7mg/L、L－脯氨酸25－35 mg/L、L－苯丙氨酸25－35 mg/L、DL－丝氨酸70－130 mg/L、L－酪氨酸3－7 mg/L、L－色氨酸20－30 mg/L、L－苏氨酸25－35 mg/L、L－缬氨酸20－30 mg/L、葡萄糖30－70 mg/L、链霉素硫酸盐20－30 mg/L、苹果酸70－80 mg/L、α－酮戊二酸25－35 mg/L、琥珀酸3－7 mg/L、反丁烯二酸3－7 mg/L、核黄素0.01－0.1 mg/L、泛酸钙0.01－0.1mg/L、叶酸0.01－0.1mg/L和烟酸0.01－0.1mg/L。

所述的专用培养基离体培养褐飞虱体内类酵母共生菌的方法，其特征在于包括以下工艺步骤：

1）取褐飞虱在温度25-30℃，相对湿度70-90%，光照时间10-16小时，光照强度6000-8000 LUX下，用感虫水稻品种进行饲养；

2）将上述饲养的褐飞虱雌成虫在羽化后24-72h内取出，于75％酒精中消毒1-5分钟后，解剖腹部取出卵巢，并将卵巢用无菌水冲洗后浸没于75％酒精中；

3）取30-50头上述得到的卵巢，用75％酒精消毒后，于-196℃液氮中快速匀浆，得到匀浆液；

4）在步骤3）得到的匀浆液中加入5-15ml无菌水，配置成溶液，经孔径0.1-0.45μm 的millipor滤膜过滤后待用，为溶液Ⅰ；

5）将上述的专用培养基的各组分按所述的比例称量后，溶解于水中，经孔径0.1-0.45μm 的millipor滤膜过滤灭菌后待用，为溶液Ⅱ；

6）称取琼脂，将琼脂与水按重量比为16-22：1000混合后，加热、熔化，高压灭菌待用；

7）取溶液Ⅰ、溶液Ⅱ各1ml注入高温灭菌的平皿中，再倒入冷却至50-60℃步骤6）制得的琼脂5-10ml中，使三者均匀混合，然后接种褐飞虱体内类酵母共生菌，在温度25-30℃，湿度80-100％条件下进行离体培养。

所述的褐飞虱体内类酵母共生菌的离体培养方法，其特征在于所述的步骤1）中褐飞虱在人工智能培养箱中用养虫笼饲养，饲养条件为：温度27-28℃，相对湿度75-85%，光照时间12-14小时，光照强度7000-8000 LUX，所用感虫水稻品种为感虫TN1品种。

所述的褐飞虱体内类酵母共生菌的离体培养方法，其特征在于所述的步骤2）中褐飞虱雌成虫在羽化后30-60h内取出。

所述的褐飞虱体内类酵母共生菌的离体培养方法，其特征在于所述的步骤4）中匀浆液中加入8-10ml无菌水，用孔径0.2-0.35μm 的millipor滤膜过滤。

所述的褐飞虱体内类酵母共生菌的离体培养方法，其特征在于所述的步骤5）中专用培养基的各组分按所述的比例称量后，溶解于水中，经孔径0.2-0.35μm的millipor滤膜过滤。

所述的褐飞虱体内类酵母共生菌的离体培养方法，其特征在于所述的步骤6）中琼脂与水按重量比为18-20：1000混合。

所述的褐飞虱体内类酵母共生菌的离体培养方法，其特征在于所述的步骤7）中褐飞虱体内类酵母共生菌在温度27-28℃，湿度80-90％条件下进行离体培养。

上述的一种褐飞虱类酵母共生菌的离体培养方法，设计合理，运用本发明的培养方法，从褐飞虱体内分离到两株类酵母菌株，为进一步研究类酵母共生菌的遗传学背景，类酵母共生菌与寄主褐飞虱之间相互利用营养关系以及改造共生菌以控制褐飞虱的为害提供基础。并且本发明中涉及的专用培养基配伍合理，为离体继代培养褐飞虱类酵母共生菌提供必要的营养基础。本发明的方法也为其他同翅目昆虫体内类酵母共生菌的分离培养提供了技术支撑。

附图说明

图1为褐飞虱体内类酵母共生菌的形态（箭头所指，放大100倍）；

图2分别为显微镜下褐飞虱类酵母共生菌的培养菌株形态；

图3分别为显微镜下褐飞虱类酵母共生菌的培养菌株另一形态。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明。

实施例1：一种培养褐飞虱体内类酵母共生菌的专用培养基的成分及配比

L－天冬氨酸 10mg/L、L－精氨酸－氢氧化物50mg/L、L－天冬酰氨酸50 mg/L、L－丙氨酸30 mg/L、B－丙氨酸10mg/L、L－胱氨酸－氢氧化物5 mg/L、L－谷氨酸10mg/L、L－谷酰氨酸100 mg/L、L－氨基乙酸10 mg/L、L－组氨酸300 mg/L、L－异亮氨酸1mg/L、L－亮氨酸5 mg/L、L－赖氨酸－氢氧化物100 mg/L、L－甲硫氨酸5 mg/L、L－脯氨酸50 mg/L、L－苯丙氨酸10 mg/L、DL－丝氨酸100 mg/L、L－酪氨酸10mg/L、L－色氨酸5mg/L、L－苏氨酸50 mg/L、L－缬氨酸50mg/L、葡萄糖10mg/L、链霉素硫酸盐17.5 mg/L、苹果酸50 mg/L、α－酮戊二酸50mg/L、琥珀酸1mg/L、反丁烯二酸10 mg/L、核黄素0.5mg/L、泛酸钙0.001mg/L、叶酸1mg/L和烟酸0.25mg/L。

 

    实施例2：一种培养褐飞虱体内类酵母共生菌的专用培养基的成分及配比

L－天冬氨酸 15mg/L、L－精氨酸－氢氧化物10mg/L、L－天冬酰氨酸18mg/L、L－丙氨酸10 mg/L、B－丙氨酸30mg/L、L-胱氨酸－氢氧化物1 mg/L、L－谷氨酸50mg/L、L－谷酰氨酸40 mg/L、L-氨基乙酸75 mg/L、L－组氨酸100 mg/L、L－异亮氨酸5mg/L、L－亮氨酸10 mg/L、L－赖氨酸－氢氧化物50 mg/L、L－甲硫氨酸1mg/L、L－脯氨酸30 mg/L、L－苯丙氨酸25 mg/L、DL－丝氨酸50 mg/L、L－酪氨酸5mg/L、L－色氨酸25.5mg/L、L－苏氨酸30 mg/L、L－缬氨酸25mg/L、葡萄糖10mg/L、链霉素硫酸盐25mg/L、苹果酸75 mg/L、α－酮戊二酸40mg/L、琥珀酸3.5mg/L、反丁烯二酸5 mg/L、核黄素0.001mg/L、泛酸钙0.5mg/L、叶酸0.01mg/L和烟酸0.1mg/L。

 

实施例3：一种培养褐飞虱体内类酵母共生菌的专用培养基的成分及配比

L－天冬氨酸 50mg/L、L－精氨酸－氢氧化物100mg/L、L－天冬酰氨酸10mg/L、L－丙氨酸50 mg/L、B－丙氨酸50mg/L、L－胱氨酸－氢氧化物3 mg/L、L－谷氨酸100mg/L、L－谷酰氨酸25 mg/L、L－氨基乙酸100 mg/L、L－组氨酸500 mg/L、L－异亮氨酸10mg/L、L－亮氨酸1 mg/L、L－赖氨酸－氢氧化物60 mg/L、L－甲硫氨酸10mg/L、L－脯氨酸10 mg/L、L－苯丙氨酸50 mg/L、DL－丝氨酸150 mg/L、L－酪氨酸1mg/L、L－色氨酸50mg/L、L－苏氨酸10 mg/L、L－缬氨酸5mg/L、葡萄糖100mg/L、链霉素硫酸盐50mg/L、苹果酸100 mg/L、α－酮戊二酸25mg/L、琥珀酸10mg/L、反丁烯二酸1 mg/L、核黄素1mg/L、泛酸钙0.1mg/L、叶酸0.25mg/L和烟酸0.01mg/L。

 

实施例4：一种培养褐飞虱体内类酵母共生菌的专用培养基的成分及配比

L－天冬氨酸 35mg/L、L－精氨酸－氢氧化物25mg/L、L－天冬酰氨酸35mg/L、L－丙氨酸25 mg/L、B－丙氨酸13.5mg/L、L－胱氨酸－氢氧化物2.5 mg/L、L－谷氨酸25mg/L、L－谷酰氨酸75 mg/L、L－氨基乙酸50 mg/L、L－组氨酸200 mg/L、L－异亮氨酸2.5mg/L、L－亮氨酸7 mg/L、L－赖氨酸－氢氧化物75mg/L、L－甲硫氨酸3.5mg/L、L－脯氨酸15 mg/L、L－苯丙氨酸40 mg/L、DL－丝氨酸135mg/L、L－酪氨酸6.5mg/L、L－色氨酸15mg/L、L－苏氨酸40 mg/L、L－缬氨酸30mg/L、葡萄糖50mg/L、链霉素硫酸盐35mg/L、苹果酸80 mg/L、α－酮戊二酸30mg/L、琥珀酸5mg/L、反丁烯二酸6.5 mg/L、核黄素0.1mg/L、泛酸钙0.25mg/L、叶酸0.5mg/L和烟酸0.01mg/L。

 

实施例5：一种培养褐飞虱体内类酵母共生菌的专用培养基的成分及配比

L－天冬氨酸 45mg/L、L－精氨酸－氢氧化物65mg/L、L－天冬酰氨酸25mg/L、L－丙氨酸45 mg/L、B－丙氨酸42mg/L、L-胱氨酸－氢氧化物4.5 mg/L、L－谷氨酸65mg/L、L－谷酰氨酸50mg/L、L－氨基乙酸90mg/L、L－组氨酸400 mg/L、L－异亮氨酸7mg/L、L－亮氨酸3mg/L、L－赖氨酸－氢氧化物80mg/L、L－甲硫氨酸7mg/L、L－脯氨酸25mg/L、L－苯丙氨酸20mg/L、DL－丝氨酸75mg/L、L－酪氨酸2.5mg/L、L－色氨酸40mg/L、L－苏氨酸25mg/L、L－缬氨酸15mg/L、葡萄糖70mg/L、链霉素硫酸盐45mg/L、苹果酸65mg/L、α－酮戊二酸15mg/L、琥珀酸8.5mg/L、反丁烯二酸3.5mg/L、核黄素0.01mg/L、泛酸钙1mg/L、叶酸0.001mg/L和烟酸0.5mg/L。

 

实施例6：一种培养褐飞虱体内类酵母共生菌的专用培养基的成分及配比

L－天冬氨酸 25mg/L、L－精氨酸－氢氧化物85mg/L、L－天冬酰氨酸45mg/L、L－丙氨酸40mg/L、B－丙氨酸25mg/L、L－胱氨酸－氢氧化物2mg/L、L－谷氨酸80mg/L、L-谷酰氨酸10mg/L、L-氨基乙酸35mg/L、L－组氨酸150 mg/L、L－异亮氨酸8.5mg/L、L－亮氨酸9mg/L、L－赖氨酸－氢氧化物90mg/L、L－甲硫氨酸8.5mg/L、L－脯氨酸40mg/L、L－苯丙氨酸35mg/L、DL－丝氨酸125mg/L、L－酪氨酸8.5mg/L、L－色氨酸35mg/L、L－苏氨酸15mg/L、L－缬氨酸40mg/L、葡萄糖85mg/L、链霉素硫酸盐25mg/L、苹果酸90mg/L、α－酮戊二酸10mg/L、琥珀酸7mg/L、反丁烯二酸8.5mg/L、核黄素0.25mg/L、泛酸钙0.01mg/L、叶酸0.1mg/L和烟酸1mg/L。

 

实施例7：一种褐飞虱类酵母共生菌的离体培养方法，其通过以下步骤进行：

1）褐飞虱在人工智能培养箱中用养虫笼饲养，饲养条件为：温度26±0.5℃，相对湿度80±5%，光照时间12小时，光照强度8000 LUX，所用稻苗为感虫TN1品种；或采用饲养条件：温度25℃，相对湿度90%，光照时间16小时，光照强度6000 LUX；或采用饲养条件：温度30℃，相对湿度85%，光照时间10小时，光照强度8000 LUX；

2）将上述饲养的褐飞虱雌成虫羽化后24h、30h、60h或72h内取出，于75％酒精中消毒3min后于解剖镜下解剖腹部取出卵巢，并将卵巢用无菌水冲洗后浸没于75％酒精中；

3）取30-50头雌成虫腹部卵巢，75％酒精消毒后，-196℃液氮中快速匀浆，制得匀浆液；

4）在上述的匀浆液中加入10ml无菌水，配置成溶液，经0.22μm的millipor滤膜过滤后待用，为溶液Ⅰ；millipor滤膜可采用孔径大小在0.1-0.45μm的均可；

5）专用培养基各组分的配比：培养基各组分按实施例1中所述的比例称量后，溶解于水中之后，通过0.45μm的滤膜过滤灭菌后待用，为溶液Ⅱ；millipor滤膜可采用孔径大小在0.1-0.45μm的均可；

6）琼脂的配比：称取琼脂，与水重量比为18：1000或采用16：1000、22：1000，加热、熔化，高压灭菌；

7）取溶液Ⅰ和溶液Ⅱ各1ml注入高温灭菌的平皿中，然后倒入冷却至50、55或60℃的步骤6）制得的琼脂5-10ml，轻轻晃动平皿，使三者均匀混合进行褐飞虱类酵母共生菌的离体培养，培养条件：温度：28±2℃，湿度85±5%。

 

试验例：

试验材料：褐飞虱；

试验用培养基：按实施例1配方配置；

离体培养方法：按实施例7进行；

试验结果： 取供试褐飞虱雌成虫解剖取卵巢，冷冻切片观察可以看到，褐飞虱体内类酵母共生菌在形态上以长梭形形态（图1）为主，长度为2－10μｍ，宽度为0.5－2μｍ，多端芽殖，出芽形成的单细胞连接形成假菌丝。通过离体培养48h后，有白色、土黄色两种菌落长出，白色菌落厚实、表面较湿润、平坦无皱褶，边缘不规则，显微镜下观察，细胞呈椭圆形，接近于杆状，多端芽殖，长度为8－10μｍ，宽度为0.5－2μｍ（图2），此菌株暂时命名为YLS-1号菌株。土黄色菌落厚实、呈豆腐渣状，表面不平整、较白色菌落干燥，边缘不规则，显微镜下观察，细胞呈不规则圆球状，长度为2.5－4μｍ，宽度为2－4μｍ，并且连接成串，形成假菌丝（图3），此菌株暂时命名为YLS-2号菌株。离体培养获得的两株菌株经中国科学院微生物研究所鉴定，分别为解脂假丝酵母（Candida lipolytica）和嗜盐梗孢酵母Sterigmatomyces halophilus）。

经试验确定用实施例2、3、4、5或6配制的培养基进行试验，其也能达到与试验例1相同的技术效果。