非洲爪蟾dmrt5基因神经特异性调控元件及其载体的构建方法

摘要

本发明公开了一种非洲爪蟾dmrt5基因神经特异性调控元件及其载体的构建方法，本发明运用生物信息学与分子生物学技术获得非洲爪蟾Dmrt5启动子的保守区段，通过纯化、连接等技术导入PMD18-T载体中；然后，运用酶切技术，将Dmrt5启动子的保守区段定向克隆到pCS2-IS-EGFP载体上，获得可以用于转基因操作的pCS2-IS-Dmrt5-EGFP载体，其中EGFP的表达受到Dmrt5启动子的直接顺式调控。本发明为某个基因的组织特异性过表达或敲低奠定了基础；同时，这项发明也为对水环境中的对脑部神经发育有致畸形作用的有害物质的监控提供了一种强大的工具。

说明书

技术领域

本发明涉及生物领域，尤其涉及一种控制神经系统特异表达的顺式调控元件的克隆及其转基因载体的构建方法。

背景技术

顺式调控元件是指基因周围能与特异转录因子结合而影响其转录的DNA序列，例如启动子、增强子、衰减子等功能元件。顺式调控元件能够特异性调控基因的时空表达，因此顺式调控元件的特异性决定了它所调控基因的在组织及细胞水平的特异性表达。

爪蟾(Xenopus laevis)基因组中的Dmrt5基因含有两个外显子和一个内含子，mRNA长度为2592nt，含有Dmrt基因家族中保守的DM域，还有DMA和DMB两个保守区域。目前，对于Dmrt5的研究还非常有限，斑马鱼、小鼠等模式动物胚胎的原位杂交等基因表达实验表明，Dmrt5主要在神经系统和生殖腺中组织特异性表达。为了研究Dmrt5的组织特异性表达的规律以及它们的功能，采用生物信息学、比较基因组学以及分子生物学的手段，克隆了Dmrt5基因第一个外显子5’端上游的一段长度为3371bp的潜在启动子区域，并且利用显微注射技术，将含有该启动子区域和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的质粒注射到爪蟾受精卵中，观察到EGFP的瞬时表达。为了进一步鉴定该启动子控制Dmrt5组织特异性表达的功能，并进一步找到能够控制基因组织特异性表达的功能元件，本实验采取I-SceI介导的高效转基因方法，将该启动子区域和EGFP插入到爪蟾基因组中建立转基因爪蟾品系鉴定其中的功能元件，为实施组织特异性的基因过表达和基因敲低奠定了基础。

I-SceI是酵母(Saccharomyces cerevisiae)线粒体内含子编码的一种内切酶，识别一个18bp(TAGGGATAACAGGGTAAT)的识别位点，引入DNA的双链断裂(Monteilhet，Perrin et al.1990)，产生一个4bp突出的末端。因为I-SceI的识别位点有18个bp，所以在7×1010的随机序列中只出现一次，在普通的脊椎动物基因组中，一般都没有I-SceI的识别位点。因为I-SceI可以引入DNA的双链断裂，常常被用于基因组修复、同源重组和基因替换等研究。最近，发展出了一种I-SceI介导的转基因技术，可以用于首建动物分析和建立转基因动物品系，以进行基因表达分析、异位表达和基因敲低实验，对基因调控网络特别是顺式调控进行研究。

I-SceI方法的一个潜在缺陷是转基因的镶嵌表达，如果注射的时间太晚或者注射胚胎的培养温度太高这种情况有时候会发生(Ogino et al.2006a)。所有注射必须在卵受精后的45分钟内完成，因为注射的DNA插入到宿主基因组中的时间窗口限制在一细胞期的早期。注射后，胚胎必须培养在能够耐受的最低温度(X.tropicalis22℃，X.laevis 12-13℃)知道他们达到二细胞或四细胞期，用于刺激转基因的插入。I-SceI酶活性的丧失，比如在-20℃储存超过几个月，也会导致转基因镶嵌表达或者甚至转基因完全失败。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种非洲爪蟾dmrt5启动子的克隆及其转基因载体的构建方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种非洲爪蟾dmrt5基因神经特异性调控元件，该调控元件的核酸序列为SEQ ID No.1所示。

一种上所述非洲爪蟾dmrt5基因神经特异性调控元件的转基因载体pCS2-IS-Dmrt5-EGFP的构建方法，包括以下步骤：

(1)采用生物信息学，查找发现Dmrt5基因第一个外显子5’端上游的一段长度是3371bp的潜在启动子区域。提取非洲爪蟾基因组DNA，并设计针对调控元件的引物序列，以基因组DNA作为模板进行PCR扩增。

(2)将扩增好的调控元件序列片段连入PMD18-T，构建PMD18-T-Dmrt5质粒，用测序验证得到的片段是正确的调控元件。

(3)构建转基因载体pCS2-IS-Dmrt5-EGFP。

进一步地，所述步骤(1)中，所述扩增爪蟾Dmrt5启动子保守区序列所用引物P5如SEQID NO.2所示，扩增爪蟾Dmrt5启动子保守区序列所用引物P3如SEQ ID NO.3所示。所述扩增扩增目的启动子片段的反应体系为：10×Buffer 15μl、dNTP(2.5mM)1.75μl、p5(10μM)2μl、p3(10μM)2μl、基因组DNA 1μl、ROCHE Taq 0.75μl、pH2O 37.5μl。

进一步地，所述步骤(2)中，将所述步骤(1)的PCR产物用与PMD18-T连接后，转化到大肠杆菌，转化液再涂布到含有10μl 2％(M/V)的X-gal、4μl100mM的IPTG和20μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板上，37℃过夜培养得到细菌单克隆。

进一步地，所述步骤(3)中，将所述步骤(2)得到的PMD18-T-Dmrt5质粒和本实验室原有的利用分子生物学手段构建的pCS2-IS-CMV-EGFP质粒，分别用Sal I和HindIII双酶酶切，将回收的启动子片段和载体片段连接、转化后，用I-SceI酶切来鉴定所得到的克隆为正确克隆，鉴定结果显示成功构建了pCS2-IS-Dmrt5-EGFP质粒。

本发明的有益效果是：

1.在世界上首次克隆并得到非洲爪蟾Dmrt5启动子保守区序列；

2.在世界上首次运用生物信息学与分子生物学技术，构建了pCS2-IS-Dmrt5-egfp转基因载体；

3.在世界上首建了非洲爪蟾Dmrt5启动子的转基因品系；

4.本发明利用I-SceI介导的高效转基因技术鉴定了Dmrt5表达调控元件的功能，为后续实施神经系统组织特异性的基因过表达和基因敲低工作奠定了基础；

5.本发明可以利用转基因爪蟾对水环境中的有害物质进行更为方便、敏感和高效的监视、监测，防止环境污染对人们健康的不利影响。

附图说明

图1是提取非洲爪蟾基因组后进行检测的电泳图，图中，M为DNA分子大小标记，1是基因组条带；

图2是PCR扩增Dmrt5启动子的电泳图，图中，M为DNA分子大小标记，1是PCR产物的条带；

图3是pCS2-IS-CMV-EGFP质粒结构示意图；

图4是pCS2-IS-CMV-EGFP与pCS2-IS-Dmrt5-EGFP两种质粒质粒I-secI酶切产物电泳图，图中，1号条带是pCS2-IS-CMV-EGFP酶切结果，2号条带指示PCS2-IS-Dmrt5-EGFP的酶切结果.M1，M2均为marker；

图5是pCS2-IS-Dmrt5-EGFP质粒结构示意图。

具体实施方式

本发明运用生物信息学与分子生物学技术获得非洲爪蟾Dmrt5启动子的保守区段，通过纯化、连接等技术导入PMD18-T载体中；然后，运用酶切技术，将Dmrt5启动子的保守区段定向克隆到pCS2-IS-EGFP载体上，获得可以用于转基因操作的pCS2-IS-Dmrt5-EGFP载体，其中EGFP的表达受到Dmrt5启动子的直接顺式调控。进行转基因试验后，我们首建了Dmrt5启动子调控EGFP表达的转基因非洲爪蟾，且荧光信号神经系统特异性非常高。

本发明非洲爪蟾dmrt5启动子的克隆及其转基因载体的构建方法，包括以下步骤：

1.非洲爪蟾Dmrt5启动子保守区段的扩增

取蝌蚪为材料，加入裂解缓冲液，匀浆处理；用RNase 65℃除去RNA，再用酚-氯仿去除蛋白，离心后小心取出上清，再向上清中加入氯仿取出多余蛋白等杂质；离心后将上清取出，再加等体积的异丙醇沉淀DNA，离心收集沉淀后将上清小心弃掉，用70％乙醇清洗沉淀两次，干燥沉淀后，用100μl超纯水溶解沉淀，用分光光度计测量DNA浓度跟纯度，并通过电泳检测所提基因组DNA的完整程度。

为了研究Dmrt5的组织特异性表达的规律以及它们的功能，采用生物信息学、比较基因组学手段，查找该启动子的序列并根据序列设计两条引物用来扩增启动子片段。两引物之间的序列为Dmrt5基因第一个外显子5’端上游的一段长度是3371bp的潜在启动子区域。

其中，非洲爪蟾Dmrt5启动子保守区序列如SEQ ID NO.1所示，扩增爪蟾Dmrt5启动子保守区序列所用引物P5如SEQ ID NO.2所示，扩增爪蟾Dmrt5启动子保守区序列所用引物P3如SEQ ID NO.3所示。

以所提取基因组为模板，用以上设计的引物扩增目的启动子片段：10×Buffer15μl、dNTP(2.5mM)1.75μl、p5(10μM)2μl、p3(10μM)2μl、基因组DNA1μl、ROCHE Taq 0.75μl、pH2O 37.5μl。PCR反应结束后，用EB染色的0.8％琼脂糖凝胶跑胶检测，取DNA样品5μl，电泳检测得到目的大小条带。

2.PMD18-T-Dmrt5启动子保守区载体的构建

通过凝胶回收试剂盒切胶回收纯化PCR产物。将目的条带的DNA经电泳分离再在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，经加热溶解、吸附柱吸附、脱盐纯化后将制备管置于洁净的1.5ml离心管中，在DNA制备膜正中央加50μl超纯水，室温静置几分钟充分溶解，离心洗脱DNA。用分光光度计测定DNA的浓度及纯度，并电泳确定切胶回收的效果。

保守片段的T-Vector连接与转化。将胶回收纯化后的目的片段与PMD18-T载体按一定摩尔比例混合后进行T载体连接，16℃连接过夜；再将连接产物转入化学感受态中，取部分转化后的菌液均匀涂在含有X-gal和IPTG的氨苄琼脂板上，进行蓝白斑筛选。

从上述平板上挑取单菌落于含Amp的液体培养基，扩大培养3个小时后，用菌液做模板进行菌液PCR检测阳性克隆菌落。将阳性克隆菌液保种后再扩大培养用来抽提质粒，进行酶切检测，根据质粒酶切图谱来初步判断所得克隆正确。经测序验证序列正确后，成功得到PMD18-T-Dmrt5启动子保守区质粒。

3.转基因载体pCS2-IS-Dmrt5-EGFP质粒的构建

根据以上构建的PMD18-T-Dmrt5启动子的质粒和本实验室原有的利用分子生物学手段构建的pCS2-IS-CMV-EGFP质粒，分别用Sal I和Hind III双酶酶切，经过割胶回收后，分别得到启动子片段和载体片段，然后通过连接反应将启动子片段插入到转基因载体骨架上，经过转化将连接产物转入细菌中，再挑取克隆通过菌液PCR及对质粒I-SceI酶切来鉴定所得到的克隆为正确克隆。鉴定结果显示成功构建了pCS2-IS-Dmrt5-EGFP质粒。

下面通过I-SceI转基因试验来证明本发明的结果。

1、I-SceI转基因试验具体的操作步骤

提取用于注射的质粒DNA时，使用ddH2O溶解DNA，用紫外分光光度计测量DNA浓度及纯度，每次注射时用ddH2O新稀释，保证新鲜。通过多次试验，pCS2-IS-Dmrt5-EGFP质粒的注射量在120pg DNA，1.2×10^-2U I-Sce I/胚胎时，能够取得最好的转基因效果。

预实验中，用pCS2-IS-CMV--EGFP阳性对照质粒，对体系中加入质粒和酶的量进行摸索，寻找最适注射量。120pg DNA，1.2×10^-2U I-Sce I/胚胎是按照预实验得到的最适注射量。最好每批注射都使用新鲜的酶切产物，以保证较高的转基因效率。

注射之后，将胚胎在13℃温箱内培养2小时，然后取出放置在室温下。直到胚胎发育到第9期后，将胚胎转移到装有0.3×MBS的小塑料培养皿中，每个皿放20-25个胚胎，18℃培养过夜。注意，还要挑取若干没有注射的受精卵同步培养作为对照。

定时观察胚胎的发育情况，在荧光显微镜下观察绿色荧光表型，并拍照。发育到后期会游动的蝌蚪的时候，可用适量的MS-222进行麻醉来观察拍照。连续观察一周，表型基本稳定后，可给蝌蚪喂养绿藻，将转基因蝌蚪养成成体蛙。

2.试验结果

2.1 Dmrt5启动子控制EGFP表达质粒pCS2-IS-Dmrt5-EGFP的检测

pCS2-IS-Dmrt5-EGFP质粒显微注射获得的Dmrt5-EGFP胚胎全身表达EGFP，说明注射pCS2-IS-Dmrt5-EGFP质粒的胚胎能够表达由Dmrt5启动子启动的EGFP，即该质粒的构建是正确的。

2.2 Dmrt5启动子区域控制EGFP在神经系统中特异性表达

如4中转基因注射条件进行操作，并对成功整合IS-Dmrt5-EGFP的胚胎进行了连续的绿色荧光的观察，发现该Dmrt5启动子区域可以控制基因在眼部、中脑、后脑以及整个神经管的特异性表达。经过细心的养护，转基因的胚胎存活到了变态后蛙的时期，获得了转基因的首建爪蟾。

以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明范围。

实施例一

1.材料试剂和仪器

1.1材料试剂

Ex-Taq PCR反应试剂盒、pMD18-T载体试剂盒、限制性内切酶及其缓冲液(Sal I、Sac I、EcoR I、Pst I、BamH I、HindIII、Ava I)和T₄ DNA连接酶均购自日本TAKARA公司；非洲爪蟾(Xenopus)，本实验室养殖；甘油、氨苄青霉素、IPTG、X-Gal、琼脂糖、琼脂粉、溴化乙锭、Ficoll 400、蛋白酶K、酚-氯仿氯仿购自上海生工生物技术有限公司；异丙醇、无水乙醇等购自国药生化试剂；ROCHE-Taq PCR反应试剂盒购自瑞士罗氏公司；DNA胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒、PCR清洁试剂盒均购自Axygen公司；pCS2:IS:CMV:EGFP质粒来自于本实验室；胰化蛋白胨、酵母浸粉购自OXOID公司等等。

1.2主要仪器

低温离心机(3K15)为SIGMA公司产品，室温小离心机(centrifuge 5418)为eppendorf公司产品，纯水仪为Heal Force公司产品，细菌恒温摇床及恒温培养箱均为上海博讯公司产品，LongGene PCR system(MGL96G)购自杭州朗基科技有限公司，水平电泳仪为Bio-Rad公司产品，可拍照体视显微镜(SZX7)购自OLYMPUS，荧光体视显微镜购自Nikon公司，凝胶成像仪(Tanon 2500)购自中国天能，显微注射仪(PLI-100)购自HARVARD公司，PH计(PB-10)、高精度电子天平(BS124S)购自sartorius公司。

2.引物的设计

尽量放大扩增区域，以确保得到所需的完整片段。使用Vector NTI软件的引物设计工具设计特异性引物，然后用Primer 5.0进一步分析正反向引物间的相互作用。为了研究Dmrt5的组织特异性表达的规律以及它们的功能，采用生物信息学、比较基因组学手段，两引物之间的序列为Dmrt5基因第一个外显子5’端上游的一段长度是3371bp的潜在启动子区域。详细引物信息见SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3。

3.非洲爪蟾Dmrt5启动子保守区段的扩增

3.1爪蟾基因组DNA的抽提

1)取蝌蚪两只，放入1.5ml的微量离心管中，加入500μl的裂解缓冲液，匀浆处理；

2)加入4.5μl的10mg/mL的RNase，放入65℃的水浴锅温浴15-30min，除去RNA，14000rpm离心5min；

3)将上清转移到新的微量离心管中，加入500μl酚-氯仿。混合均匀，使上层成白色乳浊液，14000rpm离心5min；

4)重复上一步操作2-4次；

5)将上清转移到新的微量离心管中，加入500μl氯仿，混合均匀，12000rpm离心5min；

6)将上清转移到新的微量离心管中，加入0.6倍上清体积的异丙醇，可见线状DNA析出，12000rpm 4℃冷冻离心15min；

7)将线状DNA吸入新的微量离心管中，加入500μl的70％乙醇，12000rpm离心15min；

8)吸净微量离心管中的所有可见液滴，加入500μl的70％乙醇，颠倒数次，使沉淀漂浮，4℃离心5min；

9)重复上一步操作1-2次；

吸净微量离心管中的所有可见液滴，室温干燥至没有乙醇气味。加入100μl的pH2O溶解DNA沉淀。测定DNA浓度，取1μl在EB染色的0.8％的琼脂糖凝胶中电泳约20min，观察条带，确定基因组为20Kb以上片段。用分光光度计测吸光值260/280、260/230均在1.8以上。

3.2PCR扩增目的启动子片段

通过PCR反应扩增目的片段2(ROCHE-Taq)，反应体系如下：

10×Buffer1                    5μl

dNTP(2.5mM)                    1.75μl

p5(10μM)                      2μl

p3(10μM)                      2μl

基因组DNA                      1μl

ROCHE Taq                      0.75μl

pH2O                           37.5μl

总体积                         50μl

PCR反应条件为：

94℃ 2min；

68℃7 min；END

PCR反应结束后，用EB染色的0.8％琼脂糖凝胶跑胶检测，取DNA样品5μl，电泳约20min。扩增得到的序列见SEQ.ID NO1。

4PMD18-T-Dmrt5启动子保守区载体的构建

4.1通过AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒切胶回收纯化PCR产物：

1)在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎。计算凝胶重量(提前记录1.5ml离心管重量)，该重量作为一个凝胶体积(如100mg＝100μl体积)。

2)加入3个凝胶体积的Buffer DE-A，混合均匀后于75℃加热，间断混合(每2-3min)，直至凝胶块完全熔化(约6-8min)。

3)加0.5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B，混合均匀；

4)吸取3)中的混合液，转移到DNA制备管(置于2ml离心管)中，12,000×g离心1min。弃滤液。

5)将制备管置回离心管，加0.5ml Buffer W1，12,000×g离心30s，弃滤液。

6)将制备管置回离心管，加0.7ml Buffer W2，12,000×g离心30s，弃滤液。

7)以同样的方法再用0.7ml Buffer W2洗涤一次12,000×g离心1min。

8)将制备管置于2ml离心管中，12,000×g离心1min。

9)将制备管置于洁净的1.5ml离心管中，在DNA制备膜正中央加25-30μl水或Eluent，室温静置1min。12,000×g离心1min洗脱DNA。

用分光光度计测定DNA的浓度及纯度，并电泳确定切胶回收的效果。

4.2保守片段的T-Vector连接，转化、涂板和阳性克隆鉴定：

1)连接

按以下反应体系对片段进行T载体连接：

T-vector                       1μl

insert-DNA(即PCR切胶回收产物)  4μl

Solution I                     5μl

总体积                         10μl

16℃连接过夜；

2)转化和涂板

①X-gal和IPTG均匀涂于琼脂板在微量离心管中加入10μl 2％的X-gal和4μl 100mM的IPTG，混合均匀后涂布到含有20μg/mL氨苄青霉素的预制LB琼脂培养基平板上放置于37℃培养箱待用；

②转化

a)取出预先制备的TG1感受态细菌150μl，加入5μl的T载体连接产物，冰中静置30min；

b)42℃水浴热激90s；

c)立即放入冰中，冰浴2min；

d)加入1ml 37℃预热的SOC培养基，轻轻混合均匀；

e)37℃，50-80rpm振荡培养复苏1h；

f)用掌上离心机轻甩，吸去上清，剩下约200μl液体培养基时重悬(可用移液枪轻轻吹打，也可用手指轻弹微量离心管底)；

g)将重悬菌液均匀涂布于步骤①制备的平板上；

h)置于37℃培养约1hour；

i)待干燥至没有菌液流动，倒置平板培养约10hour。

3)阳性克隆鉴定

①从上述平板上挑取4个白色单菌落于含Amp的液体培养基，280rpm，37℃震荡培养过夜(约10hour)；取500μl菌液至1.5ml离心管，加入约150μl的保种用甘油，混合均匀，置于-80℃保存菌种；

②通过AxyPrep质粒DNA小量试剂盒小量抽提质粒

a)取5ml在LB培养基中培养过夜的菌液，12,000×g离心1min，弃尽上清。

b)用250μl已加入RNase A的Buffer S1悬浮细菌沉淀，悬浮需均匀，不应留有小的菌块。

c)加入250μl Buffer S2，温和并充分地上下翻转混合4-6次，使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液。此步骤不宜超过5min。

d)加入350μl Buffer S3，温和并充分地上下翻转混合6-8次，12,000×g离心10min。

e)吸取步骤4中的离心上清并转移到DNA制备管(置于2ml离心管中)，12,000×g离心1min。

f)将制备管置回离心管，加500μl Buffer W1，12,000×g离心1min，弃滤液。

g)将制备管置回离心管，加700μl Buffer W2，12,000×g离心1min，弃滤液；以同样的方法再用700μl Buffer W2洗涤一次。弃滤液。

h)将制备管置回2ml离心管中，12,000×g离心1min。

i)将制备管移入新的1.5ml离心管中，在DNA制备膜正中央加60-80μl水或Eluent，室温静置1min。12,000×g离心1min。

用分光光度计测定质粒DNA浓度。

③酶切鉴定

取抽提的质粒做酶切鉴定，使用内切酶EcoR I单酶切，反应体系如下：

pH2O                 15.5μl

质粒                 2μl

Takara 10×H Buffer  2μl

内切酶EcoR I         0.5μl

总体积               20μl

37℃酶切3h后，用EB染色的0.8％琼脂糖凝胶跑胶检测，取酶切产物10μl，电泳约20min。成功得到PMD18-T-Dmrt5启动子保守区质粒。

5转基因载体pCS2-IS-Dmrt5-EGFP质粒的构建

根据实验室已有的PMD18-T-Dmrt5启动子的质粒和pCS2-IS-CMV-EGFP质粒，分别用Sal I和HindIII双酶切，采用如下反应体系37℃酶切过夜：

pH2O                 2.5μl

质粒(各约12μg)      35μl(带有保守片段的PMD18-T-Dmrt5启动子质粒和pCS2-IS-CMV-EGFP质粒)

TAKARA 10×Buffer K  7.5μl

内切酶HindIII        2.5μl

内切酶Sal I          2.5μl

总体积               50μl

轻柔混匀，并瞬时离心。

酶切好以后后，使用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒切胶回收pCS2-IS-EGFP片段和Dmrt5启动子片段，用分光光度计测量回收片段的浓度和纯度，然后进行连接反应，使用如下反应条件16℃连接过夜：

Dmrt5启动子片段                        5μl

pCS2-IS-EGFP载体骨架                   2μl

10×T4ligase buffer                    2.5μl

T4Ligase                               1μl

pH2O                                   14.5μl

总体积                                 25μl

转化、涂板、挑克隆以及扩增质粒(具体方法如上所示)，

将少量菌液加甘油保种后，收集剩余的菌液约5ml，进行小量质粒抽提；质粒抽提好后用I-SceI 10μl小体系酶切鉴定，鉴定结果显示成功构建了pCS2-IS-Dmrt5-EGFP质粒。

6I-SceI转基因试验操作步骤

在试验中，pCS2-IS-Dmrt5-EGFP质粒的注射量在120pg DNA，1.2×10^-2UI-SceI/胚胎时，能够取得最好的转基因效果。提取用于注射的质粒DNA时，使用ddH2O溶解DNA，用紫外分光光度计测量DNA浓度，用ddH2O稀释到100ng/μl，每次注射重新稀释，保证新鲜。

在静置的同时，建立一个I-SceI消化转基因载体的酶切反应。预实验中，用pCS2-IS-CMV--EGFP阳性对照质粒，对体系中加入质粒和酶的量进行摸索，寻找最适注射量。下面是按照预实验得到的最适注射量(120pg DNA，1.2×10^-2UI-SceI/胚胎)建立的酶切体系：

10×Buffer         1μL

DNA(100ng/μL)     2μL

I-SceI(10U/μL)    2μL

ddH2O              5μL

Total              10μL

10μL酶切体系在37℃孵30min，酶切反应时间到后立即将酶切产物放置在冰上，尽快注射，最好每批注射都使用新鲜的酶切产物，以保证转基因效率。

待受精卵翻转，黑色的动物极朝上，用吸管将0.1×MBS吸出，加入2％cysteine溶液去膜，轻柔摇动直至卵外层的胶质膜去除，卵可以互相接触。立即倒掉cysteine溶液，用0.1×MBS轻柔洗4-5遍，倒入干净的玻璃培养皿中。

在显微镜下观察，挑取受精的质量好的一细胞期的卵到盛有4％Ficoll(0.3×MBS中)的注射用网格皿中，每皿50个左右胚胎，用发圈将卵排成列，便于注射。同时给显微注射仪装针，在针里吸取2-3μL的反应混合物，调节到每个胚胎注射6nl溶液。

对于X.laevis的受精卵，预实验摸索的最佳注射量是120pg DNA，1.2×10^-2UI-SceI/胚胎。将溶液注射到动物极和植物极的交界处靠近动物极的一边，注射到皮层之下。为保证酶切产物的新鲜，应尽快注射完，注射完后静置5min。

注射之后，将胚胎在13℃温箱内培养2小时，然后取出放置在室温下。直到胚胎发育到第9期后，将胚胎转移到装有0.3×MBS的小塑料培养皿中，每个皿放20-25个胚胎，18℃培养过夜。注意，还要挑取若干没有注射的受精卵同步培养作为对照。

定时观察胚胎的发育情况，在荧光显微镜下观察绿色荧光表型，并拍照(统一曝光20s)。发育到后期会游动的蝌蚪的时候，可用50mg/L的MS-222进行麻醉来观察拍照。连续观察一周，表型基本稳定后，可给蝌蚪喂养绿藻，将转基因蝌蚪养成成体蛙。

7试验结果

7.1Dmrt5启动子控制EGFP表达质粒pCS2-IS-Dmrt5-EGFP的检测

质粒检测结果显示pCS2-IS-Dmrt5-EGFP质粒显微注射获得的Dmrt5-EGFP胚胎全身表达EGFP，而对照组为未注射的胚胎，没有任何荧光表达。说明注射pCS2-IS-Dmrt5-EGFP质粒的胚胎能够表达由Dmrt5启动子启动的EGFP，即该质粒的构建是正确的。

7.2Dmrt5启动子区域控制EGFP在神经系统中特异性表达

按照6中转基因注射条件进行操作，并对成功整合IS-Dmrt5-EGFP片段的胚胎进行了连续的绿色荧光的观察、跟踪。当胚胎发育到第五天时，转基因的胚胎在眼部、中脑、后脑以及整个神经管都有很强的荧光表达，说明Dmrt5-EGFP转基因片段能够控制绿色荧光蛋白在神经系统稳定的表达。经过细心养殖，转基因的胚胎存活到了变态后蛙的时期，获得了转基因的首建爪蟾。

综上所述，本发明首次发现并证明Dmrt5启动子是一个组织特异性顺势调控元件，该Dmrt5启动子区域可以控制基因在眼部、中脑、后脑以及整个神经管的特异性表达。同时，转基因实验也证明了本发明的构建pCS2-IS-Dmrt5-EGFP的方法是切实可行的。