没食子提取物在制备抑制结肠癌细胞增殖的药物中的用途

摘要

本发明涉及一种没食子提取物在制备抑制结肠癌细胞增殖的药物中的用途，本发明以人结肠癌HT-29细胞为实验载体，采用MTT、流式细胞术等实验方法，从癌细胞增殖和凋亡角度阐述没食子提取物对人结肠癌HT-29细胞的作用特点，通过抑制细胞增殖及诱导细胞凋亡的方式，抑制结肠癌细胞的生长，这种作用具有浓度-效应依赖性关系。从分子生物学水平上揭示了没食子提取物的抗结肠癌作用部位即新靶点，为结肠癌的防治提供新的天然药物。

说明书

技术领域

本发明涉及一种没食子提取物在制备抑制结肠癌细胞增殖的药物中的用途。

背景技术

维吾尔医药是维吾尔民族在长期生活，生产和同疾病斗争中积累起来的经验和智慧的结晶，是祖国医药的一个重要组成部分，无论在基础理论方面，还是在医疗方法和用药规则方面都独树一帜，并已形成比较完备，独特的理论体系。没食子自古以来在维吾尔医学中被视为治疗各种急、慢性炎症性疾病的良药，具有消炎、止血、固涩、收敛的功效，用于治疗牙周炎、泻痢不止、习惯性肠炎等。没食子的主要成分是鞣质，鞣质又称单宁(tannin)，是存在于自然界的一类结构比较复杂的多元酚类化合物，具有收敛、抗炎、抗过敏、抑菌、抗病毒、抗肿瘤、止血、镇痛、降血脂、降血糖、增强肾功能等作用。由于鞣质具有较多的邻位酚羟基，易被氧化，因此，很难获得单体，国内外也对鞣质化学成分的研究很少。

溃疡性结肠炎是一种原因未明与自身免疫有关的炎症性肠病，以腹泻、粘膜脓血症、腹痛及里急后重为主要症状，以结肠粘膜慢性炎症和溃疡形成为病理特点的消化道常见病和疑难病。研究发现，溃疡性结肠炎和结肠癌发生之间存在联系，认为有部分溃疡性结肠炎病例最终可发展为结肠癌。结肠炎的癌变主要决定于结肠炎的发生程度、发生部位及病程长短。虽然临床采用非甾体抗炎药物治疗可以降低结肠炎的癌变率，但长期服用，药物的副作用使病人难以耐受，并且非甾体抗炎药物同时增加了消化道溃疡和出血的概率，在肠道反复出血和末端回肠炎反复发作的患者中，该类药物的使用是相对禁忌的。因此，寻找新的治疗药物，有效控制结肠炎的发展，并阻止结肠炎的癌变，一直是研究者们关注的热点。

研究发现，细胞的异常增殖及分化受到抑制是肿瘤发生的主要机制。对细胞凋亡的研究发现，正常组织的相对稳定实际上是细胞增殖、分化和凋亡之间的动态平衡。肿瘤细胞的增殖、凋亡不仅受到药物、放射线等多种因素和途径的影响，而且某些肿瘤基因或肿瘤抑制基因对细胞凋亡也起重要的调控作用。

本发明是根据已获得的“防治口腔病的口洁液及制备方法”(专利号为ZL 97116074.0)的基础上，研制开发没食子(西帕依)固龈液，并被列入为《中华人民共和国卫生部药品标准-维吾尔药分册》1999年版收载品种(编号：02CJ-15-02-13)。将没食子(西帕依)固龈液通过改变其给药途径增加新的适应症，以灌肠的方式使用于溃疡性结肠癌的治疗得到了良好的临床疗效。

研究表明，药品没食子(西帕依)固龈液的主要成分为没食子提取物，对慢性溃疡性结肠炎的腹痛、腹泻和脓血症等疗效显著；对金黄色葡萄球菌、β-溶血性链球菌、肺炎双球菌等口腔疾病的常见致病菌有很强的抑制作用；明显抑制角叉菜胶所致小鼠足跖肿胀及大鼠腹腔白细胞游出；抑制醋酸所致小鼠毛细血管通透性增加；抑制棉球肉芽肿；抑制醋酸所致小鼠扭体反应及酵母所致大鼠体温升高；延长小鼠游泳时间；抑制DNCB诱导的小鼠迟发型超敏反应；能使小鼠凝血时间明显缩短，证明其对急、慢性炎症反应均有显著抑制作用，并能有效抑制炎症阶段毛细血管的通透性，减轻渗出反应，同时有较强的解热镇痛及抗疲劳功能。

本发明针对药品名为没食子固龈液在治疗溃疡性结肠炎的临床有效性及溃疡性结肠炎和结肠癌发生之间的内在联系，对药品没食子固龈液中的主要成分没食子提取物抑制人结肠癌细胞HT-29增殖及诱导其调亡的应用加以阐述，增加了该制剂的临床使用范围，为结肠癌的防治提供了新的天然药物。在国内外尚未发现没食子固龈液应用于人体抑制HT-29增殖及诱导其调亡中的报道。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种没食子提取物在制备抑制结肠癌细胞HT-29的药物中的用途，本发明是在“防治口腔病的口洁液及制备方法”(专利号为ZL 97116074.0)的基础上，对防治口腔病的口洁液提供了新的用途。本发明以人结肠癌HT-29细胞为实验载体，采用MTT、流式细胞术等实验方法，从癌细胞增殖和凋亡角度阐述”防治口腔病的口洁液“中的主要成分没食子提取物对人结肠癌HT-29细胞的作用特点，通过抑制细胞增殖及诱导细胞凋亡的方式，抑制结肠癌细胞的生长，这种作用具有浓度-效应依赖性关系。从分子生物学水平上揭示了没食子提取物的抗结肠癌作用部位即新靶点，为结肠癌的防治提供新的天然药物。

本发明所述的一种没食子提取物在制备抑制结肠癌细胞HT-29的药物中的用途，是在浓度为5×10⁴个/ml的对数生长期人结肠癌HT-29细胞悬液中加入没食子提取物，使其最终浓度达到：0.01ug/ul、0.025ug/ul、0.05ug/ul、0.1ug/ul、0.25ug/ul、0.5ug/ul、1.0ug/ul、2.5ug/ul或5ug/ul，在5％CO₂，温度37℃，共同培育3，6，12，24，48，72小时，采用MTT比色法测定没食子提取物对人结肠癌HT-29细胞增殖的抑制作用，结果证明，没食子提取物能够以时间依赖性和浓度依赖性的方式抑制人结肠癌HT-29细胞增殖。

所述的一种没食子提取物在制备抑制结肠癌细胞HT-29的药物中的用途，是在浓度为5×10⁴个/ml的对数生长期人结肠癌HT-29细胞悬液中加入没食子提取物，使其最终浓度达到：0.1ug/ul、0.25ug/ul、0.5ug/ul、1.0ug/ul或2.5ug/ul，在5％CO₂，温度37℃，共同培育48，72小时，采用流式细胞术测定没食子提取物对结肠癌HT-29细胞凋亡的诱导作用，结果证明，没食子提取物能够以浓度依赖性方式诱导人结肠癌HT-29细胞凋亡。

本发明所述的没食子提取物，是将没食子药材20g，粉碎，加水200ml，浸泡1小时后，煎煮0.5小时，共煎煮3次，合并煎液，采用板框法过滤，滤液中依次加入2g甜蜜素、1ml薄荷香精及0.5g苯甲酸钠，搅拌使溶解均匀，加水使药液体积调整至1000ml，分装、灭菌，即可。

具体实施方式

本发明所述的没食子提取物在制备抑制结肠癌细胞HT-29的药物中的用途的技术方案是通过以下途径来实现：

1.实验材料

1.1药物与试剂

防治口腔病的口洁液        新疆奇康哈博维药有限公司

DMEM                      美国Gibeo公司产品

人结肠癌HT-29细胞         上海生化与细胞生物学研究所

胎牛血清                  杭州四季青生物工程材料研究所

无水乙醇                  北京化工厂

MTT                       美国Amresco公司产品

胰蛋白酶                  美国Sigma公司产品

1.2主要仪器

超净工作台                THEMOR

CO₂孵箱                   THEMOR

电子天平                  沈阳龙腾

-20℃、4℃低温冰箱        西门子

流式细胞仪                美国BECKMAN公司产品。

细胞计数板                上海求精公司产品。

台式高速冷冻离心机        Beckman Coulter^TM，美国

倒置相差显微镜            日本OLMPUS

2.实验方法

2.1细胞培养

人结肠癌细胞株HT-29生长于含10％胎牛血清的DMEM培养基中，温度37℃，5％CO₂饱和湿度的细胞培养箱中进行培养，每2-3天更换培养液一次，取对数生长期的细胞用于实验。

2.2MTT法检测没食子提取物抑制人结肠癌HT-29细胞增殖的作用

(1)收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度为5×10⁴个/ml，每孔加入100μl，铺板；

(2)5％CO₂，温度37℃孵育，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)，加入没食子提取物，药物最终浓度达到：0.01ug/ul、0.025ug/ul、0.05ug/ul、0.1ug/ul、0.25ug/ul、0.5ug/ul、1.0ug/ul、2.5ug/ul或5ug/ul，每组设4个复孔，同时设置空白对照组；

(3)5％CO₂，温度37℃孵育，继续培养3h、6h、12h、24h、48h和72h，每孔加入20ulMTT溶液(5mg/ml，即0.5％MTT)，再继续培养4h；

(4)终止培养，小心吸去孔内培养液；

(5)每孔加入150μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解，在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光度值(A值)，同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)；

(6)实验重复3次；

(7)抑制率的计算：抑制率＝[(对照组A值-空白组A值)-(实验组A值-空白组A值)]/(对照组A值-空白组A值)×100％。结果见表1

表1没食子提取物对人结肠癌HT-29细胞增殖的抑制作用(n＝12)

注：SPSS 13.0统计软件，重复测量方差分析，组内(不同时间段)比较差异有统计学意义(F＝6.12，P＜0.05)，组间(阴性对照组及不同浓度KJA)比较差异有统计学意义(F＝12.07；P＜0.05)。

结果：没食子提取物对人结肠癌HT-29细胞增殖的影响

本实验用不同浓度没食子提取物作用于人结肠癌HT-29细胞，分别培育3h，6h，12h，24h，48h，72h后，观察药物对细胞增殖的影响。经MTT比色法测定和重复测量方差分析得出以下结果(表1)：随时间延长，同一浓度没食子提取物对人结肠癌HT-29细胞的抑制率呈现升高趋势，具有时间-效应依赖性关系；同一时间，随浓度的增加，没食子提取物对细胞增殖的抑制作用增强，具有浓度-效应依赖性关系。二者均表明：没食子提取物干预人结肠癌HT-29细胞后，活细胞数量减少，细胞增殖受到抑制。

2.3流式细胞仪检测没食子提取物诱导结肠癌细胞凋亡的作用

(1)将处于对数生长期的人结肠癌HT-29细胞，胰蛋白酶消化，制成细胞浓度为5×10⁴个/mL单细胞悬液；

(2)将上述细胞悬液种入10培养瓶，5ml/瓶，待进入对数生长期，使药物浓度达到0.1ug/ul、0.25ug/ul、0.5ug/ul、1ug/ul或2.5ug/ul，继续培养48h，72h，同时设阴性对照组；

(3)把细胞培养液吸出至离心管内，PBS洗涤贴壁细胞一次，用胰酶细胞消化液消化细胞；

(4)细胞消化下来后，加入步骤(3)中收集的细胞培养液，稍混匀，转移到离心管内，1000rpm，离心5分钟，弃上清，收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞并计数，达到1×10⁶个/mL；

(5)3000rpm，离心2分钟，弃上清，收集细胞，加入400μLBanding Buffer重悬细胞，加入5μl Annexin V-FITC，然后来回颠倒混匀细胞悬液，将其至于4℃，避光15分钟；

(6)加入10μl碘化丙啶染色液，来回颠倒混匀细胞悬液，4℃避光放置5分钟；

(7)进行流式细胞仪检测。

表248小时没食子提取物作用人结肠癌HT-29细胞的凋亡率(n＝3)

注：△表示与对照组相比，组间差异有统计学意义(P＜0.05)。

★表示KJA2.5ug/ul组与其余各组相比，组间差异有统计学意义(P＜0.05)。

表372小时没食子提取物作用人结肠癌HT-29细胞的凋亡率(n＝3)

注：△表示与对照组相比，组间差异有统计学意义(P＜0.05)。★表示KJA2.5ug/ul组与其余各组相比，组间差异有统计学意义(P＜0.05)。■表示KJA0.1ug/ul组与1.0ug/ul组相比，差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.4统计学处理

采用SPSS13.0统计软件，用均数士标准差()表示，采用方差分析。P＜0.05表示差别有统计学意义。

结果：没食子提取物对人结肠癌HT-29细胞凋亡的影响

以没食子提取物作用人结肠癌HT-29细胞48h和72h后，采用Annexin V-FITC/PI双标记，流式细胞术(FCM)分析凋亡细胞，结果显示：没食子提取物作用48h，72h后，早期凋亡的细胞和晚期凋亡的细胞均明显多于阴性对照组(表2，3)：同一时间段，随浓度的增加，没食子提取物诱导细胞凋亡具有浓度-效应依赖性关系；等浓度没食子提取物在不同时间诱导细胞凋亡的作用无统计学意义。

结论：

MTT实验表明，没食子提取物对结肠癌HT-29细胞具有一定的增殖抑制和杀伤效应，从0.5ug/ul开始对结肠癌HT-29细胞具有明显的增殖抑制作用(P＜0.05)。随着没食子提取物浓度增加，作用时间逐渐延长，细胞的存活率逐渐降低，结肠癌HT-29细胞受到的增殖抑制作用明显增强。没食子提取物处理结肠癌HT-29细胞72小时后，结肠癌HT-29细胞的增殖抑制率达到了88.35％。结果显示了没食子提取物对结肠癌HT-29细胞具有较强的增殖抑制作用，并且具有时间、剂量效应依赖性。实验结果显示，没食子提取物浓度较低时(5ug/ul)能显著抑制结肠癌HT-29细胞的增殖，对正常细胞及正常组织的毒性大大降低，有望成为一种安全、有效的治疗溃疡性结肠炎及防止其癌变的药物。

流式细胞仪实验表明，结肠癌HT-29细胞由没食子提取物处理48h、72小时后，经AnnexinV/PI双染，流式细胞仪检测显示：与阴性对照组比较，没食子提取物处理组细胞凋亡率明显上升，具有浓度-效应依赖性，最大凋亡率为85.77±7.03％，约为阴性对照组的10倍。结果表明，没食子提取物能显著诱导人结癌细胞HT-29的凋亡。

经过试验表明：没食子提取物通过抑制人结肠癌HT-29细胞增殖和诱导细胞凋亡达到治疗和预防结肠癌的目的。