早春短命植物绵果荠的高效再生植株获得的方法

摘要

本发明公开了一种早春短命植物绵果荠再生体系建立的方法，通过以不同的外植体、生长调节剂、糖浓度和培养条件对其愈伤组织的诱导及其增殖、芽的分化和根诱导的影响，并以不同的基质和再生苗的前处理对再生苗移栽成活率的影响进行比较，确定选用愈伤组织的外植体为子叶，生长调节剂配伍为MS+1.0mg/l IBA+0.1mg/l BAP，在黑暗条件下进行组织培养，蔗糖浓度为3％或4％，建立绵果荠愈伤组织诱导及植株再生的最佳体系，从而得到早春短命植物绵果荠的高效再生植株的方法。解决绵果荠的自然繁殖率低而面临灭绝威胁的问题，更加缩短生长发育周期，获得真正人工培养条件和培养基下的离体再生植株，具有广泛的应用价值。

说明书

发明领域

本发明涉及植物生物技术领域。具体的说，本发明涉及植物组织培养技术领域。

背景技术

短命植物是对生长在干旱荒漠地带的一类生活周期或年生长期很短的特殊植物类群的总称(Risser and Cottam，1968；Mulroy and Rundel，1977；张立运，1985；黄培祜，2002)。主要分布在中亚、西亚、北非、北美、南美和地中海沿岸等地的荒漠地带(Went，1948；Shreve，1951；阿略兴，1954；谢尼阔夫，1954；Rooyen et al.，1992；Telenius，1993；Hegazy and Elamry，1998；Wilby and Shachak，2000；Gutterman，2001)，中亚为其分布中心之一(毛祖美和张佃民，1994；黄培祜，2002)。我国短命植物只分布于新疆北部荒漠(尤其是准噶尔荒漠)及其毗邻的草原带(潘伟斌和黄培祜，1991)。每年春季3月下旬开始大量短命植物萌动破土，到5月有些地方短命植物盖度可以达到50％以上，能够有效地阻止地表风沙流动，即春季新疆北部地区沙漠稳定沙面的主要贡献者和沙漠受干扰破坏后植被入侵的先锋植物，在荒漠植物群落中具有重要地位和生态价值(王雪芹等，2003)。短命植物还是一类很有价值的资源，它们是新疆春秋季牧场中的优良春季牧草。很多种类是我国北方地区早春花卉及园林绿化美化的优良种质资源，少数种又是传统中药药材。此外，据张立运(2002)的报道，短命植物是一类光合效率高、物质积累快、营养周期短的植物资源。但是，到目前为止，国内外对短命植物组织培养方面的研究尚未报道。

绵果荠(Lachnoloma lehnannii Bge.)是十字花科绵果荠属(LachnolomaBge.)，该属为单种属。是分布于亚洲中部的干旱、半干旱沙荒地和盐碱地的一年生早春短命植物，在我国仅分布于新疆北部。花期5月，果期6月，植株较小，株高约10-20cm，全珠多毛，果实为短角果四棱状卵形，果皮厚而硬及果皮外有绵毛(马素卿和潘秀敏，1987)。此外，绵果荠具有生活周期短、萌发期早、基因结构简单(2n＝2x＝14)、较强的抗盐、耐旱性等特性(刘媖心，1987)，是一种特殊的潜在遗传资源。人类可以应用高生物技术(体细胞杂交、原生质体融合、转基因等)手段、利用这一潜在遗传资源，培育生长期短，具有较强的抗逆性的粮食作物、蔬菜、牧草、花卉新品种和新种类。

组织培养是植物生物技术的必要前提和最理想手段。它一方面可为遗传工程提供理想的受体材料，另一方面可为常规的植物改良程序提供一种新的手段，从而使很多用传统方法难以解决的问题迎刃而解，更多更快更好地创造出各种林木、农作物和园艺植物的新品种、新类型和新种类，是一类新资源开发利用和种质资源保存的先锋手段。这不仅能解决资源短缺的困难，而且具有许多农业栽培所不具备的优点(Trigiano and Gray，2000；Razdan，2002)。因此，在人类面临能源危机、资源短缺、环境污染日益严重的情况下发挥着重要的作用。

所以，本发明以短命植物绵果荠为研究材料，建立它的高效再生体系具有如下重要意义：

一是可为以短命植物为材料，应用组织培养技术，进行新资源开发利用及短命植物种质保存提供研究材料和重要理论依据。

二是“生命与地球环境的协同演化”是当今世界地球科学与生命科学相互交叉的重大前沿科学主题。近年来，随着我国西部荒漠生态环境的不断恶化以及生态建设问题的日益突出，短命植物以其独特的生物学、生态学特性已经引起了国内有关部门及学者的高度重视。但目前为止，该类在植物组织培养方面尚未报到。

因此，研究短命植物在组织培养方面研究具有重大而赋予现实的意义。

发明内容

针对短命植物在组织培养方面研究空白的技术现状，本发明旨在提供一种早春短命植物绵果荠高效再生体系建立的方法，填补了短命植物在现有技术中组织培养方面的技术空白，解决绵果荠的自然繁殖率低而面临灭绝威胁的问题，更加缩短生长发育周期，获得人工培养条件和培养基下的离体再生植株。

本发明通过以下技术方案实现的：以绵果荠为研究材料，通过不同的外植体、生长调节剂、糖浓度和培养条件对其愈伤组织的诱导及其增殖、芽的分化和根诱导的影响研究，并不同的基质和再生苗的前处理对再生苗移栽成活率的影响进行比较，建立绵果荠愈伤组织诱导及植株再生的最佳体系，从而得到早春短命植物绵果荠的高校再生植株的方法。

本发明具体提供了一种早春短命植物绵果荠高效再生体系建立的方法，包括以下步骤：

1)无菌材料的备用；

2)在愈伤组织的诱导中，选用子叶为外植体，生长调节剂配方为MS+1.0mg/l IBA+0.1mg/l BAP，在黑暗条件下进行愈伤组织培养，蔗糖浓度为3％或4％；

3)在愈伤组织的增殖中，选用子叶为诱导出来的愈伤组织的增殖对象，生长调节剂配方为MS+1.0mg/l IBA+0.1mg/l BAP；

4)在不定芽的分化中，子叶愈伤组织分化的生长调节剂配合方式为MS+0.5mg/L IBA+1.0mg/L KT和MS+0.1mg/L IBA+2.0mg/L BAP，下胚轴的愈伤组织分化的生长调节剂配合方式为MS+0.1mg/L IAA+1.0mg/L BAP；

5)在不定根的诱导中，选用配方为1/2MS+0.1mg/L NAA；

6)在植株再生培养中，选在分化培养基里分化的愈伤组织接种到已筛选出的分化培养基中培养，观察植株再生情况，培养温度22℃-24℃、光照强度2000Lx、光照时间为16h/d。

本发明中，选用现有技术中常用的不同植物生长调节剂IAA，2，4-D，NAA，IBA和BAP都为本领域熟知的，可以通过公众途径获得，其中，IAA代表吲哚乙酸，2，4-D代表2，4-二氯苯氧乙酸，NAA代表奈乙酸，IBA代表吲哚丁酸，BAP代表苄基氨基嘌呤。

通过实施本发明具体的发明内容，可以达到以下效果：

1.发明弥补了短命植物在现有技术中组织培养方面的技术空白，解决绵果荠的自然繁殖率低而面临灭绝威胁的问题，更加缩短生长发育周期，获得真正人工培养条件和培养基下的离体再生植株。本发明并为以短命植物为材料，应用植物生物技术，进行新资源开发利用及短命植物种质保存提供了研究材料和重要技术方案。

2.在本发明提供的早春短命植物绵果荠再生体系中，选用的生长调节剂配合为MS+1.0mg/l IBA+0.1mg/l BAP，该配合的愈伤组织诱导率达到了100％，诱导出来的愈伤组织的手感为松脆(易碎)、颜色为绿色、产生量大、诱导期很早(6-9d)。

3.在本发明提供的早春短命植物绵果荠再生体系中，选用的子叶愈伤组织分化的生长调节剂配合方式为MS+0.5mg/L IBA+1.0mg/L KT和MS+0.1mg/LIBA+2.0mg/L BAP，该配方的不定芽诱导率分别为80.00(±8.16)％和77.78(±11.11)％，平均每块愈伤组织诱导芽数分别为5.33(±0.62)％和5.00(±0.37)％。下胚轴的为MS+0.1mg/L IAA+1.0mg/L BAP，该处理的分化率为91.67(±8.33)％，平均芽数为6.45(±0.68)。

4.在本发明提供的早春短命植物绵果荠再生体系中，选用的不定根诱导中，发根率最佳的配方选用1/2MS+0.1mg/L NAA，该处理不定根的诱导率为80.00(±13.33)％，平均根长为4.05(±0.42)cm。

具体实施方式

下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。另外，在下述的说明中，如无特别说明，％皆指质量百分比。

本发明以现有的组织培养技术为发明基础。本发明所使用的生长调剂是日本Sigma公司的、琼脂粉是美国Sanland公司的，MS培养基所使用的试剂和蔗糖是中国天津化学试剂有限公司和上海蓝季科技发展有限公司生产的分析纯。

本发明中选用的所有试剂和仪器都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。

实施例一：无菌材料的备用

培养基：选用10×大量元素母液、100×铁盐母液、100×微量元素母液、100×有机物(维生素)母液不同培养基，配制MS(Murashige and Skoog，1962)培养基，不添加任何生长调节剂，所述培养基包含3％蔗糖和0.6％琼脂粉，pH值均调为6.0，用150mL三角瓶分装，每瓶约50mL。分装后放入灭菌锅，在1.2×104kg/m²(121℃)下灭菌20min，取出，放平，冷却备用。

无菌苗的培育：成熟的绵果芥果实采集于新疆阜康彩南。果实采摘后，在室温下贮藏备用。取粒大饱满、无病虫害的种子先自来水冲2-3min，然后在无菌条件下70％乙醇浸泡1.0min，无菌水冲4-5次，0.1％升汞消毒1.5min，无菌水冲3-5次，接种MS基本培养基。先培养在温度为5-15℃白天/晚上、光照为16h、湿度为70-80％的培养箱4-5d，种子萌发出来了以后转移到温度为23±1℃、光照为16h、湿度为70-80％的培养室培养10d。培育的14-15d的健康无菌苗选用愈伤组织诱导。

实施例二：愈伤组织的诱导

本试验以建立一个绵果荠愈伤组织诱导的最佳体系为目的，把绵果荠下胚轴与子叶作为外植体，把现有技术中常用的不同植物生长调节剂(IAA，2，4-D，NAA，IBA，BAP)的不同浓度和组合方式对其愈伤组织的诱导及其生长的影响进行了比较研究。

1.愈伤组织诱导中不同外植体和不同生长调节剂的筛选

绵果芥种子萌发到14-15d后，把无菌苗的下胚轴和子叶分别切成0.5cm长、0.5×0.3cm²面积，并接种附加现有技术中不同植物生长调节剂(IAA，2，4-D，NAA，IBA，BAP)的MS培养基及无加任何植物激素的MS基本培养基作为对照(CK)，参见见表1。所有培养基包含3％蔗糖和0.6％琼脂粉，PH值均调为6.0，在1.2×104kg/m²(121℃)下进行了灭菌20min(Shirin et al.，2007)。培养基放在温度为23±1℃、湿度为70-80％的黑暗条件下进行25d的培养。每18d更换培养基，培养基更换中把褐化的、污染外植体或愈伤组织被去掉(Kabir et al.，2008)。25d统计愈伤组织诱导率和分析质量。

表1.生长素和细胞分裂素的不同浓度及其配合方式

通过上述试验表明，愈伤组织的诱导最适合的外植体为子叶，最适合的生调节剂配合为MS+1.0mg/l IBA+0.1mg/l BAP，该配合的愈伤组织诱导率达到了100％，诱导出来的愈伤组织的手感为松脆(易碎)、颜色为绿色、产生量大、诱导期很早(6-9d)。

2.愈伤组织诱导中蔗糖浓度的筛选

将无菌苗的下胚轴和子叶分别切成0.5cm长、0.5×0.3cm²面积，并分别接种到附加1％、2％、3％、4％、5％的蔗糖的已筛选出来的培养基中。培养基附加的琼脂粉浓度和培养条件同2.1.1。25d统计愈伤组织诱导率和分析质量。

通过上述试验表明，蔗糖浓度3％或4％时，愈伤组织的产生量和生长势最好，得到的愈伤组织的手感较松散(易碎)、颜色为乳白色，是适合继续培养或提取次生代谢产物使用。反而蔗糖浓度1％、2％和5％时，愈伤组织的产生量均差。1％和2％时，得到的愈伤组织特硬，不能适用于继代培养。

3.愈伤组织诱导中培养条件的筛选

同样方法将无菌苗的下胚轴和子叶分别切成0.5cm长、0.5×0.3cm²面积，并接种到筛选出来的培养基中分别进行0d、5d、10d、15d、20d、25d暗处理。光照的光周期为16/8光照/黑暗。培养基附加的琼脂粉浓度、糖浓度和培养条件同步骤1。25d统计愈伤组织诱导率和分析质量。

通过上述试验表明，黑暗条件下的愈伤组织的诱导效率最好。

4.愈伤组织诱导相关指标

隔2d观察一次，记录愈伤组织诱导和生长情况，25d后统计愈伤组织的诱导率，并用定性分析法对愈伤组织的质量进行了分析。

愈伤组织的生产频率(愈伤组织的诱导率)按如下Kabir et al.(2008)的方法计算：

愈伤组织的质量主要由其诱导起始时间和持续天数、颜色、手感、生长势(大小)等指标进行描述和分析。诱导起始时间：该处理外植体诱导开始产生愈伤组织的天数。

由此可见，不同生长调节物质和外植体对早春短命植物绵果荠愈伤组织的诱导有极大影响。其中植物生长素和外植体来源起着关键作用，细胞分裂素对生长素的作用有促进效率。此外，光照和培养基所附含的蔗糖浓度对其愈伤组织的诱导也有一定的影响。从上述的结论可以看出，在离体培养中植物基因型还是起着主导作用。

实施例三：愈伤组织的增殖

本试验以建立一个绵果荠愈伤组织增殖的最佳体系为目的，把绵果荠下胚轴与子叶作为外植体，把现有技术中常用的不同植物生长调节剂(IAA，2，4-D，NAA，IBA，BAP)的不同浓度和组合方式对其愈伤组织增殖的影响进行了比较研究。

1.愈伤组织增殖的方法

将上述实施例中诱导出来的下胚轴和子叶的愈伤组织切成0.5×0.5cm²大小，放入附加不同植物激素配合的继代培养基中继代培养，参见表2。培养基附加的蔗糖、琼脂粉浓度和培养条件同2.1.1。

表2.生长素和细胞分裂素的不同浓度及其配合方式

通过上述试验表明，子叶诱导出来的愈伤组织的增值效率比下胚轴的好，其最有效的生长调节剂配方还是MS+1.0mg/l IBA+0.1mg/l BAP。该处理的愈伤组织的增殖倍数达到了5.3倍，愈伤组织的颜色为浅绿、手感为松散、鲜干重分别为0.999(±0.033)和0.022(±0.001)g/块。

2.愈伤组织增殖相关指标

每2d观察一次、隔5d测定愈伤组织的鲜重、25d测定愈伤组织的干重、计算增殖倍数、分析愈伤组织质量。

继代培养的愈伤组织增殖倍数按如下公式计算：

愈伤组织的干重(DW)按Summart et al.(2008)的方法测定：25d愈伤组织装在皮氏培养皿(Petri dish)中，放在烘干箱内，在50℃烘干到其恒重是取出来测定干重。

分析愈伤组织质量主要对其颜色、手感等指标进行描述。

由此可见，不同生长调节物质和外植体对早春短命植物绵果荠愈伤组织的增殖有极大影响。其中植物生长素和外植体来源起着关键作用，细胞分裂素对生长素的作用有促进效率。从上述的结论可以看出，在离体培养中植物基因型还是起着主导作用。

实施例四：不定芽的分化

1.分化培养基的筛选和培养条件

将绿颜色的、质地松散生长良好的胚性愈伤组织块切成0.5×0.5cm²大小转接到添加不同生长调节剂的培养基中，无加任何植物激素的MS基本培养基作为对照(CK)，参见表3。所有培养基包含3％蔗糖和0.6％琼脂粉，PH值均调为6.0。培养基放在温度为23±1℃、湿度为70-80％、光强为2000lx、光周期为16/8光照/黑暗的培养条件下进行了30d的培养。每3d观察一次，30d统计愈伤组织的分化率。

表3.生长素和细胞分裂素的不同浓度及其配合方式

2.相关指标的记录和计算方法

每3d观察一次，25d统计生根率。试验中同一个处理为5瓶，每瓶6块，同一设计重复3次。

每块愈伤组织诱导的不定根数按如下Kabir et al.(2008)的方法计算：

$\bar{X}=\frac{\mathrm{\Sigma xi}}{N}$

∑＝总和；Xi＝总不定根数；N＝总愈伤组织块做数。

不定根的发生率按如下Burbulis et al.(2008)的方法计算：

3.生长调节剂对不定芽分化的影响

本发明将绿颜色的、质地松散生长良好的、不同来源(子叶与下胚轴诱导)的胚性愈伤组织为研究材料，对其现有技术中不同生长调节剂(IAA，NAA，IBA，BAP，KT)的相应进行比较研究。无加任何植物激素的MS基本培养基作为对照(CK)。30d后统计诱导出芽的愈伤组织数，以高度大于0.2cm的不定芽为有效芽，计算每个处理的芽诱导率，统计每块愈伤组织产生芽数，计算平均每块愈伤组织诱导的芽数。

结果表明：不同来源的愈伤组织的分化效率和它们所适合的生长调节剂的配合方式不同。如，子叶愈伤组织的分化最佳的生长调节剂配合方式为MS+0.5mg/L IBA+1.0mg/L KT和MS+0.1mg/L IBA+2.0mg/L BAP，该配方的不定芽诱导率分别为80.00(±8.16)％和77.78(±11.11)％，平均每块愈伤组织诱导芽数分别为5.33(±0.62)％和5.00(±0.37)％。下胚轴的为MS+0.1mg/LIAA+1.0mg/L BAP，该处理的分化率为91.67(±8.33)％，平均芽数为6.45(±0.68)。

实施例五：不定根的诱导

1.生根培养基的筛选和培养条件

选用1/2MS培养基为基本培养基，选择现有技术中不同生长调节剂的不同浓度NAA(0.1mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L、3.0mg/L)、IAA(0.1mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L、3.0mg/L)和IBA(0.1mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L、3.0mg/L)为生根培养基。所有培养基包含3％蔗糖和0.6％琼脂粉，PH值均调为6.0。培养基放在温度为23±1℃、湿度为70-80％、光强为1000lx、光周期为16/8光照/黑暗的培养条件下进行了25d的生根培养。

2.相关指标的记录和计算方法

每3d观察一次，25d统计生根率。试验中同一个处理为5瓶，每瓶3个，同一个设计重复3次。

不定芽分化率的计算方法同不定根发生率计算的方法，即按如下公式：

3.生长素种类及其浓度对不定根诱导的影响

生根培养过程中，以根长达到0.5cm的根为有效根，统计每个处理平均生根率、并测定根长及根生长状况。观察期为25天。

试验结果表明：生长素种类不同诱导不定根的效应不同，依次排序为NAA＞IAA＞IBA。此外，不同浓度的同一类生长素的不定根的诱导效率不同。如，随着NAA和IAA浓度的增加，发根率呈降低趋势，反而随着IBA浓度的增加，发根率呈升高趋势。本发明中发根率最佳的配方为1/2 MS+0.1mg/L NAA，该处理不定根的诱导率为80.00(±13.33)％，平均根长为4.05(±0.42)cm。

实施例六：植株再生

选在分化培养基里分化的愈伤组织接种到已筛选出的分化培养基中，观察植株再生情况。培养温度23±1℃、光照强度2000Lx、光照时间为16h/d。