多用试样准备系统及其在集成分析系统中的使用

摘要

本发明提供使微芯片接口于筒和气动集管的装置和方法。筒、微芯片和气动集管可与诸如热调节装置以及分离和分析装置那样的下游准备装置集成在一起。

说明书

交互参照

本申请要求对以下两个申请的优先权益：2008年1月22日提交的美国临时申请61/022,722以及2008年12月23日提交的美国临时申请61/140,602，本文以参见方式引入其全部内容。

关于联邦资助研究的声明

本发明的诸方面是在美国国防部授予的一个或多个项目号W911SR-04-P-0047和美国国家卫生研究所授予的资助号5R01HG003583下通过政府支持而作出的。美国政府对于本发明可有某些权利。

背景技术

试样准备是生物学分析系统中普遍存在的问题。从各种活体试样类型中提取足够纯净的目标物以便可靠地进行下游的分析化验的问题是普遍深入的问题，该问题包括细胞生物学、染色体、蛋白质组学、代谢、食品生物学、分子诊断以及许多其它生物学和医学的化验。在试样准备方面取得了许多进步的同时，主要的解决方案是开发出各种可供手工使用或机器人系统中使用的试剂，机器人系统使用直线级或多轴臂来操纵试样。

微流体学和毫微流体学允许准备微量的试样体积作分析。其优点包括降低了操作成本的毫微级的试剂消耗以及消除操作者差异的全自动化操作。微流体的试样准备既可接口于现有的或将来的检测方法，也可以是完全集成化系统的一部分。在本申请中，公开了各种方法和装置，它们集成了体积超过10mL的全体积的试样准备以及微升的和更小体积的试样准备，来作试样准备和分析。

从试样开始，本发明可应用于富集的和预分离的组分用于进一步的处理，以检测和分类基体中各种有机物，包括浮质试样、水、液体、血液、粪便、鼻腔、口腔和其它的拭子(swab)、体液、用ELISA、PCR或其它核酸扩增技术进行分析的环境试样、单一分子检测、蛋白阵列、质量光谱学，以及其它本技术领域内技术人员众所周知的分析方法。

可进行微流体核酸纯化来准备用于核酸化验的试样。对于DNA分析，PCR扩增是目前采用的一种方法。微阵列DNA、RNA和蛋白分析在试样可施加到微阵列作反应和读取之前也需要大量的试样准备。

试样可通过多种基底和基体获得。基体可包含复杂的包括抑制化合物的混合物，抑制化合物诸如亚铁血红素、蓝靛、腐殖酸、二价阳离子和蛋白质等，它们会与DNA基的扩增相干扰。浮质可包含大量的真菌、金属和土壤腐殖质和其它各种与PCR扩增相干扰的酸-金标准。

早期工作表明，少至三个种子的有机物可由土壤萃取物的稀释试样进行检测，其后是两个16S核醣体的基因碎片的PCR扩增。对于16S和18S rDNA PCR扩增，可使用通用引物，利用低熔点的琼脂糖从土壤试样中萃取DNA。可使用柱状格式的旋转分离的凝胶，例如，交联葡聚糖柱，塞法戴克斯(Sephadex)[商标名]。开发了多步骤的纯化过程，诸如与交联葡聚糖柱组合的有机物萃取。珠粒搅打被发现为是对大量有机物准备试样并在液氮中研磨而探测少量有机物的有效方式。尽管这些方法是有效的，但它们最适合于实验室研究环境。

固态萃取物到柱状物、珠粒和表面可在DNA分析之前用来纯化DNA。蛋白酶K后联Qiagen QLA Amp硅石凝胶薄膜柱状物和IsoCode Stix，这是一种浸渍的薄膜基技术，其后，加热、清洗并对缓冲器内B.anthracis Steme植物细胞、血清和缓冲器内全部血液和孢子作简要的离心比较，可以发现工作得很好。

可使用本发明的装置和方法进行各种分离。例如，本发明的装置和方法可用来进行色谱法、相变基或磁性基的分离、电泳、蒸馏、萃取和过滤。例如，微流体通道或毛细现象可用于色谱法或电泳法。同样，诸如磁性珠的珠粒可用于相变基分离和磁性基分离。珠粒或这里所述的任何其它表面都可用粘结半族实现功能化，所述半族对目标显现出特殊的或非特殊的粘结。该粘结可基于静电、范德华(van der Walls)互相作用、疏水性、亲水性、氢键结合、离子互相作用，以及部分的共价互相作用，就像金和硫之间显现出的共价作用。在优选实施例中，本发明的装置和方法利用免疫磁性分离。

免疫磁性分离(IMS)是一种有效的技术，其允许在单一步骤中使用机械上简化的利用顺磁性的珠粒和磁场的格式捕捉和集中目标(参见Grodzinski P，Liu R，Yang J，Ward MD的“Microfluidic system integration in sample preparationmicrochip-sets-a summary(集成在试样准备微芯片组中的微流体系统-摘要)”Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc.2004；4：2615-8.，People MC，Karnes HT。“Microfluidic immunoaffinity separation for bioanalysis(用于生物学分析的微流体免疫亲合力分离)”J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci.2007.08.30.，以及Stevens KA，Jaykus LA的“Bacterial separation andconcerntration from complex sample matrices：a review(从复杂试样基体中分离细菌和富集)”.Crit Rev Microbiol.2004；30(1)：7-24.)。IMS可用来捕获、集中和纯化特殊的目标抗原、蛋白质、毒素、核酸、细胞和孢子。虽然IMS起初的用途涉及使用抗体，但我们可使其用途一般化，包括其它特殊亲合力的互相作用，其包括外源凝集素、DNA-DNA、DNA-RNA、生物素-链霉素，以及连接到固态的其它亲合力的互相作用。IMS通过将特殊的亲合力试剂(通常是抗体或DNA)连接顺磁性珠粒进行工作，所述顺磁性珠粒仅在外部磁场存在的情况下才呈磁性。珠粒可添加到诸如浮质、液体、体液或食品之类的复杂试样中。在目标粘附到亲合力试剂(其本身粘结到顺磁性珠粒上)之后，珠粒通过施加磁场而被捕获。通过用相容的缓冲剂进行清洗可除去未粘结或松弛粘结的材料，这使目标物从原始试样内的其它不希望的材料中纯净化出来。因为珠粒很小(从nm至um)，当珠粒被磁场集中起来时，它们通常形成只有nL-μL体积的珠粒床，因此在纯化的同时将目标集中起来，所以目标的粘结水平很高。纯化和集中的目标可方便地进行运输、改变本性、在珠粒上作细胞溶解或分析、或洗脱珠粒，以作进一步试样准备或分析。

免疫磁性的分离广泛地用于许多应用中，包括探测食品、体液和其它基体内的微有机物。顺磁性珠粒可容易地混合和操作，并适于微尺度和微流体的应用。该技术对宏观尺度至微观尺度的接口提供良好的解决方案：珠粒几乎是理想的媒介物，使宏观尺度的试样纯化，然后富集到毫微尺度(nL的100倍)，以引入到微流体或毫微流体的平台内。免疫磁性分离通常用作实时PCR、电化学发光和磁性力辨别之前的上游纯化步骤。

在微芯片上移动流体的能力是相当地重要。本发明描述了试样捕获和纯化、微型分离、微型阀、微型泵和微型路由器、毫微流体控制和毫微尺度的生物化学中的各种技术。该技术的关键部件是微机芯片阀(MOVe：Micro-roboticOn-chip Valves)技术(其一个实例显示在图1中)及其在微型化和自动化复杂工作流动中的应用。MOVe阀、泵和路由器和仪器一起进行操作，可被称之为微芯片流体处理平台。

微芯片流体处理平台技术的核心是MOVe泵、阀和运输、处理和能分析试样的路由器。最初由加利福尼亚州伯克利大学(U.C.Berkeley)Mathies实验室开发的这些新颖的外部致动、气动驱动的、芯片内阀、泵和路由器可在20nL至10μL的操作体积上控制流体流动(Grover，W.H.A.M.Skelley，C.N.Liu，E.T.Lagally，以及R.M.Mathies.2003“Sensors and Actuators(传感器和致动器)”B89：315-323；Richard A.Mathies等人的美国专利申请20040209354A1，2004年10月21日，本文以参见方式引入它们的全部内容)。

MOVe阀和泵(图1)可组合两个玻璃微流体层与聚二甲基硅氧烷(PDMS)的可变形薄膜层，可变形薄膜层可打开和关闭阀和气动层以使薄膜变形和致动阀门。蚀刻在顶部玻璃流体晶片内的微流体通道是不连续的，并通过“经由晶片”和微流体通道通向阀座，该阀座是常闭的(图1A)。当真空通过传统水平的真空和压力源施加到气动位移腔室上时，常闭的PDMS薄膜从阀座提升而打开阀(图1B)。图1的底部板示出比例与其它板类似的阀的俯视图。

三个微型阀可用来使微芯片的微型泵将流体从微芯片A上的输入区域移动到输出区域。流体由三个或更多个阀移动。诸阀可形成为致动一可变的结构。在某些实施形式中，可形成阀座，而在其它实施例中，不需要阀座。图2从顶部到底部示出MOVe装置：阀、路由器、混合器、珠粒的捕捉。自启动的MOVe泵(图2顶部)通过协调三个阀的操作而形成，并可在任何一方向形成流动。路由器由三个或更多个MOVe阀形成(图2，顶部中间板)。混合对于微流体来说是已经是圣盘：MOVe混合器(图2，底部中间板)径向地混合试样和试剂。MOVe装置与磁性珠粒一起精巧地工作来泵送或驻留成组的珠粒(图2，底部板)。

常闭MOVe阀、泵和路由器是耐用、可以低成本容易制造，并可以密集阵列进行操作，且具有小的死体积。MOVe阀、泵和路由器阵列容易在微芯片上进行制造。重要的是，微芯片上的所有MOVe阀、泵和路由器是在简单制造过程中使用单片的PDMS薄膜同时形成的-它与在微芯片上制作5个MOVe微型泵而形成500成本相同。该创新技术首次提供了在微芯片上形成复杂的微流体和毫微流体的回路的能力。

讨论微芯片使用和设计的专利和专利申请包括：2007年12月25日发表的美国专利7,312,611；2001年2月20日发表的美国专利6,190,616；2002年7月23日发表的美国专利6,423,536；2005年3月22日发表的美国专利10.633,171；2005年3月22日发表的美国专利6,870,185；2001年1月25日提交的美国专利申请US 2001-0007641；2002年4月18日提交的美国专利申请US 20020110900；2005年9月15日提交的美国专利申请20070248958；2003年12月29日提交的美国专利申请US 20040209354；2003年12月29日提交的美国专利申请US 2006/0073484；2005年5月25日提交的US20050287572；2007年3月21日提交的美国专利申请US 20070237686；2004年11月24日提交的US 20050224352；2005年9月15日提交的US 20070248958；2007年2月2日提交的US 20080014576；以及2006年7月26日提交的美国专利申请US 20070175756；本文以参见方式引入所有这些专利和专利申请的全部内容。

发明内容

在一个方面，本发明提供一种装置，该装置包括：微流体微芯片，该微芯片包括流体地连接到微流体微芯片中至少一个微流体通道的至少一个端口孔，其中，该通道包括至少一个控制流体通过通道的运动的阀；以及匹配于微芯片并包括腔室的筒，其中，所述腔室包括两个腔室孔，它们各与所述微流体微芯片的端口孔对齐。在一个实施例中，所述筒适于接纳至少一个试样或至少一个试剂。在另一实施例中，所述筒流体地连接到匹配于另一微芯片的另一筒。在另一实施例中，所述筒包括至少两个腔室。在另一实施例中，所述至少两个腔室中的至少一个腔室邻近于可移动的磁体。在另一实施例中，所述至少两个腔室中的至少一个腔室是温度控制的。在另一实施例中，所述至少两个腔室中的至少一个腔室包括过滤器。在另一实施例中，所述至少一个腔室包括大于或等于5μL的流体体积。在另一实施例中，所述至少一个腔室包括大于或等于10μL的流体体积。在另一实施例中，所述筒的流体体积是所述微流体微芯片的流体体积的100倍。在另一实施例中，所述至少一个腔室中的一个腔室还包括过滤器。在另一实施例中，所述装置还包括将磁场施加到筒或微流体微芯片上的磁体。在另一实施例中，所述阀是以气动方式致动的。在另一实施例中，所述筒适于连接到至少一个压力源，用来输送所述至少一个试剂或所述至少一个试样。在另一实施例中，所述压力源向所述筒提供正压或负压。在另一实施例中，所述至少一个压力源受气动螺线管控制。在另一实施例中，所述至少一个压力源是气动的集管。在另一实施例中，微流体微芯片包括流体层、弹性体层和气动层。在另一实施例中，所述筒还包括至少一个输入端口，其中，所述至少一个输入端口适于与输送装置相匹配，其中，所述输送装置流体地连接到所述微流体微芯片的流体层；以及其中，所述至少一个腔室中的一个腔室是流体地连接到所述微流体微芯片的流体层的闭合的反应室。在另一实施例中，所述输送装置在热力学上连接到温度调制器。在另一实施例中，所述输送装置是注射器。在另一实施例中，所述筒设计成从所述试样中富集至少一个组分，并包括至少一个试样输入端口，其中，所述至少一个腔室是闭合的包括珠粒的反应室，且其中，所述珠粒粘结到所述至少一个组分。在另一实施例中，所述筒还包括至少一个试剂容器，该试剂容器包括用来扩增核酸的试剂，其中，至少一个试剂容器通过微芯片流体地连接到腔室。在另一实施例中，所述筒还包括至少一个珠粒容器，该珠粒容器包括用来粘结已扩增核酸的珠粒，其中，至少一个珠粒容器通过微芯片流体地连接到所述腔室。在另一实施例中，所述珠粒是顺磁性珠粒或玻璃珠粒。在另一实施例中，至少一个组分与珠粒的所述粘结是可逆的。在另一实施例中，所述珠粒是顺磁性珠粒，其中，所述装置还包括可移动磁体，其可将所述顺磁性珠粒吸引到所述闭合反应室的壁上。在另一实施例中，所述筒设计成从试样中富集至少一个组分，其中，所述至少一个组分是DNA、RNA、微RNA、siRNA、蛋白质、脂质或聚糖。

在另一方面，本发明提供一种实施生物化学反应的方法，该方法包括：(a)提供包括微流体微芯片的装置，所述微流体微芯片包括至少一个流体地连接到微流体微芯片内至少一个微流体通道的端口孔，其中，该通道包括控制流体通过通道的运动的至少一个阀；以及匹配于微芯片并包括腔室的筒，其中，所述腔室包括两个各与所述微流体微芯片的端口孔对齐的腔室孔，以及(b)在所述腔室内实施至少一个酶反应。在一个实施例中，所述至少一个酶反应包括：绑扎、弄钝、缺口修复、改性、聚合物化、水解、磷酸化或它们的任何组合。在另一实施例中，该方法还包括使用固态颗粒来分离所述酶反应的产物。

在另一方面，本发明提供一种从试样中富集至少一个组分的方法，该方法包括：(a)使输送装置与装置的输入端口匹配，该装置包括：微流体微芯片，所述微流体微芯片包括至少一个流体地连接到微流体微芯片中的至少一个微流体通道的端口孔，其中，所述通道包括至少一个控制流体通过通道的运动的阀；以及匹配于微芯片并包括腔室的筒，其中，所述腔室包括两个各与所述微流体微芯片的端口孔对齐的腔室孔，其中，所述筒还包括至少一个输入端口，其中，所述至少一个输入端口适于匹配于输送装置，其中，所述输送装置流体地连接到所述微流体微芯片的流体层；以及其中，所述至少一个腔室之一是流体地连接到所述微流体微芯片的流体层的闭合反应室，(b)用至少一个试剂处理所述试样，以提高所述至少一个组分进行富集的可供性，(c)将所述至少一个组分输送到所述筒的所述至少一个反应室，(d)将所述组分粘结到所述至少一个闭合反应室内的一个或多个颗粒上，(e)清洗所述颗粒粘结的组分以除去废料，以及(f)洗脱所述颗粒粘结的组分。在一个实施例中，所述输送包括：通过微流体微芯片的所述至少一个阀将所述至少一个组分泵送到所述至少一个反应室。在另一实施例中，所述粘结包括：通过微流体微芯片的所述至少一个阀将所述颗粒从筒中的试剂端口泵送到所述至少一个反应室。在另一实施例中，所述颗粒是顺磁性珠粒、毫微颗粒、树脂，或固态颗粒。在另一实施例中，所述至少一个组分是DNA、RNA、微RNA、siRNA、蛋白质、脂质或聚糖。在另一实施例中，步骤(b)还包括在热力学上调制所述输送装置。在另一实施例中，步骤(b)还包括从所述筒上的试剂端口将裂解试剂或组分隔离试剂输送到所述输送装置内以提高所述至少一个组分进行富集的可供性。在另一实施例中，步骤(d)的珠粒是顺磁性珠粒。在另一实施例中，所述清洗步骤(e)包括用可移动磁体来吸引所述顺磁性珠粒。在另一实施例中，所述微流体微芯片沿第二方向引导所述废料的流动。在另一实施例中，步骤(c)包括使用微流体微芯片中的气动方法致动的阀或外部压力源，来将所述至少一个组分输送到所述筒的所述至少一个闭合的反应室。在另一实施例中，外部压力源将正压或负压输送到微流体微芯片。在另一实施例中，所述试样输送装置是注射器。

在另一方面，本发明提供一种装置，其包括：(a)第一流体操纵模块，该第一流体操纵模块包括：(i)包括流体地连接到微流体微芯片中的微流体通道的端口孔的第一微流体微芯片，其中，通道包括至少一个控制流体通过通道的运动的阀；以及(ii)匹配于微流体微芯片的筒，所述筒包括至少一个试样输入端口、至少一个腔室、出口端口，其中，试样输入端口连接到端口孔，其中，所述至少一个出口端口中的至少一个与所述第一微流体微芯片的出口端口孔对齐，且其中，所述至少一个腔室流体地连接到所述第一微流体微芯片的流体层；(b)反应通道，其中，所述反应通道不被包含在所述第一微芯片内；(c)温度调制器，其中，所述反应通道流体地连接到所述筒上的端口，所述筒又流体地连接到所述出口端口，所述反应通道的至少一部分与所述温度调制器热接触；以及(d)磁体，其用于将磁场施加到微流体微芯片、筒或反应通道。在一实施例中，所述磁体邻近于所述反应通道。在另一实施例中，所述装置还包括通过所述反应通道流体地连接到所述第一微流体微芯片的第二微流体微芯片。在另一实施例中，所述温度调制器是珀耳帖装置。在另一实施例中，所述装置还包括顺磁性珠粒。

在另一方面，本发明提供一种方法，该方法包括：将含有核酸的试样输送到一种装置内，该装置包括：(a)第一流体操纵模块，该模块包括：(i)包括流体地连接到微流体微芯片中微流体通道的端口孔的第一微流体微芯片，其中，通道包括至少一个控制流体通过通道的运动的阀；以及(ii)匹配于微流体微芯片的筒，所述筒包括至少一个试样输入端口、至少一个腔室、出口端口，其中，试样输入端口连接到端口孔，其中，所述至少一个出口端口中的至少一个与所述第一微流体微芯片的出口端口孔对齐，且其中，所述至少一个腔室流体地连接到所述第一微流体微芯片的流体层；(b)反应通道，其中，所述反应通道不被包含在所述第一微芯片内；(c)温度调制器，其中，所述反应通道流体地连接到所述筒上的端口，所述筒又流体地连接到所述出口端口，所述反应通道的至少一部分与所述温度调制器热接触；以及(d)磁体，其用于将磁场施加到微流体微芯片、筒或反应通道；一次或多次地将核酸和有效量的试剂运送通过反应通道的与温度调制器热接触的部分；以及扩增核酸；以及分析已扩增的核酸。在一实施例中，该方法还包括使用温度调制器来实施热循环。在另一实施例中，所述试剂是用于聚合酶链式反应或循环测序的试剂。

在另一方面，本发明提供一种装置，该装置包括：(a)包括流体层、致动层和气动层的第一微流体微芯片，其中，流体层包括一个或多个微流体通道，其中，所述一个或多个微流体通道中的至少一个包括出口孔，(b)柔性连接器，其流体地连接到柔性连接器的第一端处的出口孔；(c)流体地连接到所述柔性连接器的毛细管；以及(d)第一电极和第二电极，其中，第一电极和第二电极构造成产生沿着毛细管路径的电场。在一个实施例中，柔性连接器是外科的聚四氟乙烯的或硅的管子。在另一实施例中，柔性连接器是弹性管子。在另一实施例中，柔性连接器的外直径约为1.5至3mm，内直径约为0.25至0.5mm。在另一实施例中，柔性连接器还在其第二端处流体地连接到第二微流体微芯片或第一微流体微芯片。在另一实施例中，通过套管、提升管、微型管或阿普彻奇(upchurch)管适配器，将柔性连接器流体地连接到出口孔。在另一实施例中，毛细管的外直径约为150-500微米，内直径约为10-100微米。在另一实施例中，毛细管涂敷有聚酰胺或聚四氟乙烯。在另一实施例中，毛细管包括分离凝胶。在另一实施例中，毛细管长度约为10至100cm。在另一实施例中，第一电极是叉形电极。在另一实施例中，所述叉形电极包括一个或多个导电通道或一个或多个金属导体。在另一实施例中，第一电极和第二电极形成约为25至500V/cm的电场。

在另一方面，本发明提供一种方法，该方法包括：向微流体微芯片提供组分，其中，微流体微芯片包括流体层、弹性体层和气动层；将组分输送到流体地连接到微流体微芯片的柔性连接器；提供电场将组分移动到毛细管内；以及在组分上实施毛细管电泳，根据大小或电荷来分离组分。在一个实施例中，电场约为25至500V/cm。在另一实施例中，所述管中的所述组分邻近于第一和第二气体团块，其中，所述第一气体团块在所述组分的上游，所述第二气体团块在所述管中的所述组分的下游。在另一实施例中，所述第一和第二气体团块将所述组分与其它组分隔绝。在另一实施例中，组分包括以下至少一个组分：核酸、蛋白质、脂肪酸或聚糖。在另一实施例中，核酸是微RNA、DNA、RNA，或siRNA。

在另一个方面，本发明提供一种装置，其包括：(a)流体地连接到加载通道的分离通道；(b)包括至少两个电极的叉形电极，两个电极电气地连接到加载通道和通过加载通道连接到分离通道，其中，分离通道和加载通道之间的流体连接位于通向加载通道的两个电极的电气连接之间；以及(c)流体地连接到加载通道的气动阀。在一个实施例中，该装置还包括与所述叉形电极电气接触的管状电极，其中，所述管状电极的内直径至少约为0.2mm。在另一实施例中，所述管状电极构造成减少注入到所述分离通道内的气体。在另一实施例中，分离通道是毛细管，以及其中，毛细管使用柔性连接流体地连接到气动阀。在另一实施例中，分离通道是微型通道。在另一实施例中，分离通道和气动阀一体地形成在微流体微芯片上。在另一实施例中，加载通道包括加载通道溶液，而分离通道包括分离通道溶液，以及其中，试样溶液的导电率低于分离通道溶液的导电率。在另一实施例中，至少两个电极包括至少两个微型通道，它们在一端上流体地连接到分离通道和加载通道之间的流体连接的任一侧上的加载通道，而在另一端上流体地连接到底部通道。在另一实施例中，至少两个电极中的每个电极是电气地连接到电压源和加载通道的金属导体。

在另一方面，本发明提供一种装置，其包括：第一、第二和第三微流体通道，它们连接在一起形成三通连接；其中，第一微流体通道电气地连接到叉形电极的第一电极，其中，第二微流体通道电气地连接到叉形电极的第二电极，以及其中，第一、第二和第三微流体通道各流体地连接到气动阀。

在另一方面，本发明提供一种实施毛细管电泳的方法，该方法包括：提供一种装置，该装置包括：(1)流体地连接到加载通道的分离通道；(2)包括至少两个电极的叉形电极，两个电极电气地连接到加载通道和通过加载通道连接到分离通道，其中，分离通道和加载通道之间的流体连接位于通向加载通道的两个电极的电气连接之间；以及(3)气动阀流体地连接到加载通道；对分离通道提供分离通道溶液；对加载通道输送组分，其中，气动阀用来控制对加载通道输送组分；以及使用叉形电极沿着分离通道施加电场；在组分上实施毛细管电泳，根据大小或电荷来分离组分。在另一实施例中，组分具有的导电率低于分离通道溶液的导电率。在另一实施例中，通过所述施加电场来集中组分。

在另一方面，本发明提供一种微流体装置，其包括：(a)微流体微芯片，其包括：(1)包括第一阀的第一通道；(2)在第一阀一侧上相交于第一通道的第二通道；(3)在第一阀另一侧上相交于第一通道的第三通道；其中，第二或第三通道中的至少一个在T型阀处相交于第一通道，或第二或第三通道中的至少一个包括第二阀，以及其中，第二和第三通道各连接到端口；以及(b)流体回路，该流体回路可移去地附连到端口，以使流体可从第一通道流到流体回路。

在另一方面，本发明提供一种微流体装置，其包括：(a)微芯片，其包括一个或多个气动阀；以及(b)试样回路，其中，试样回路通过微流体微芯片中的端口流体地连接到一个或多个气动阀，以及其中，试样回路具有固定的体积且试样回路是可移去的。在一个实施例中，所述气动阀由微流体的装置中的一个或多个气动通道致动。在另一实施例中，试样回路包括毛细管。在另一实施例中，试样回路在第一连接处和第二连接处流体地连接到穿透微流体通道，以及其中，穿透微流体气动阀定位在第一连接处和第二连接处之间的穿透微流体通道内。在另一实施例中，至少一个连接处包括T型阀，其中，T型阀的关闭不会阻止流体通过穿透微流体通道。在另一实施例中，试样回路通过第一通道和第二通道连接到穿透微流体通道，以及其中，第一通道和第二通道中的至少一个通道包括试样回路阀。

在另一方面，本发明提供一种将固定体积的流体输送到微流体装置的方法，该方法包括：构造带有试样回路的装置，所述试样回路包括要求的体积，其中，试样回路是可移去的；使用微流体的装置上的一个或多个气动阀来为试样回路填充具有固定体积的流体；以及将流体输送到微流体装置。在一个实施例中，试样回路和穿透微流体通道流体地连接在第一连接处和第二连接处，以及其中，至少一个连接处包括T型阀。在另一实施例中，穿透微流体通道包括定位在第一连接处和第二连接处之间的穿透微流体阀。

在一方面，本发明提供一种装置，其包括：(a)筒；(b)微流体微芯片，其具有一个或多个微流体的隔膜阀且与筒流体地接口；以及(c)在微流体微芯片表面上与微流体微芯片接口的气动集管，其中，气动集管覆盖微流体微芯片表面的全部或仅一部分。在一个实施例中，该装置还包括构造成在微流体微芯片的腔室内产生磁场的磁体。在一个实施例中，其中，气动集管具有用于磁性部件的管状空间。在另一实施例中，微流体微芯片包括：包括流体通道的流体层，包括气动通道的气动层，以及夹在两层之间的致动层，其中，筒包括带有开口的腔室，其中，该开口匹配于连接到流体通道的流体层内的开口，以及气动集管包括开口，该开口匹配于连接到气动通道的微流体微芯片的气动层内的开口。

在另一方面，本发明提供一种装置，其包括：(a)筒；(b)微流体微芯片，其具有一个或多个微流体的隔膜阀且与筒接口；(c)在微流体微芯片表面上与微流体微芯片接口的气动集管；以及(d)与筒热接触的温度控制块。在一个实施例中，微流体微芯片包括：包括流体通道的流体层，包括气动通道的气动层，以及夹在两层之间的致动层，其中，筒包括带有开口的腔室，其中，该开口匹配于连接到流体通道的流体层内的开口，以及气动集管包括开口，该开口匹配于连接到气动通道的微流体微芯片的气动层内的开口。

在另一方面，本发明提供一种装置，该装置包括微流体微芯片，芯片具有一个或多个微流体的隔膜阀且与筒接口；其中，微流体微芯片具有珠粒轨道和试剂轨道。

在另一方面，本发明提供一种扩增mRNA和纯化已扩增的RNA的方法，该方法包括：(a)提供装置，该装置包括：(i)筒；(ii)微流体微芯片，其具有一个或多个微流体的隔膜阀且与筒流体地接口；(iii)在微流体微芯片表面上与微流体微芯片接口的气动集管；其中，气动集管覆盖微流体微芯片表面的全部或仅一部分，以及(iv)构造成在微流体微芯片的腔室内产生磁场的磁体，其中，气动集管具有用于磁性部件的管状空间；(b)将含有mRNA的试样和试剂提供到筒内；(c)在微流体微芯片的井内混合试样和试剂；(d)扩增mRNA而形成已扩增的RNA；(e)使用磁性珠粒捕捉已扩增的RNA；以及(f)将磁体定位在环状空间内以捕捉微流体微芯片的容器内的磁性珠粒。

在另一方面，本发明提供一种扩增mRNA的方法，该方法包括：(a)提供装置，该装置包括：(i)筒；(ii)微流体微芯片，其具有一个或多个微流体的隔膜阀且与筒接口；(iii)在微流体微芯片表面上与微流体微芯片接口的气动集管；以及(iv)与筒热接触的温度控制块；(b)将含有mRNA的试样和试剂提供到筒内；(c)在微流体微芯片的井内混合试样和试剂以形成混合物；(d)使用温度控制块加热该混合物；以及(e)扩增mRNA。

在另一方面，本发明提供一种扩增mRNA和纯化已扩增的RNA的方法，该方法包括：(a)提供装置，该装置包括微流体微芯片，其具有一个或多个微流体的隔膜阀且与筒接口；其中，微流体微芯片具有珠粒轨道和试剂轨道；(b)将试剂提供到一个或多个试剂轨道井；(c)将磁性珠粒浆提供到珠粒轨道井；(d)将含有mRNA的试样提供到试样井；(e)将试样和试剂泵送到微流体微芯片的输出井内以形成混合物；(f)扩增mRNA而形成已扩增的RNA；(g)将磁性珠粒浆泵送到纯化井；(h)通过将已扩增的RNA泵送到纯化井，用已扩增的RNA接触磁性珠粒浆；以及(i)纯化已扩增的RNA。

在另一方面，本发明提供一种在微流体装置中泵送流体的方法，该方法包括：(a)提供微流体装置，该装置包括泵送阀、源头井以及混合井，其中，泵送阀、源头井和混合井通过通道流体地连接；(b)沿第一方向泵送流体通过通道，从源头井泵送到泵送阀；以及(c)沿第二方向泵送流体通过通道，从泵送阀泵送到混合井，其中，第二方向与第一方向相反。

试样准备是生物分析过程的具有挑战性的领域。在一个方面，公开了一种从许多不同试样类型中准备试样的方法。在另一个方面，公开了一种从许多不同试样类型中准备试样的装置。在一个实施例中，该装置操作带有微尺度阀的筒，所述阀引导微芯片部件内的流体流动，所述部件可以单独地制造或制成筒的一体部分。在另一实施例中，使用压力驱动的流动或由筒上微型阀调制的真空，该装置可将试样移动到筒内。在另一实施例中，该装置可操纵顺磁性珠粒来磁性地分离试样的组分，以用微型阀引导的流体流动来纯化所要求的被分析物。

在一个实施例中，该装置是万用试样准备系统，该系统可处理生物或化学的试样。试样可以是加载到筒内的液体、拭子、刮取物、固体、气体或其它材料。该装置由电子器件加以控制，电子器件可包括计算机来选择合适的试剂，并使用微尺度的阀来打开和关闭由筒和微芯片部件形成的回路，从而引导流体的流动。试样可被处理而萃取出核酸，包括DNA、RNA、微RNA、蛋白质、脂质、聚糖、细胞壁、小分子，以及试样的所有其它生物组分。同样地，试样还可被处理而萃取或纯化化学组分。例如，DNA可被处理到微型珠粒上。

在一个实施例中，试样可移至筒内的反应室内，筒包括一个或多个腔室、通道、管子或毛细管，它们可永久地附连在筒上，或可反过来连接到筒上。使用由微型泵调制或形成的真空或压力，试样可再生地定位在通道、管子或毛细管内，所述微型泵可位于筒上、装置上、外部装置上，或其它结构上。

在一个实施例中，对于DNA来说，处理的试样可通过PCR、滚动循环、分支的DNA、EXPAR、LAMP，而其它DNA扩增方法为本技术领域内技术人员所众所周知，或处理的试样通过质量分光镜或单一分子探测技术进行分析。RNA可通过逆转录实时PCR，或对DNA微型阵列准备试样、或其它分析方法处理。实时分析或终时分析可用装置实施。对于蛋白质，可在筒内进行化验，包括酶的化验、夹在中间的免疫化验、抗体沉积、蛋白质消化、蛋白质和缩氨酸加标签，以及其它通用的蛋白质分析方法。同样地，使用装置中的标准方法可萃取或纯化其它细胞组分或化学品。分子生物学方法可容易地适用于该装置。试样可以在单一筒内的装置上完全地进行分析，或移至分离的筒，或在分离仪器内分析或进一步处理，包括有毛细管电泳系统或微芯片毛细管电泳；多维凝胶和毛细管电泳；质量分光镜、带有HPLC、ICP的多维质量分光镜、Raman分光镜、颗粒、毫微颗粒、以及珠粒基的探测、成像，包括有荧光、IR、光学的，或本技术领域内技术人员公知的任何其它分析系统。

在一个实施例中，用于分析的有：包括筒的完全试样-结果的仪器的集成，用来从许多输入和试样类型和微芯片基的毛细管电泳装置来准备DNA，以分离DNA碎片，诸如DNA测序、碎片定尺寸以及法医。

本说明书中提及的所有出版物和专利申请以参见方式被本文引入，好像每个个别的出版物或专利申请被具体地和个别地指明以备纳入供参考。

附图说明

本发明新颖特征特别地在附后权利要求书中进行阐述。通过参照阐述说明性实施例的以下详细描述，将会获得对本发明特征和优点的更好理解，在说明性实施例和附图中使用了本发明的原理，附图中：

图1示出微尺度芯片上的阀(MOVe)的实例。

图2示出MOVe微型阀、微型路由器、MOVe混合器，以及微芯片上的捕获珠粒。

图3示出带有MOVe微型阀的流体的筒。

图4示出带有端口的流体的筒，该端口通向带有微型阀的微流体微芯片。

图5示出带有MOVe微型阀的微流体微芯片，该MOVe微型阀控制筒内的流动。

图6示出连接到反应腔室的筒和带有下游MOVe泵和试剂的探测器。

图7示出一温度控制装置，该装置可热循环并包括磁性捕获、收紧夹具和同时七个循环反应的能力。

图8示出一温度控制装置，该装置可热循环并包括磁性捕获、收紧夹具和同时七个循环反应的能力。

图9示出在被动的特氟隆(PTFE)基的管子反应腔室内进行的PowerPlex16STR(单串联重复)扩增反应。

图10示出取自69’、23.5’、10.5’和4.5’处血液的25uL的DNA的纯化；产出(ng)显示在条码上。

图11示出使用微型阀来捕获微芯片上的珠粒的示意图。

图12示出使用MOVe微型阀从微芯片上的筒中捕获珠粒。

图13示出使用MOVe微型阀从微芯片上的筒中捕获珠粒。

图14示出使用MOVe微型阀捕获和反应微芯片。

图15示出使用MOVe微型阀捕获和反应微芯片。

图16示出四个筒组件。

图17示出微芯片上STR反应的实例。

图18示出准备核酸和毒素的通用试样准备工作流程。

图19示出使用顺磁性珠粒纯化筒中的试样。

图20示出一体的气动集管用来操作筒中的MOVe微型阀。

图21示出安装在计算机控制的装置上的筒。

图22示出安装在计算机控制的装置上的筒。

图23示出基于MOVe技术的试剂分配集管，其可将五种试剂分配到五种萃取/隔离装置或其它装置。

图24示出基于MOVe技术的试剂分配集管，其可将五种试剂分配到五种萃取/隔离装置或其它装置。

图25示出带有试样回路和MOVe微型阀的分配集管。

图26示出气动集管，而顶板示出顶侧，下板示出底侧。

图27示出E.coli的探测，该探测通过免疫磁性分离，其后是碱性溶解和在磁性珠粒上的促进PEG的捕捉，以及通过实时PCR的分析。

图28示出带有三个腔室的筒的应用，这些腔室可用于构造基因库和其它应用。

图29示出使用筒来准备基因库的工作流程。

图30示出用于微芯片基的电泳的叉形注射器。

图31示出用叉形注射器的试样堆叠。

图32示出连接到MOVe微型阀的叉形注射器。

图33示出连接到MOVe微型阀的叉形阴极注射器。

图34示出带有叉形注射器的微芯片的照片。

图35示出带有叉形注射器的微芯片的照片。

图36示出来自于从叉形阴极注射器得出的DNA顺序轨迹的单一颜色的电泳图。

图37示出叉形阴极注射器系统上的STR分离。

图38示出用于梭型加载的带有MOVe微流体的叉形阴极。

图39示出用于核酸隔绝、扩增、分离和探测的一体系统。

图40示出带有筒、微流体微芯片和磁体的装置。

图41示出带有流体层、弹性体层和气动层的微流体微芯片。

图42示出由两层材料组成的流体层。

图43示出由单一层材料组成的流体层。

图44示出扩增mRNA的反应方案。

图45示出热块509、筒50、微流体微芯片519和气动集管507的放大图。

图46示出呈组装形式的热块、筒、微流体微芯片和气动集管。

图47示出具有四组泵的微流体微芯片的流体层和气动层。

图48示出与微流体微芯片的流体层接口的筒。

图49示出固定与筒接口的末端的块体。

图50示出mRNA扩增方案的逆转录反应的结果。

图51示出带有热分配元件、筒、微流体微芯片和气动集管的热块的放大图。

图52示出带有呈组装形式的热分配元件、筒、微流体微芯片和气动集管的热块。

图53示出气动集管。

图54示出气动集管。

图55示出气动集管。

图56示出气动集管。

图57示出带有试剂的微流体微芯片的流体层和气动层，以及带有用实线显示的流体层和用虚线显示的气动层的珠粒轨道。

图58示出带有试剂和珠粒轨道的微流体微芯片的流体层。

图59示出带有MOVe阀的微流体微芯片，该阀控制筒中流体的流动。

图60示出叉形电极。

图61示出叉形电极、带有电线延伸电极的叉形电极，以及带有管形电极的叉形电极。

图62示出注入道分离通道内的试样注射。

图63示出使分离毛细管与一个注射管匹配的装置。

图64示出使分离毛细管与四个注射管匹配的装置。

图65示出带有Ultem的捏夹的热循环器。

图66示出指示试剂在四个通道平行处理装置的诸部件之间运动的图形。

图67示出四通道平行的试剂输送装置：Chip C微芯片设计显示在左上角，流体集管显示在左下角，以及制造和组装的装置显示在右边。

图68在左边示出四通道试样准备装置，在右边示出安装在单块气动集管上的四通道试样准备装置。

图69示出四通道试样准备装置的MOVe微芯片设计：Chip D微芯片设计显示在左边，使流动通过形成顶板处说显示的两个对分通道之间的T连接的阀；该Chip D微芯片设计使流动通过右上角显示的阀；Chip F微芯片设计显示在右下角，其带有仅具有一个通过阀中间的通道的共线的阀。

图70示出在四通道试样准备装置上准备的DNA试样的IdentiFiler STR外形，其中使用在STR反应子系统热循环器上的快速方案(1.5hr)实施STR扩增。

图71示出与带有流体集管的Chip A微芯片组合的四通道后扩增装置：Chip A微芯片设计显示在左边，制造好的微芯片显示在中央，以及组装好的流体集管和微芯片显示在右边。

图72示出带有后扩增装置的后扩增STR清洗子系统。

图73示出Chip E微芯片设计，其可用作后扩增装置。

图74示出混合器的示意图。

图75示出混合器的示意图。

图76示出对裂解细胞使用混合器的结果。

具体实施方式

本发明包括将诸如微型阀(包括但不限于气致动阀和微尺度的芯片内阀)那样的阀纳入到其设计中以便控制流体运动的各种装置。这些装置可用于富集组分、试样准备和/或在试样中或从试样中分析一个或多个组分。

本发明还提供用于流体和被分析物处理的装置和使用它们的方法。本发明的装置可用来在流体和被分析物上进行各种操作。这些操作可包括移动、混合、分离、加热、冷却和分析。装置可包括多个部件，诸如筒、微流体微芯片以及气动集管。图40示出一个具有筒101、微流体微芯片103以及气动集管113的示范装置。

I.试样准备装置

在一个方面，如图16中的装置800、图21和图22中的装置1000和图68中的装置1000所示的试样准备装置，包括与微流体微芯片形成一体的筒，该微流体微芯片控制筒中流体通过微型阀的运动以及组分以便操作该筒。筒和/或其中的隔间可以有足够大的尺寸，以在自动化装置中处理一毫升或几毫升的输入试样。筒可处理试样而输出一组分，使用压力驱动的流动或由微型阀调制的真空可移动该组分。筒可提供与输送装置的接口，输送装置包括宏观的试样，诸如血液、浮质液体、拭子化验物、体液、残液和其它液体、固体以及气体试样。筒可使用微尺度试样准备和分析来处理宏观试样体积。筒可允许使用微流体装置来处理宏观或大量的试样，而各种组分减少了空隙体积，这可使材料损失减少。

A.筒

这里也将筒称之为流体集管，筒可用于多种用途。一般来说，筒可具有多个端口，它们的尺寸可与大规格装置以及微流体装置接口。美国专利申请61/022,722中描述了筒或流体集管，本文以参见方式引入其全部内容。筒可用来从源头接收各种材料，诸如试样、试剂或固体颗粒，并将它们输送到微流体微芯片。该材料可通过筒和微流体微芯片的配对的开口在筒和微流体微芯片之间传送。例如，可使用移液管将材料传送到筒，筒然后又可将材料输送到微流体装置。在另一实施例中，管道可将材料传送到筒。在另一实施例中，注射器可将材料传送到筒。此外，筒可具有各种体积的容器，能够容纳毫微升、微升、毫升或升的流体。容器可用来固定腔室、反应腔(例如，它们包括用来实施反应的试剂)、用来提供加热或冷却的腔室(例如，它们包含热控制元件或它们热力上连接到热控制装置上)，或分离腔(例如，顺磁性的珠粒分离、亲合力捕捉基体和色谱法)。任何型式的腔室可用于这里所述的装置，例如，美国专利申请2007/0248958中描述的腔室，本文以参见方式引入该专利申请。通过具有使温度控制的流体流入和流出筒的运动的入口和出口，容器可用来提供加热或冷却，温度控制流体的运动然后对微流体微芯片提供温度控制。或者，容器可容纳珀耳帖元件或本技术领域内技术人员公知的任何其它加热或冷却元件，它们可提供散热器或热源。筒容器或腔室可具有至少约为0.1、0.5、1、5、10、50、100、150、200、250、300、400、500、750、1000、2000、3000、4000、5000或更多μL的容积。腔室或容器的相对体积可比微流体微芯片内的通道或阀约大1、2、5、10、20、50、100、200、500、1000、2000、5000、10000或以上。筒的腔室和容器的尺寸可配对于微流体微芯片，可如此地选择该尺寸，使得可处理大体积的试样，诸如约大于1、5、10、50、100、500、1000、5000、10000、50000或以上μL的试样，其中，处理试样的流体的流动受微流体微芯片内阀的控制。由于与诸如移液管和大规格阀之类的其它流动控制装置相比，减小了微流体微芯片内的空隙体积，所以，这可允许减少试样和试剂的损失量。微流体微芯片内的空隙体积可小于1000、500、100、50、10、5、1、0.5、0.1或0.05μL。在处理试样过程中，这可允许试样或试剂损失量小于20％、15％、10％、7％、5％、3％、2％、1％、0.5％、0.05％。

例如，图40示出带有容器的筒101，容器具有通向筒一侧的端口115，其可用来接纳来自移液管或任何其它大规格装置的材料。端口还可适于配装成接纳管子或毛细管，将筒连接到上游的流体。容器可向下呈锥形而形成筒容器的开口117，该开口与微流体微芯片的流体层内的开口105接口、对齐或配对。

筒可由本技术领域内技术人员公知的任何材料构造成。例如，筒可用塑料、玻璃或金属来构造。塑料材料可包括本技术领域内技术人员公知的任何塑料，诸如聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚酯、聚酰胺、聚氯乙烯、聚碳酸酯、聚亚安酯、聚氯二乙烯、环状烯烃共聚物，或它们的任何组合。可使用本技术领域内技术人员公知的任何技术来形成筒，诸如软平版印刷术、硬平版印刷术、研磨、压花、融化、钻削、蚀刻、注塑模制、或它们的任何组合。

如图3和图4中所示范的，筒1可包括带有平侧边的直线结构。在另一实施例中，筒包括弧形、倒圆、凹陷的表面，或包括突出。在一实施例中，筒具有至少一个邻近于微流体微芯片的基本上平的表面。筒适于流体地连接到微芯片内的端口。例如，筒表面中的开口可与微芯片内的端口对齐。当筒和微芯片彼此配对时，诸开口对齐而形成流体的连接，使液体可从筒通过进入微芯片的端口内，所述端口连接到通常具有形成流体回路的多个阀的通道。筒的另一实施例显示于图59。图59示出带有多个端口的筒，诸端口与微芯片和外部部件(诸如注射器)配对。筒内隔间的形状可允许注射器和其突出物插入。筒还可包括透气端口，以使筒腔室内或微芯片腔室内的气体通气。还有图59示出一个位置，其中，可使用一个被致动的磁体，将磁场施加到混合腔室。此外，图59示出可用来关闭混合腔室的帽盖。

在一个实施例中，筒包含一个或多个零件，包括但不限于腔室、端口、通道或磁体。在一个实施例中，诸如气动致动阀的微型阀与微流体的筒组合。在某些实施例中，微型阀是主动的机械微型阀(诸如磁性的、电气的、或压电晶体的热微型阀)、非机械的微型阀(诸如双稳态的机电相变或流变学的微型阀)、外部微型阀(诸如模块的或气动的)、被动的机械的(诸如止回微型阀)或被动的非机械的(诸如毛细现象的微型阀)(Oh等人所著的“A review ofmicrovalves(微型阀的回顾)”J.Micromech Microeng.16(2006)R13-R39，本文以参见方式引入其全部内容)。

在另一实施例中，气动致动的阀(诸如MOVe阀)调制一个微流体微芯片、两个或更多个微流体微芯片中的气压、真空或流体流动。MOVe阀可以是微尺度的芯片内阀、微流体的芯片内阀或微型机器人的芯片内阀。在一个实施例中，空气压力、真空或流体的流动受一个或多个可变压力泵的控制，诸如电磁阀或电磁泵。在一个实施例中，微流体微芯片是这样的结构，其包含微型通道和/或微型槽，其中，微型通道是闭合结构，而微型槽是敞开结构。在一个实施例中，微流体微芯片是平面结构。在一相关实施例中，微流体装置包括带有微型阀的微流体微芯片，微型阀在筒的一侧上成群。在一个实施例(图3和图4)中，筒1可包括一个或多个通向外部流体、空气或真空的端口4、5、6、7、8、9。这些端口的功能可用于废液口4、试剂入口5、通气口6、试样入口7、产物出口8。筒1可包含一个或多个试样入口或反应腔室7和3。

诸如反应腔室的筒内的一个单一腔室可具有一个或多个，或至少一个、两个或三个与微芯片的流体连接结构。例如，反应腔室3可具有通过位于腔室底部处的连接结构120与微芯片流体地连接的连接结构，以及具有通过端口9连接到微芯片的另一流体连接结构，所述端口9通过位于腔室顶部处的通道连接到腔室3。腔室3的顶部、端口9以及腔室3和端口9之间的通道可关闭而隔绝外部环境，这样，当腔室3要填充时，腔室3内的流体必须被泵送到端口9内，反之亦然。如此的腔室或腔室和端口的组合可被称之为关闭腔室。流体连接结构的定位不一定需要在腔室底部和顶部处，然而，位于腔室底部和顶部位置处的流体连接结构可减少气体在腔室内的驻留。或者，反应腔室3可被看作两个腔室的组合，这两个腔室在顶部位置处彼此流体地连接，它们可位于筒内，其中，每个腔室也可具有位于底部处的开口。位于底部处的开口也被称之为腔室孔，它们可流体地连接到微芯片上的端口孔。两个流体连接结构可使流体通过微流体微芯片被引导入和引导出腔室。

在另一实施例中，装置包括筒，该筒包括至少一个诸如MOVe阀那样的气动致动的阀，其以非线性方式位于一个或多个表面或结构上。筒可包括位于筒内的不是筒底部位置处的气动致动的阀。

筒的功能性元件可包括端口、通道、腔室、过滤器、磁体或通气孔，腔室可联合地被称之为功能性元件。在一个实施例中，在图4中，功能性元件连接到微流体微芯片，微芯片含有在连接处100、120、140、160和230处的微型阀。功能性元件可通过齐平的连接结构或通过配件连接到管子或插入到端口内的毛细管。在一个实施例中，齐平的连接结构可包括直接与微流体微芯片的孔对齐的筒的端口。在一个实施例中，筒和微流体微芯片形成一体的模块。在另一实施例中，筒和微流体微芯片是两个分离开的元件，它们在使用之前附连在一起。

筒可包括至少一个腔室、试样输入端口、试剂端口、出口端口、废液端口和磁体。磁体可位于腔室附近，于是，磁体产生的磁力可将所述腔室内顺磁性颗粒吸引到腔室壁上。在一个实施例中，顺磁性颗粒是呈磁性响应的珠粒或细胞(例如，包括血色素的细胞，它们用硝酸钠处理过)。磁体可以是电磁铁或永久磁铁，诸如稀土金属磁体。

在一个实施例中，在图4中，连接结构或端口4、5、6、7、8和9分别通向筒内的通道14、15、16、17、18和19。端口4、5、6、7和8显示有凹陷，以便可靠地将连接器或管子附连到凹陷，诸如显示用于连接结构7的凹陷(参见连接结构7和通道17直径的差异)。在一个实施例中，端口可与各种连接器或管子接口，诸如以下专利中所描述的毛细管：美国专利6,190,616、美国专利6,423,536、美国专利申请09/770,412，1-25-01、美国专利申请60/402,959，或诸如以下美国专利所述的带有模块微流体端口的一个或多个微芯片：美国专利6,870,185和美国专利申请11/229,065；本文以参见方式引入所有这些专利和专利申请的全部内容。在一个实施例中，模块化的微流体端口能使微芯片或毛细管反向连接而没有死体积或泄漏。

在另一实施例中，腔室3连接到通道9和通向连接120处的锥体13。腔室3可如许多其他腔室那样用于反应。在图4中，筒的通道直接通向微芯片2上的端口的孔。筒的通道可按照需要彼此互连。在某些实施例中，筒中至少一个通道物理上并不连接到微流体微芯片。在另一实施例中，筒中至少一个通道流体地连接到微流体微芯片中的至少一个微型通道。该连接可以利用或可不利用微流体微芯片上的孔。孔可以是开口，或是设计成匹配在微芯片和筒之间的配件。在本发明的某些实施例中，该配件包括诸如垫片或O形环那样的密封件。

B.微芯片

在一个实施例中，筒和微流体微芯片集成在一起而形成单个模块化装置。该筒和微流体微芯片可通过流体或固体粘结剂或机械方法附连在一起。在一个实施例中，该粘结剂是聚丙烯酸酯、粘结剂带、双面带，或本技术领域内技术人员公知在任何其它粘结剂。筒可包括零件12，其能够通过毛细作用将流体基的粘结剂传送到微流体微芯片和筒之间的连接处内。在另一实施例中，筒用非流体的粘结剂层附连到微流体微芯片。或者，筒和微芯片可通过夹子、夹具或其它固定装置保持在一起。筒和微芯片在集成之前可通过视觉线索(使用或不使用显微镜)或通过物理导向的装置进行对齐。视觉线索可包括所画出、蚀刻或以其它方式存在于筒、微芯片或两者之上的直线或特征。物理导向装置包括凹陷、突出以及可被“键入”而帮助或确保合适组装的边缘。

在某些情形中，微流体微芯片具有隔膜阀，其用来控制流体流动。控制流体流动的带有隔膜阀的微流体装置可见如下专利和专利申请中的描述：美国专利7,445,926、美国专利申请2006/0073484、2006/0073484、2007/0248958和2008/0014576，以及PCT出版物WO 2008/115626，本文以参见方式引入这些专利和专利申请的全部内容。通过气动集管对微芯片的气动层施加正压或负压，使这些阀受控。

在一个实施例中，微芯片是“MOVe”微芯片。如此的微芯片包括三个功能层-包括微流体通道的流体层；包括气动通道的气动层；以及夹在两个其它层之间的致动层。在某些实施例中，流体层包括两层。一层可包括多个槽，它们提供微流体通道和通路，或从外表面通向流体通道的孔。第二层可包括通路，它们从与致动层接触的表面通到与另一层上的气动通道接触的表面。当这两层接触在一起时，它们形成单个流体层，该层包括内部通道和向外敞开而连接通道与流体集管或连接通道与致动层的通路，从而形成阀、腔室或其它功能性物项。致动层通常由可变形的物质形成，例如，弹性体物质，当真空或压力施加到该物质上时，该物质可变形。在流体通道或气动通道打开到致动层或以其它方式与致动层接触的诸点处，可形成诸如阀那样的功能性装置。如此的阀显示在图1的剖视图中。流体层和气动层可包括将通道连接到如端口那样的外表面的端口。如此的端口可适于接合流体集管，例如，筒或气动集管。

如图40所示，微流体微芯片103可与筒101接口。微流体微芯片可具有带一开口的腔室105，该开口匹配于筒101的开口117。腔室可用于各种用途。例如，腔室可用作反应室、混合室或捕捉室。腔室可用来捕捉磁性颗粒，诸如磁性珠粒、顺磁性珠粒、固态萃取材料、单体，或色谱法基体。

磁性部件109可定位成使筒容器107和/或微流体的腔室105内的磁性颗粒可被捕捉而抵靠在微流体的腔室105的表面上。使用永久磁铁和/或电磁铁，磁性部件可产生磁场和/或电磁场。如果采用永久磁铁，则可沿一个或多个方向致动磁铁，使磁铁靠近微流体微芯片，以对微流体的腔室施加磁场。在本发明的某些实施例中，沿图40所示方向111来致动磁铁。

或者，各种装置中的任何装置可与微流体微芯片接口。例如，探测器、分离装置(例如，气体色谱仪、液体色谱仪、毛细管电泳、质量分光计等)、光源、或温度控制装置可靠近微流体微芯片定位，或结合微流体微芯片一起使用。这些装置可允许通过探测电阻、电容、光吸收或辐射、荧光性或温度或其它化学的或物理的测量值来检测被分析物。或者，这些装置可允许将光线引入到微流体微芯片的区域或面积上。

微流体的装置可设计有多个腔室，它们构造成用来捕捉磁性颗粒。多个腔室和磁性部件可布置成让磁场可同时施加到所有腔室，或可施加到各个或某些腔室而独立于其它腔室。腔室和磁性部件的这种布置可便于更快或更有效地回收磁性颗粒。尤其是，该种布置可便于回收多个腔室内的磁性颗粒。

如图41所示，微流体微芯片103可由流体层203、弹性体层205和气动层207形成。流体层可包含诸如腔室105以及通道、阀门和端口之类的零件。通道可以是微流体通道，用来在腔室和/或端口之间传送流体。阀可以是用于微流体的装置中的任何类型的阀。在本发明的优选实施例中，阀包括微尺度的芯片内阀(MOVe)，这里其也被称之为微流体的隔膜阀。一系列的三个MOVe可形成MOVe泵。MOVe和MOVe泵可使用气动学原理致动。气动源可以在微流体微芯片的内部或外部。

一个MOVe阀的实例显示在图1中。闭合的MOVe阀的横截面显示在图1A中。打开的MOVe阀的横截面显示在图1B中。图1C示出MOVe阀的俯视图。从流体层起源的通道251可通过一个或多个通路257与弹性体层259接口。该通道可具有一个或多个座子255，当弹性体层259与座子255接触时，座子可阻止流动通过通道。弹性体层既可以与座子常接触，也可与座子常不接触。通过气动管路261施加正压或负压来增大或降低气动腔室253内相对于流体通道251的压力，这可使弹性体层变形，使得弹性体层被推压抵靠在座子上或被拉离座子。在本发明的某些实施例中，MOVe没有座子，在施加正压或负压的情况下，流过流体通道的流体不完全被阻止。可被施加的真空包括极高真空、中真空、低真空、壳内真空，以及诸如5psi、10psi、15psi、25psi、30psi、40psi、45psi和50psi的压力。

串联的三个MOVe阀可形成泵，利用第一MOVe作为入口阀，利用第二MOVe作为泵送阀，以及利用第三MOVe作为出口阀。通过顺序地打开和关闭MOVe，流体可移动通过一系列MOVe。对于供应到入口阀的流体，一示范的顺序可从所有三个MOVe都被关闭的状态开始包括：(a)打开入口阀，(b)打开泵送阀，(c)关闭入口阀并打开出口阀，(d)关闭泵送阀，以及(e)关闭出口阀。由于入口阀和出口阀可具有相同的结构，所以MOVe泵可通过重编程打开入口阀或出口阀的顺序来沿任一方向移动流体。

流体层203可由一层或多层材料构成。通道301、303、305可形成在两层材料之间的接口处，而腔室105可通过完全地除去一层材料的一部分而形成。通道可具有任何形状，例如，在一侧301上倒圆、矩形303或圆形305。通道可通过单层310、303内的凹陷或两层305内的凹陷来形成。通道和腔室可通过横向于通道和所示腔室的流体通道进行连接。多维的微芯片也可纳入在本发明的范围之内，其中流体通道和连接形成在多个流体层之间。

材料第二层的厚度307可以是任何厚度。在本发明的某些实施例中，第二层具有这样的厚度，其使从外部磁性部件横贯第二层施加的腔室105内的磁场减到最小，或使热传递减到最小。

如图43中所示，流体层203可由单层材料构成。然后，该单层与弹性体层接口，使得通道305、303和腔室305形成在流体层和弹性体层205之间。

微流体微芯片可用本技术领域内技术人员公知的任何材料构成。在本发明的某些实施例中，流体层和气动层由玻璃构造成，而弹性体层由PDMS形成。在替代的实施例中，弹性体可用诸如特氟龙(PTFE)、硅或其它薄膜之类的可变形材料的薄膜代替。使用本技术领域内技术人员公知的任何微型加工技术，诸如形成图案、蚀刻、研磨、模制、压花、丝网印刷、激光切除、基底沉积、化学气相沉积或它们的任何组合，可形成流体层和气动层的各种特征。

在一个实施例中，如图5所示，微型通道回路形成在微流体微芯片2上，用微型通道连接多组的微型阀。在一个实施例中，微型阀是气动阀。在一个实施例中，该气动阀是MOVe微型阀。在一个实施例中，通过打开或关闭至少一个微型阀，可控制筒和微流体微芯片之间的流体路径，诸如腔室、端口、通道、微型通道和其它功能性元件之间的流体路径。在一个实施例中，微型阀由诸如计算机的微处理器控制器进行控制。计算机可包括输入/输出控制器，或诸如存储器和处理器那样的本技术领域内技术人员公知的任何其它部件。在一个实施例中，微型阀是由气动源致动的阀，例如通过气动端口10、20、30、40、50、60或70。在一个实施例中，气动源由至少一个螺线管控制。在一个实施例中，螺线管是微型化的，并可连接到真空或压力源上。在一个实施例中，气动源使用一力来连接到气动端口，所述力诸如夹紧力、弹簧力、气动力或螺钉力，选项地可由O形环提供密封。

在一个实施例中，图5示出微流体微芯片2的顶部的视图，该侧面与筒1底部接触。微型阀110控制微型通道101和121之间的流体路径。微型阀130控制微型通道131和141之间的流体路径。微型阀150控制微型通道151和152之间的流体路径。微型阀180控制微型通道181和191之间的流体路径。微型阀200控制微型通道201和212之间的流体路径。微型阀220控制微型通道221和231之间的流体路径。

在一个实施例中，连接部分可连接一个或多个微型通道。图5示出与图4所示筒匹配的微芯片的示意图。在图5中，连接部分100连接到单个微型通道101，连接部分140连接到单个微型通道141，连接部分160连接到单个微型通道161，连接部分230连接到单个微型通道231。连接部分190连接到两个微型通道191和201。连接部分120连接到三个微型通道121、131和151。在一个实施例中，三个以上的微型通道可连接到单个连接部分。

微型通道可用诸如平版印刷、模制、压花、浇铸或打磨等一个或多个技术进行制造。微型通道可用诸如玻璃、塑料、聚合物、陶瓷、凝胶、金属或其它合适固体进行制造。

在另一实施例中，装置包括筒，该筒包括至少三个腔室，一个以上的输入端口和一个以上的输出端口(图28)。该筒可适于处理核酸试样以备分析。该筒可适于从外部试剂源接受一个或多个试剂。试剂可以是顺磁性珠粒、非顺磁性珠粒、酶、dNTP、缓冲剂溶液、盐溶液、乙醇溶液、包括EDTA或寡核苷酸的溶液或其它试剂。酶可以是连接酶、限制酶、聚合酶，或激酶或任何其它酶，或包括RNA的催化生物材料。该装置可包括磁体，其可将顺磁性珠粒吸引到一个或多个腔室的壁上。在另一实施例中，至少一个腔室包括捕捉珠粒的过滤器，诸如非顺磁性的珠粒。

在一个实施例中，筒用于富集试样的方法中，该方法包括：通过试样端口将试样输送到腔室，以及通过试剂端口将顺磁性颗粒输送到腔室。顺磁性颗粒(例如，顺磁性珠粒)粘结到试样中的至少一个组分(诸如DNA、RNA、微RNA、蛋白质、脂质、聚糖或其它配合基)。顺磁性颗粒借助于腔室外的磁体施加的磁性力被吸引到腔室的壁上。顺磁性颗粒通过试剂端口用输送到包括顺磁性颗粒的腔室的清洗溶液进行清洗，并通过废液端口除去清洗溶液。可添加试剂来从顺磁性颗粒中洗脱出试样中的组分，并将试样组分输出到其它装置以作进一步处理或分析。一优选实施例用来输出顺磁性颗粒上的试样组分。

在一个实施例中，包括微流体微芯片的装置用于诊断方法中。在一个实施例中，该诊断包括探测试样中的传染性试剂。在一个实施例中，该传染性试剂是细菌、病毒、真菌、菌质或朊病毒。在另一实施例中，包括微流体微芯片的装置被用于诊断遗传疾病的方法中。在一个实施例中，遗传疾病由一个或多个DNA突变造成，这样的突变包括但不限于：三联基线扩大、碱基替换突变、缺失突变、无义突变、早熟终止密码子、染色体缺失、染色体复制、异倍性、部分异倍性或单体性染色体。在另一实施例中，包括微流体微芯片的装置用于诊断癌症或易患癌症体质的方法中。在另一实施例中，包括微流体微芯片的装置用于诊断遗传疾病的方法中，遗传疾病诸如孤独症、唐氏综合征、三(染色)体细胞、泰-萨二氏病(Tay-sachs)，或其它遗传疾病。在某些实施例中，在包括微流体微芯片的装置中，用于诊断的试样是血液试样、粘液试样、肺灌洗试样、尿试样、粪便试样、皮肤试样、头发试样、精液试样、阴道试样，或羊膜试样。

在另一实施例中，包括微流体微芯片的装置用来识别试剂的环境污染的存在性。在一个实施例中，试剂是环境试样中的诸如细菌、病毒、真菌或菌质的生物试剂。在另一实施例中，试剂是诸如杀虫剂、除草剂或肥料之类的污染试剂。在一个实施例中，环境试样是泥土试样、水试样、空气试样、肉类试样、蔬菜试样或水果试样。在另一实施例中，试剂是变基因生物体。

在另一实施例中，包括微流体微芯片的装置用于基因型测定、个别哺乳类动物的识别(诸如人类)、法医、基因表达、基因修改、微RNA分析或核糖型测定。

在另一实施例中，微流体微芯片用于包括分子生物分析的方法之中，其包括但不限于：试样中核酸的聚合酶链式反应(PCR)扩增(诸如等位基因专用PCR、组合PCR、非对称PCR、群体PCR、依赖于解螺旋酶的扩增、热起动PCR、序列专用(ISSR)PCR、逆PCR、绑扎中介PCR、甲基化专用PCR多元绑扎依赖的探针扩增、多元PCR、嵌套PCR、重叠延伸PCR、量化PCR逆转录PCR-PCR、热非对称性交织-PCR、降落PCR，或PAN-AC PCR)，等温核酸扩增(诸如环中介的等温扩增(LAMP)；切口位移扩增；解螺旋酶依赖扩增平台(HDA)；以及引发酶基的全基因组扩增平台(pWGA)；单引物等温扩增(SPLA)和对于RNA的Ribo-SPLA；串位移扩增(SDA)；EXPAR[VanNess J，Van Ness LK，Galas DJ.(2003)Isothermal reaction for the amplification ofoligonucleotides.Proc Natl Acad Sci USA.100：4504-9.]；滚动圆扩增(RCA)；基于转录的扩增系统(TAS)以及其衍生物包括自持序列复制(3SR)、等温核酸序列基的扩增(NASBA)，以及转录中介的扩增(TMA)；连接酶链式反应(LCR))，DNA或RNA的测序反应(诸如Maxam-Gilbert测序、Sanger链终止方法、Dye终止测序、Emulsion PCR测序、大量平行的测序、波洛尼亚测序、绑扎测序、合成法测序，或杂交法测序)，限制片段长度的的多形性(RFLP)分析，单核苷酸多形性(SNP)分析，短前后重复(STR)分析，微型卫星分析，DNA指印分析，DNA脚趾印分析，或DNA甲基化分析。

在一实施例中，筒使用连接到粘结半部的珠粒，其包括但不限于：粘结接受体、铁传递蛋白、抗体或其碎片(诸如Fc碎片或Fab碎片)、血凝素，或DNA或RNA序列。在另一实施例中，筒包括诸如抗凝剂、定色剂、稳定试剂、防腐剂或析出剂的试剂。

C.气动集管

气动集管可与任何的微芯片和/或这里所述的筒集成在一起以便于分配气压或真空。气压或真空可用来致动微芯片上的阀。或者，气压或真空可供应到筒内，使气压或真空提供给微芯片的流体层内的微型通道，其可用来移动流体层内的流体或气体。气动集管提供气压或真空来操作图3的筒1上的微芯片2上的微型阀，或操作其它装置内的微型阀。

气动集管可用来匹配于通向外部压力源的微流体微芯片的气动管路。气动集管可具有与微流体微芯片的气动层上的端口对齐的端口，以及可连接到与外部压力源连接的管子上的端口。这些端口可通过一个或多个通道连接起来，通道允许液体或气体的流体连通，或端口之间的其它材料的连通。

气动集管可与微芯片任何表面上的微流体微芯片接口。气动集管可以位于微流体微芯片的与筒相同或不同的侧上。如图40所示，气动集管113可放置在微流体微芯片与筒相对的表面上。同样，气动集管可设计成其仅占据微流体微芯片表面的一部分。气动集管的定位、设计，和/或形状可允许其它部件进入微流体微芯片。气动集管可具有切口或环形空间，其允许其它部件定位邻近或靠近于微流体微芯片。例如，这可使磁性部件109放置在微流体微芯片内的腔室附近。

气动集管可用本技术领域内的技术人员公知的任何材料构造。例如，筒可用塑料、玻璃或金属构造。塑料材料包括本技术领域内的技术人员公知的任何塑料，诸如聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚酯、聚酰胺、聚氯乙烯、聚碳酸酯、聚亚安酯、聚氯偏二乙烯、环状烯烃共聚物，或它们的任何组合。气动集管可采用本技术领域内的技术人员公知的任何技术制造，诸如软平版印刷术、传统平版印刷术、研磨、模制、压花、钻孔、蚀刻或它们的任何组合。

气动集管370设计成(图20)消除二十多个管子的端口，并在控制系统、气动螺线管和MOVe输入端口之间提供结实的可复制的接口。集管370具有紧固在一起的垫片380和底板390。筒1通过支架固定在板370上，以将图5中所示的微流体微芯片2上的气动端口10、20、30、40、50、60和70对齐于图20中的插入件370的反面侧所示的气动管路。外部的气动管路受螺线管阀组控制，螺线管阀组可以小型化并可连接到真空或压力源。

图21和图22中所示装置可包括图20所示的气动集管。该装置可用于试样准备，如上所述地可包括筒。筒1标示为“立方体”，其用螺线管1819附连到集管370。筒和集管的组件安装在装置底板上。气动集管可被IO控制器1803控制。

诸如可维持在理想压力或真空下的容器之类的气体源可向集管供应气体。气体源可连接到外部的压力或真空源。馈送气体源的气体源集管可具有压力表以监视入口压力。气体源可通过气体源集管1821将气体供应到系统的多个部件中。气体源集管可将气体供应到气动集管370和个别的试剂容器1809和1807。调节器1815可用来调节供应到分配阀390的管路气体。

试剂和/或试样也可通过试剂分配阀390和珠粒溶液容器1807供应到筒内，所述阀390连接到试剂储存区域380内的容器1809，而珠粒溶液容器1807安装在珠粒混合器1805上。适配器1817可安装在和/或对齐于筒，以使诸如注射器之类的输送装置可将材料输送到筒内。适配器1817可通过加热器控制器1801进行热调节。适配器可具有诸如铜那样的热导体，用来分配加热器盘管或珀耳帖装置产生的热量。适配器可将温度保持在约20至100、20至75，或50至60摄氏度之间。

磁体组件1811可邻近于筒定位。磁体组件的磁体300可定位在筒1附近，并通过致动器移动，使得磁体可将磁场作用在筒内，或与筒集成、匹配或接口的微芯片上。磁场可用来捕捉筒或微芯片内的诸如珠粒那样的顺磁性颗粒或磁性颗粒，并使粘结到颗粒上的材料与废料分离。从筒和/或微芯片中取出的废料可输送到废料容器1813内。

图21和图22中所示装置可使用7个螺线管阀来操作筒1。使用MOVe微型阀可进一步减小装置的尺寸和复杂程度。图23和图24示出一试剂分配装置，其包含微流体微芯片600，芯片的近似宽度为2英寸。螺线管组680和684通过连接器681、682、685和686连接到全尺寸的外部真空和压力上。螺线管通过电气连接689和687受控。具有MOVe阀的微流体微芯片600使用夹具710通过附连件711保持与集管700接触。也可使用本技术领域内的技术人员公知的其它方法将微芯片连接到气动集管700。

如图25所示，微芯片600连接5个试剂源621、622、623、624和625与2个试样回路630和631以及5个装置634、635、636、637和638，它们可以是诸如筒1那样的微流体的装置。试样回路630和631可构造成具有预定的体积。试样回路可具有可移去的一部分。因此，它们可移去地连接到流体操纵模块中的端口。试样回路可被移去而允许调整试样回路的体积。试样回路的一部分可以是毛细管、任何其它类型的管子，或微流体通道。试样回路可使用这里所述的任何类型的连接件而连接到微芯片上。例如连接件可连接到套管、配装管、微型管配件、阿普彻奇管子适配器，或FROLC连接器[Jovanovich，S.B.，G.Ronan，D.Roach和R.Johnston.Capillary valve，connector，and router(毛细管阀、连接器和路由器)。2001年2月20日，美国专利6,190,616]。显然，试剂源、微流体的装置和试样环路的数目可以增加或减少。每个微流体的装置可执行相同的功能，不同的功能或互补的功能。诸装置可通过模块微流体端口连接起来。

在图25所示的本发明的一个方面，微芯片600包括与两个其它第二微流体通道相交的主微流体通道。该主微流体通道可以是如图25所示的连接试剂源625与装置634的通道。第二通道可以是将阀606连接到试样回路630的通道和将阀608连接到试样回路630的通道。这些第二通道中的至少一个第二通道且可供选择地两个第二通道通过流通阀606和608与主通道连接，流通阀606和608允许流体流过主通道，但仅是流入或流出第二通道，使流通阀为打开的。流通阀可重设计为轴向阀。主通道还包括介于两个第二通道的相交点之间的中间阀674。每个第二通道在入口端口处离微芯片打开。具有规定体积的通道的试样回路630可拆卸地附连到各个入口端口。因此，通过关闭中间阀674，打开流通阀606和608并对主通道施加压力，则试样回路内特定体积的流体可被注入到主通道内。试样回路也可被称之为流体回路或试剂回路。

分配集管的微芯片600使用18个微型阀601至618来引导流动通过集管。微型阀通过带有O形环或其它连接器的气动端口进行操作，连接器包括通向气动集管700的模块微流体的端口。例如，连接结构671对微型阀641提供压力或真空，连接结构673对微型阀642提供压力或真空。可引导从试剂源621、622、623、624和625流出的试剂流来个别地填充试样回路，或将试样移动到装置634、635、636、637和638。

如图26所示的气动集管700通过螺线管组680和681将压力源685和真空源686连接到通向包括端口671和673的端口阵列684的气动通道683。图26的顶部示出气动集管的气动管路，它们从螺线管通向微芯片的气动层。图26的底部示出螺线管以及真空源685和压力源686，它们连接到各个螺线管。螺线管组由电子器件控制而打开和关闭通向公共真空或压力源的各个个别的螺线管。也可构思个别的真空或压力控制。

图23所示的气动集管700可操作图25所示的微流体微芯片600上的微型阀601至618。例如，为了将试剂从试剂源622移动到试样回路630，打开微型阀602、606和608，而关闭流通阀658。或者，通过关闭T型阀606和608并打开流通阀658，试剂可旁通试样回路630。流体地连接到气动集管的气动管路可控制该阀。例如，气动管路672被图23所示的气动集管700上的螺线管控制，以打开或关闭微型阀642。阀603、604、605、609、610常开，以流过包含微型通道641至644和656至668的微流体的回路。试剂移动到试样回路630内。

如果需要的话，622和612之间的回路可被过填充，或由MOVe微型阀精密地控制，以调制流动或控制时间。一旦试样回路630被填充，就选择了规定的体积。可通过清洗溶液或空气或气体冲洗通过主通道来清洁微流体的回路，以进一步限定试剂体积。如果试剂源621是压缩空气或气体源(压力和真空是加压流动系统内的试剂类型)，则打开微型阀601和微型阀606、610和616就形成回路来将试样回路630内测得的试剂移动到装置636。在一个实施例中，提供一种装置，以将任何数量的试剂源连接到诸如筒1的微型装置。

II.试样的平行处理

在本发明的某些实施例中，可同时操作一个或多个筒，以作试样的平行处理。图16示出拭子萃取组件800内单个气动集管上的带有微型阀的多个筒的平行或联动操作。集管370分配经调节过的真空和压力以使用螺线管680来操作图中示出的四个筒1。螺线管680通过气动集管370、380、390控制通向与每个筒集成在一起的微芯片的气动层的压力。气动集管由顶板370、垫片380和底板390形成。顶板可具有蚀刻在其中的通道。通道可用垫片密封，垫片被底板390夹心抵靠在顶板上。致动器310移动杆810而使磁体320移动靠近或远离筒1。夹具805将筒1固定就位。

在本发明的其它实施例中，与微芯片集成在一起的单个筒可使用平行通道一次处理多个试样。图14和图15示出用毛细管馈送和磁体组装的捕捉和反应的微芯片。该微芯片可捕捉珠粒溶液并同时执行四个STR-PCR反应。图14示出带有筒1203的微芯片1201，该筒1203附连到微芯片和通向微芯片和从微芯片出来的管子1205、1207、1209、1211、1213、1215、1217和1219。总共显示八个管子，每个平行反应使用两个管子。例如，管子1205和1213用于一个平行处理装置的单元。

在另一个实施例中，四通道试样准备装置(图66)组合了四通道平行试剂输送装置(图67)，后者同时计量和将试剂输送到单个集成的筒的所有四个通道(图68)，该筒能同时和快速地处理四个试样。

四通道平行试剂输送装置组合Chip C微芯片(见图67)与安装在气动控制集管上的流体集管。对于每个通道，使用两个不同尺寸的试剂回路中的一个回路来计量试剂，所述回路类似于这里所述的试样回路，并将试剂平行地输送到试样准备装置的所有四个通道。使用平行试剂输送装置将试剂同时输送到试样准备装置的所有四个通道可花费不到4分钟的时间，与每四个处理试样要花费约15分钟的第一代串联试剂输送装置相比，这表示省下了11分钟以上的处理时间。

通过使用粘结剂粘结方法来制造集管，可使用粘结的气动集管来控制试剂输送和试样准备装置；然而，由于在子系统中使用气动压力以及集管的尺寸和复杂性，随着时间推移这些粘结的气动集管易于分层。热粘结的集管可减轻分层的问题，但仅是对诸如试剂输送装置那样相对较小和复杂程度低的集管设计才是可行的。由单块聚碳酸酯材料制成且带有将气动端口连接到螺线管控制阀的管子的单体集管可操作四通道试样准备筒，并且已经证明是对粘结的气动集管的可行的替代方案，例如，可参见图45和图46。该气动集管设计理念也可应用于对后扩增STR(单串联重复：Single Tandem Repeat)清洁子系统上的Chip A微芯片的控制。

对于微芯片和四通道试样准备筒的流体集管的组装过程也已经作了改进。历史上，通过微芯片和立方体之间的毛细管现象，可利用硅环氧树脂将筒附连到其相关的MOVe微芯片上。固有地缺乏对环氧树脂运动的控制，可使它偶然毛细管地爬升到任意微芯片或立方体的端口上，在流体通道路径上形成堵塞，使得装置不可再用。通过使用双侧粘胶带(粘结研究公司(Adhesives Research)的ARcare90106)来组装流体立方体和微芯片，该过程已得到改进；这现已成为用于四通道试剂输送筒、试样准备装置和后扩增STR清洁子系统(下文中描述)内的后扩增装置的优选组装方法。

测试带有Chip D微芯片(见图69)的集成的四通道试样准备筒。图69左版面上显示的Chip D微芯片突出了设计上的一个问题，其中，PDMS薄膜不留心地关闭邻近于通过MOVe微芯片上阀的流动的流体通道。不局限于理论或推测，可以想到该后果是由于各种变数的组合所带来的，包括有微芯片组装过程中的对齐的微小差异、微芯片流体层的蚀刻深度，以及用来操作试样准备装置上微芯片的气动压力。图69右版面上显示的Chip E微芯片已设计成将所有流过阀的流动转换到共线的通道，所述阀在两个对分Chip D微芯片内的通道之间形成T连接，而所述共线通道具有仅通过通道中间的一个通道。Chip E微芯片可减小阀关闭过程中不留心的通道闭合发生概率。在图69的左版面中，其中沿着微芯片中间定位的四个圆可被独立地操作，并各可流体地连接到拭子萃取装置，该装置可用来从拭子萃取装置中萃取被分析物。微芯片中的其它端口可连接到筒的腔室(类似于图3和图4所述的端口和腔室)，腔室匹配于微芯片(图68所示)以执行诸如核苷酸粘结的反应。带有微芯片的集成的四通道试样准备筒的操作类似于图3和图4中所示装置的操作。

由于不留心将纤维引入这里所述的系统和装置内造成微芯片堵塞，可成为微流体中的问题。为了使堵塞降到最小，除了顺磁性珠粒溶液之外的所有试剂可在加载之前进行过滤，共线的过滤器可用来最大程度地减小微芯片堵塞。

第二代试样准备装置的子系统测试集中在系统重复性和失效模式的特征。总共80个试样在子系统上进行处理，成功率为63％。失效模式包括试剂管路意外地脱离(2.5％)、芯片堵塞(3.75％)、未观察到STR外形(9％)，以及DNA生长＜0.08ng(22％)，这是下游系统检测的限值。发现纯化DNA生长中的平均生长为0.26ng。STR反应中测试的大约一半试样给出全外形，一半给出部分的外形(见图70)。使用清洁过和再循环的筒在系统上处理多个坯料试样，移动对移动的交叉污染被发现可忽略。

III.集成的试样准备和聚合酶链式反应

在本发明的某些实施例中，筒可与用来执行聚合酶链式反应和产物分析的装置集成在一起。如此的装置显示在图6中。图6示出具有集成的微芯片1、温度调制装置400和下游分析装置500的筒。在某些实施例中，该装置包括流体准备模块，该模块包括匹配于或以其它方式流体地连接到微芯片的筒；通过带有诸如管子的流体通道的流体运送器、通过筒，连接到流体准备模块的芯片外(off-chip)的热调制模块，该模块还构造成调制流体运送器内的温度，其中，流体运送器还流体地连接到带有阀和流体通道的第二微芯片，流体通道可有选择地将流体引导到一个或多个其后的装置。该装置可用于热循环或等温反应。

带有集成微芯片的筒可由这里所述的任何筒和微芯片形成。例如，筒和微芯片显示在图3、图4和图5中。可移动的磁体300可定位在筒附近。该可移动磁体可通过致动器310移动。可移动磁体可用来在筒或微芯片内施加磁场。在某些实施例中，可移动磁体可用来便于集中或收集筒或微芯片内腔室壁上的珠粒。

温度调制器可通过反应通道250流体地连接到筒和微芯片。反应通道250可在端部251处连接到筒上。温度调制器可用于热循环含有反应混合物的反应通道250的温度，并从试样中富集核酸(统称为PCR反应试样)。控制机构可用于控制温度调制器的操作。光学组件可用于监视或控制该反应。该光学组件可引入或探测光线。例如，光学组件410可用来执行实时PCR或其它实时或终点测量。在某些实施例中，温度调制器使用热偶联的珀耳帖热电模块、传统的热电模块、热空气、红外线或微波。在一个实施例中，温度调制器使用反应腔室外面的珀耳帖热电模块来按需要加热和冷却PCR反应试样。热电模块的加热和冷却可在区域350上分配。温度调制器400的其它附加视图显示在图7和图8中。图7示出与温度控制区域350接触的反应通道250。温度调制器还可包括由致动器330来定位的可移动磁体320。该可移动磁体可用来捕捉位置340处的磁性颗粒，如图6所示。在本发明的某些实施例中，温度控制区域包括两个部分。该两个部分可以是蛤壳的两部分，它们夹紧、锁定或固定在一起而保持与反应通道250热接触。温度控制区域的一部分，图8的部分711可铰接到温度控制区域的第二部分。温度控制区域可具有开槽通道，用于一个或多个反应通道的定位，如图7的右侧和图8所示。图7的左侧示出处于关闭构造中的温度控制区域。此外，温度控制区域可包括一个或多个限制部件，如图8中的709和701所示。限制点可捏住反应通道，使得反应通道的一部分与反应通道的另一部分隔绝开。在某些实施例中，反应通道被捏紧在两个部位处，使得诸如反应混合物的流体主体被隔离。限制部件709和701可与附加的限制部件707和705匹配，以便捏住反应通道。

或者，如图65所示，温度调制器可使用捏紧夹具来限制反应管道。使用捏紧夹具可减小对反应通道的热传递，该夹具可呈塑料的形式，例如Ultem。热传递的减小可在热循环或温度调节过程中减小反应通道被焊接关闭住的几率。或者，不同材料的管子可用作反应通道，以确保在热循环或温度调节之前和之后反应通道可保持其形状。不同材料管子还可用来减小温度调节过程中的蒸发率。示例的材料包括乙烯基醋酸酯、硅树脂以及硅烷化的c弯曲的管子。

温度调制器可以每秒0.5至3以上摄氏度的速率调制温度。加热器可利用约25至100W，风扇可用来冷却温度调制装置，其可产生至少约为75、100、130、150、200、250或300cfm的空气流量。

在一个实施例中，试样准备装置包括与微流体微芯片1集成的筒，其可用来控制筒内流体的运动，并可结合温度调制器400作为流通PCR热循环器使用。移动流体的驱动力可以是外部压力源或内部压力源，诸如微芯片内的MOVe阀。流通PCR热循环器可在要求有高灵敏度或高输出的PCR时使用。存在许多这样的情形，其中，人们可能要对试样空气、血液、水、唾液、细胞试样或其它介质在高灵敏度的PCR化验。这可用来寻找各种生物污染物，包括流行性感冒、细菌病原体和任何数量的病毒或细菌病原体。流通PCR可允许PCR以自动化方式实践，而不需人类干预。流通PCR系统还可用作为建筑物的HVAC、飞机、公共汽车和其它车辆的报警系统，并可用于监视血液、水或其它试样源是否存在传染性的试剂或污染物。

如图6所示，流通PCR装置从收集装置中取出试样，例如，口腔拭子、注射器、空气采样器、流体采样器或其它采样器，并将其输送到试样准备装置1。图6不必按比例绘制。试样在准备装置1内作准备。在某些实施例中，试样可包括细胞溶菌、DNA、RNA或微RNA富集或纯化、过滤或逆转录。在一个实施例中，至少一个核酸被富集。在另一个实施例中，通过将核酸添加到PCR试剂(诸如至少一个DNA聚合酶、RNA聚合酶、Dntp/缓冲剂或盐)和引物(诸如化验专用引物或广义上使用的用于多个目标病原体的引物组)，可对PCR准备至少一个富集的核酸。可选择这些引物以便有选择地扩增至少一个核酸，其隔绝于专门的病原体(诸如霉菌、病毒、细菌、寄生虫或阿米巴虫)、基因、其它要求的核酸，或它们的任何组合。该组分包括至少一个从试样、PCR试剂和引物中富集出来的核酸，该组分被称之为PCR反应试样。在一个实施例中，流通PCR可用作为连续流动装置，而在其它实施例中，将试样移入到热循环区域内并停止。

PCR反应试样然后流过反应通道250流到温度控制装置或区域350。在某些实施例中，反应通道清洁或透明的。在另一实施例中，反应通道是不透明的。在一个实施例中，反应通道是圆柱形。在另一实施例中，反应通道的横截面包括一种或多种平面形状，诸如三角形、正方形、矩形、五边形、六边形、七边形、八边形、九边形、十边形，或其它多边形。在一个实施例中，PCR反应试样的体积应是这样：它在反应通道内占据空间的小的离散长度，其余的长度被空气、气体或非反应性液体(诸如矿物油)占据。空气、气体或非反应性液体可用来使个别的PCR反应试样彼此分离。在一个实施例中，温度控制区域350被一个或多个模块热调制，包括但不限于：热偶联的珀耳帖热电模块、传统的热电模块、热空气、微波或红外线。在一个实施例中，热循环器使用管子外面的珀耳帖热电模块来根据需要加热和冷却试样。在一个实施例中，探测模块410测量荧光性、发光性、吸收性或其它光学特性，以探测从PCR反应试样中发射出的信号，同时它位于温度控制区域内，或在其后留下一温度控制区域。探测模块可包括光源(诸如连贯的光源或不连贯的光源)，光源用来激励PCR反应试样中的荧光染料(诸如插入染料，包括但不限于：溴化乙锭或Syber绿)，用光探测器(诸如CCD、CMOS、PMT或其它光学探测器)来检测该激励光。探测电子仪器可评估从探测模块410中发出的信号。

在一个实施例中，在完成要求数量的热循环之后，使用压力或真空，退出温度控制区域并通到第二微流体微芯片500内，使PCR反应试样被泵送或进一步下推反应通道。第二微芯片500可在端部252处附连到反应通道250。微流体微芯片500可包括微型阀510、520、530和545。诸如510、520和530或510、520和545那样任何三个微型阀可形成一个泵。微型通道505、515、525和540可连接微芯片上的泵。下游装置535和550可连接到微芯片。流入装置535和550内的材料流可受微型阀控制，例如，通过保持任一阀530或545关闭，而同时泵送或移动流体。在一个优选实施例中，下游装置是分析装置，其可用来执行电泳、质量分光镜，或本技术领域内技术人员公知的其它分析技术。

在一个实施例中，第二微流体微芯片可将PCR反应试样输送到模块或区域，以作进一步处理或分析。在另一实施例中，多个反应通道可平行地使用来提高试样输出。在还有另一实施例中，当扩增发生(正向结果)时，系统可向使用者报警，指出存在目标顺序。在一个实施例中，反应通道仅用于单次使用，然后就丢弃掉。在一替代实施例中，反应通道可用于扩增和探测多个试样中PCR扩增产物的存在或不存在。一个以上的PCR反应试样可间距地定位，并留有空间给气体或液体的阻挡团块，以防止互相混合。在一个实施例中，试样以某种方式间隔开，以使一个试样经历热循环时，另一个试样处于经历问询的探测区域内。本技术领域内的技术人员将会明白到，PCR扩增可被其它核酸扩增技术所替代，这种技术可使用热循环或是等温反应。

在其它实施例中，该装置可执行等温反应，诸如使用如抗体或适体之类的亲合试剂的夹心化验，以确定是否存在细胞、蛋白质、毒素或其它目标，让探测模块410提供有关目标量的读数。在这些应用中，筒1可执行诸如IMS纯化的亲合纯化，然后，添加可具有附着的荧光标签的第二抗体。试样然后可移动到区域350内，那里，设置热控制来优化反应。探测模块410然后可监视该反应。在一个实施例中，多个筒成组到反应通道250，用探测器410可读出一系列的团块。

IV.用于毛细管电泳的装置

在一个实施例中，使用一个完全的试样一结果的系统，该系统可包括微流体，需要将所有步骤连接在一起来匹配体积和浓度。使用毛细管电泳的试样分析是标准的分析方法，其可用于如上所述的微流体的试样的准备方法。毛细管电泳容易适于微流体微芯片。在本发明中，微芯片上的毛细管电泳与MOVe阀组合而对试样、处理珠粒提供控制以富集试样，并改进加载和分离。

在一个实施例中，双T注射系统用于分离之用的微流体注射器的设计中。在一替代实施例中，一种设计用于叉形阴极注射器(图30)。该设计与双T类似之处在于，试样塞由邻近于分离通道的通道一部分所描述，但存在关键的差别。首先，阴极通道被分为两个部分，这在电气上将注入分为分裂为两个部分，因此，对于给定的试样塞尺寸来说，使注入的材料量翻倍。第二，试样通道和分离通道彼此成直角。这允许试样通道变直并用缓冲剂(不是分离聚合物)填充，这便于用泵操纵该通道的内容物，并使流体流动，且允许分离聚合物接口变尖。最后，注入可在允许场扩增试样堆叠(Field Amplified Sample Stacking：FASS)的模式中进行。

图30示出叉形阴极注射器的实例，该注射器利用微型通道作为叉形阴极。如图30所示，试样横贯试样加载通道(显示在图的左下角，有箭头通过其中)电子运动学地移动。然后，通过在试样和电极臂(两个通道下落)之间施加电场，同时对试样和废液施加回拉，可将试样驱动到分离通道内。初始的试样塞尺寸由阴极臂之间距离确定。通道的结构允许塞更易复制并更易与MOVe微流体系统集成。

在图30所示的本发明的一个方面中，流体通道3003与叉形电极3001和3002电气地接触。电极与通道的接触点间距开，由此，形成其中存在有电场的通道段落。分离通道3004在叉形电极的接触点之间的段落的某一点处与流体通道3003相交。相反电荷的另一电极放置成与分离通道电气地连接。这样，通过分离通道施加一电压。

图62示出连接到试样通道6005的试样源6009，试样通道也被称之为加载通道，它与分离通道6011匹配。两个电极6003和6001可用来对分离通道施加电场。在本发明的某些实施例中，试样源可通过微芯片内的MOVe泵，该泵用来驱动试样通道内的流体流动。试样通道可以是微流体通道或注射管子。注射管子可以是柔性管或其它的柔性连接器。柔性管子的实例包括聚四氟乙烯管子或硅管子。柔性连接器还可连接到与微芯片接口的另一筒。或者，柔性连接器可返回到其起源的筒。分离通道可以是微流体通道、毛细管管子或毛细管电泳管子。毛细管的外直径约为150至500微米，内直径约为10至100微米。毛细管可以是聚酰亚胺或聚四氟乙烯镀层。毛细管可约为2至100cm长。通过先在注射管内钻孔，然后将毛细管插入柔性管内，就可使毛细管匹配于注射管或柔性管。或者，毛细管可插入柔性管子内，不必预钻孔柔性管。

两个电极之一，例如，电极6003可以是阴极，而另一电极，例如，电极6001可以是阳极。阴极可以是诸如这里所述的叉形阴极那样任何的电极。阳极可以使用本技术领域内技术人员公知的任何装置连接到分离通道。例如，分离通道可以通过阿普彻奇配件连接到一容器，所述配件与阳极电气地接触，该阳极可以是金属电极。

在本发明的某些实施例中，显示在图63中的分离毛细管和注射管的相交处的稳定部件可用来对齐、密封和/或保护分离的毛细管和注射管之间的连接。在本发明的某些实施例中，多个注射管使用稳定部件与多个分离的毛细管对齐。如图64所示，稳定部件可固定四个注射管，在图中它们被显示为垂直管子，并稳定与四个分离毛细管(未示出)的连接。

图62中的版面1-6示出将试样注射到分离通道内的过程。在版面1中，没有试样存在于试样通道6005内。在版面2中，显示从试样源6009进入试样通道的试样。如版面3所示，试样沿试样通道下移，试样相交于分离毛细管。试样可被相对于试样的上游和下游的气体团块隔绝。一旦试样邻近于分离通道，一介于25和500V/cm的电场施加在第一电极6003和第二电极6001之间，第一电极可以是阴极或叉形阴极，而第二电极可以是阳极。电泳缓冲剂显示为从试样源进入到试样通道，该电泳缓冲剂也可进入到试样通道，如版面3所示。当空气团块通过试样通道和分离通道之间的连接处时，阳极和阴极之间的电压和/或电流可下降，从而减小或防止空气注入到分离通道内。可探测电压和/或电流的下降以查明试样/或电泳缓冲剂何时邻近于分离通道。一旦电泳缓冲剂邻近于分离通道，如版面5所示，则可提高阳极和阴极之间电流和/或电压降。这可允许在电泳缓冲剂对高性能分离提供离子时分离分离通道内的被分析物。

FASS是一种色析法技术，该技术使用低导电率区域造成的提高电场来提高试样区域内被分析物的可活动性，并集中低导电率区域接口处的被分析物，即，在分离的基体处。以此方式运行注射器的实际结果可见图31。可观察到试样塞长度的显著减小，这里也称之为堆叠。

用缓冲剂填充注射器(虚线)，然后，加载分离聚合物(实线)，同时扫描该接口。用低离子强度的介质中的试样反应产物填充试样通道(水平通道)。这允许试样堆叠并显著地减小试样注射塞的大小。这显示在图31右边上的五个框架对于左边版面上的所有聚合物注射。离子强度和堆叠的作用可见从第二个左到右的图像，此时，缓冲剂稀释度提高而离子强度降低。试样塞从约300微米变窄到小于100微米。

在一个用于STR分析的实施例中，注射过程如下：

微流体通道可用缓冲剂填充。

分离通道可用凝胶填充，而横贯试样通道曳拉缓冲剂，因此，从由分离通道和试样通道形成的横截面中扫清分离聚合物。

STR扩增的试样(在珠粒上脱盐和捕捉)可在微芯片500上捕捉，在含有标准规格的低导电率流体(水)内进行洗脱，并用MOVe技术泵送到试样通道内。

电场可施加到阴极和阳极之间，在试样和废液臂上形成“回拉”电压，以将试样驱动到分离通道内，在分离通道内试样堆叠在分离聚合物的头上。

当试样注射时，试样通道的导电率可快速地与提供单一步骤注射的阴极臂内的缓冲剂平衡。

对于DNA在微芯片通道内的分离，可优化MOVe控制的叉形阴极注射器设计。除了上述的FASS之外，独特的集成注射器设计还包括MOVe泵送系统，该系统便于使用磁性珠粒技术来脱盐和集中试样。

纯化的STR扩增产物从磁性珠粒中洗脱、热变性并泵送通过叉形阴极注射器的加载通道洗脱。施加电压区域来促进聚合物柱头上的FASS的注入，而DNA的分离在聚合物填充的微型通道内(图33)进行。在图33中，照片示出注射器内染料的移动，以便示出STR试样的注射机理。当注射开始时，场扩增的堆叠发生在聚合物头处。

或者，叉形电极或阴极可以是两个金属导体，如图60所示。待分析的试样的流体路径如图60所示可以沿着加载通道。如文中所述，当试样的位置邻近于分离通道时，可用叉形电极将试样注入到分离通道内。试样通道内的材料的导电性可低于分离通道内的材料的导电性，分离通道内的材料可以是分离聚合物。导电性的差异可在电场施加通过叉形电极和下游电极时造成试样堆叠，该叉形电极可以是阴极，而下游阴极可以是阳极。叉形电极和下游电极的极性可以反过来，以使叉形电极是阳极，而下游电极是阴极。

在本发明的某些实施例中，附加的电极可用来减小注入到分离通道内的气体或形成在试样加载通道内的气泡，气体的注入或气泡的形成可导致分离通道上施加的电场的损失。注入到分离通道内的气体或试样加载通道内形成的气泡可导致被分析物不一致的分离，并可通过用来向分离通道施加电场的阳极和阴极之间的不一致的电流进行探测。使用附加的电极来阻止或减小注入到分离通道内的气体或气泡显示在图61中。附加的电极可以是单导线的电极或套筒形的电极。套筒形电极增大的表面面积和/或较大的内直径可允许显著地减少气泡的形成或堵塞和/或注射到分离通道内。在本发明的某些实施例中，用于套筒形电极的套筒的内直径至少约为1/64、1/32、1/16、1/8或1/4英寸。

V.mRNA扩增

本发明的装置可用于微型阵列试样准备过程。基因表达微型阵列监视细胞信使RNA(mRNA)水平。然而，mRNA可构成仅是细胞总RNA的1-3％。大部分的细胞RNA是核醣体RNA(rRNA)，为了杂交到微型阵列试样，通过与mRNA竞争，这些分子可与mRNA分析相干扰。可用这里所述的装置，例如，LAMP、TLAD(Eberwine)和MDA，来实施任何mRNA扩增方法。在本发明的某些实施例中，等温mRNA扩增方法可使用这里所述装置来实施。在其它实施例中，可实施热循环来实现PCR或循环测序。

Eberwine mRNA扩增程序特别目标在于用于扩增的多聚腺苷酸mRNA(polyA+mRNA)，实质上消除rRNA干扰。该特征可从总RNA中移去对预纯化mRNA的任何需求，预纯化mRNA可以是一低效耗时和费钱的过程。此外，通过大大地提高可供给微型阵列杂交的目标RNA量(即，扩增的mRNA或aRNA)，mRNA扩增可允许分析远小得多的试样(很少的细胞)。这可以是有助的，因为微型阵列分析所需的相当大量目标RNA(通常为15ug)经常难于获得。此外，在许多重要的门诊诊断应用中，重要的是分析含有较少细胞的试样，例如，从细针抽吸(FNA)或激光捕捉切开(LCM)中得到的试样。

改变相对的mRNA冗余水平的任何过程可能干扰精确的基因表达形式。Eberwine扩增程序的重要方面在于，它使用了线性扩增反应，其比诸如PCR的指数扩增方法更不易偏置mRNA的总体。

初始的Eberweine协议被诸如Ambion的商业卖主流水线化和简化了。如图44所示，Ambion程序包括三个二元(两组分)添加，其后是RNA纯化过程。每个二元添加可以后跟特定温度下的培育，如图44所示。初始的逆转录反应(RT)可具有三个输入(引物、总RNA和逆转录[RT]混合物)；然而，总RNA和引物可方便地预混合。第一次反应的通常体积可以是5ul RNA+引物和5ul RT混合物。仅mRNA杂交到少数dT引物并转录到DNA。第二链反应可通过添加20ul第二链混合物来启动，最后的T7扩增反应可通过添加30ulT7混合物来启动。合成的RNA可在此阶段通过掺合生物素标签的生物素核苷酸进行标记。混合物包含缓冲剂(Tris)、一价和二价盐(KCl、NaCl、MgCl₂)、核苷酸和DTT，连同如上所述的酶。通常酶可与集中混合物就在使用前预混合。

合成之后，aRNA可被纯化而除去酶、缓冲剂、盐、未掺合的核苷酸、焦磷酸盐等。纯化通常依赖于商业成套工具，在诸如氢氯化胍盐(GuHCl)或硫氰酸盐(GuSCN)之类的离液盐存在情况下，该工具开发aRNA与硅石薄膜或珠粒的连接。在连接之后，硅石用70％的乙醇清洗、干燥，并用水洗脱aRNA。

这些各个步骤可在这里所述的装置上实施(参见美国临时专利申请61/140,602)。例如，试剂和试样可通过筒中的端口供应，然后，输送到微流体微芯片。芯片内阀可用来通过通道将试剂和试样泵送到腔室和筒中的容器以及微流体微芯片。使用内部或外部加热和冷却装置可实现温度控制。反应产物可移到筒的产物出口端口，以作进一步处理。或者，反应产物可使用本发明装置纯化或分离。

VI.分离和清洗

可使用这里所述的装置进行各种分离。这些分离包括色析法、亲合力、静电、疏水性、离子交换、磁性、曳拉基和密度基的分离。在本发明的某些实施例中，可利用亲合力或离子交换互相作用将材料粘结到诸如珠粒的固体材料。珠粒可使用本技术领域内技术人员公知的任何方法与流体溶液分离。

使用机械简化格式，其采用顺磁性珠粒和磁场，则在单一步骤中，磁性分离可用来捕捉和集中材料。珠粒可用来分离、集中然后纯化特殊的目标抗原、蛋白质、碳水化合物、毒素、核酸、细胞、病毒和真菌。珠粒可具有特殊的亲合力试剂，通常是抗体、适体或粘结到目标的DNA。或者，静电或离子配对或盐桥互相作用可粘结到目标。珠粒可以是顺磁性珠粒，其仅在外部磁场下才有磁性。或者，珠粒可含有永久磁体。珠粒可添加到复杂试样，例如，浮质、液体、体液、萃取物或食物。在粘结到诸如DNA的目标材料之后(或之前)，通过施加磁场可捕捉珠粒。未粘结或疏松粘结的材料可用相容的缓冲剂清洗后移去，这使目标物从原始试样中的其它不需要的材料中纯化出来。珠粒可以很小(nm至um)并可粘结大量的目标物。当珠粒通过磁力被集中时，它们可形成仅nL-μL体积的珠粒床，因此，在纯化的同时集中了目标物。纯化和集中的目标物可方便地被运输、变性、在珠粒上溶解或分析，或从珠粒中洗脱，以作进一步试样准备或分析。

分离广泛地用于许多应用中，包括检测食物、体液和其它基体中的微有机物。顺磁性珠粒可以被混合和容易地操纵，并适于微尺度和微流体的应用。该技术对宏观尺度-微观尺度接口提供优良的解决方案：珠粒可在宏观尺度下纯化试样，然后集中到毫微尺度(nL的100倍)，以引入到微流体或毫微流体的平台。在实时PCR、电化学发光、磁力识别、磁致发光、毛细管电泳、场流分离，或本技术领域内技术人员公知的其它分离方法之前，磁性分离可用作上游的纯化步骤。

本发明的装置可适应磁性珠粒的使用。例如，珠粒或珠粒浆可供应到筒的一端口。使用泵送、磁场或外部混合器，可使珠粒混合或悬浮在筒内的溶液内。珠粒然后可泵送到微流体装置或筒内的要求的腔室或容器。珠粒可使用磁场被捕捉到腔室内。溶液中的珠粒可通过磁场随着溶液的移动而被捕捉，或珠粒可在停滞的溶液内被捕捉。

为了说明使用筒的方法，下面描述几个实例。第一实例描述了用顺磁性珠粒处理取自口腔拭子中的核酸以纯化试样，其后进行PCR扩增和PCR产物的珠粒纯化。第二实例描述了使用偶联到珠粒的粘结半部来实施免疫磁性分离，以纯化细胞、蛋白质，或其它抗原材料。第三实例描述了对于诸如通过合成的排序、通过杂交的排序、通过绑扎的排序等的排序技术，实施分子生物学来准备试样。本技术领域内技术人员应该知道，许多不同的化学和生物化学可用于本发明。它们包括但不限于：酶反应、凝胶、单体、珠粒、充填床上的纯化、表面反应、分子生物学，以及其它化学和生物化学的反应。

实例

实例1：用于核酸纯化的筒的操作

该实例涉及一种装置的使用，该装置包括匹配到微芯片上的筒。编号涉及图3和图4的筒，它们匹配于图5带有电路结构的微芯片。该子组件也可流体地连接到图6仪器中的其它子组件。为参考起见，与微芯片匹配的筒也显示在图40和图59中。

对于许多用途，核酸可由各种基体纯化，所述用途包括但不限于：基因分型、识别、法医、基因表达、基因修改、微RNA分析、核糖分型、诊断，或治疗。输入试样可以是固体、拭子、液体、浆液、浮质或气体。

对于分子诊断和法医，拭子被广泛采用。使用一带有可弹出末端的拭子，且该拭子弹出到附连到图4连接结构7的注射器，则取到口腔拭子。图4的连接结构5通过管子或毛细管通到试剂集管，集管可通过打开全阀或打开MOVe阀来从多个试剂中选择单个试剂，所述试剂可在压力下或真空下移动。图4微芯片上的MOVe或其它微型泵也可移动流体或气体。

在一实施例中，使用缓冲剂首先裂解拭子中的人类细胞和其它细胞，使注射器中加热的离液试剂和/或其它商业上现货供应(COTS)的化学品插入到端口7中。裂解产物被运输到DNA隔离腔室(图4#3)，已经从容器中将顺磁性珠粒添加到腔室，以将核酸吸附到珠粒上。然后，致动可移动的磁体将珠粒捕捉到隔离腔室一侧，那里，它们使用缓冲剂自动地进行清洗。仍粘结在珠粒上的纯化的DNA然后泵送通过小直径管子250，那里，执行多元的PCR。规定的DevLink^TM软件自动完成全过程。DevLink软件在标准化自动结构中定义了一组通讯和指令规程，该结构比其它软件开发的方法更简单、灵活和快速。DevLink执行框架是基于跨越多个操作系统的内核技术、开发语言和通讯协议。软件驱动器包装系统的个别智能化部件，大大地减少了通常更新系统、软件开发所需的时间。这使得集成COM或NET基的多个系统模块(泵、阀、温度控制器、I/O控制器等)的操作相当直接。DevLink通过产物释放和维护，提供了用于原型的专业质量软件开发系统。

尽管DNA扩增对于有效识别微型有机物是有用的，但试样也可从各种基底和含有禁止DNA扩增反应的化合物的基体中获得。原始试样通常是复杂的混合物，其可包括诸如亚铁血红素、金属离子、腐殖酸和棕黄酸、螯合剂、DNA酶、蛋白酶和真菌的抑制剂。尽管从试样基体中通过IMS初始隔离出目标有机物和毒素应除去大部分这些抑制剂，裂解的细胞部件和消退剂也可需要被移去或从核酸试样中稀释，以便不与成功的扩增相干扰。

在一实施例中，采用小体积核酸纯化。这些纯化方法可用于很宽范围的试样，诸如血液、浮质至口腔拭子。顺磁性珠粒可用于所揭示的装置，以从各种试样源中纯化DNA。在一实施例中，微流体微芯片可被用来使用磁性珠粒和试剂对核酸测序，为微尺度反应测序而纯化核酸。在一实施例中，微流体微芯片是24通道的微流体微芯片。

在一实施例中，在羧酸酯磁性珠粒上使用聚乙二醇(PEG)基的核酸纯化。该PEG促进过程可从上游免疫磁性分离(IMS)捕捉试样产生超过80％的产量。通用试样准备模块(USPM)的开发可部分地包括将PEG基的核酸纯化对口到诸如图21或图16所示装置的含有筒的装置上。在另一实施例中，AgencourtOrapure或Promega DNA IQ化学品可结合本发明装置使用。

珠粒分配和输送

为纯化核酸，可在试剂容器内混合带有不同表面化学特性的顺磁性珠粒。然后，施加压力将试剂送到连接结构5。除非涉及到打开，否则MOVe微型阀或其它阀可关闭。为了将顺磁性珠粒移动到反应腔室3内，微型阀180和150打开。珠粒通过连接结构5移动到通道15，该通道通向连接处190和微型通道191。因为微型阀180和150打开，而微型阀200和170和其它微型阀关闭，所以，打开的微流体的连接是从微型通道191通过微型阀180到微型通道181，通过微芯片152到打开的微型阀150，通过微芯片151到连接处120。连接处120通向锥体13和腔室3，腔室可用珠粒填充。可通过定时打开试剂阀和微型阀的时间，或通过填充和放空连接到微芯片或筒的回路，来控制供应到腔室3的珠粒体积。

商业的珠粒基化学品可用于所揭示的系统，包括但不限于：由安进科公司(Agencourt)(美国麻萨诸塞州沃尔瑟姆市(Waltham MA))出品的Orapure和普洛麦格公司(Promega)(美国威斯康辛州麦迪逊市(Madison，WI))出品的DNA IQ。Orapure使用羧酸酯磁性珠粒表面和SPRI化学品，而DNA IQ是硅石珠粒和离液化学品的实例。用于处理核酸的顺磁性珠粒或化学品的其它实施例可结合所揭示的系统使用，包括但不限于：带有寡核苷酸的珠粒、锁定核酸、退化碱、合成碱、构造、核酸结构，或其它杂交和特殊捕捉方法。

用珠粒填充腔室3

对于Orapure或DNA IQ珠粒，使用三次填充150微升的试样环路630或631，可将450微升移入腔室3内。附连到致动器310的可移动磁体300然后可朝向靠近腔室3一侧的筒1移动，以将珠粒拉到腔室3那侧。磁体大小和定向可调整而产生适合于特殊应用的磁场。然后，加压空气可通过试剂集管施加，使微型阀180、150和110打开。微型阀110的开口从连接处190连接到连接结构100，所述连接处190通过连接处120和微型通道121和101连接到试剂集管，而连接结构100通过通道14通向连接结构4和废液。空气可通过回路移动任何其余的液体。空气或其它气体也可用来干燥珠粒、蒸发溶剂，或使气泡混合(如文中所述)。

通过腔室3的气体起泡

如果微型阀180、150和220打开，而所有其它的微型阀关闭，则压力可强迫空气通过腔室3到通道9和下通道19，通过微型通道211和221到连接处210，通过打开的微型阀220和微型通道231到连接处230，通过通道16到可以是一通风口的连接结构6。该顺序可使空气或其它气体起泡而通过腔室3，并可用来混合腔室3内的反应，或改变气体相。

将液体和珠粒从腔室3移至废液

液体和珠粒可从反应腔室3或任何其它位置移至废液。这可用来清洗珠粒、冲刷通道、移动液体或珠粒到废液。当压力施加到连接结构6而使微型阀220和110打开且所有其它微型阀关闭时，压力可强制空气通过通道16到连接处230到微型通道231，通过打开的微型阀220和微型通道222和221，通过连接处210和通道19和9进入到反应腔室3内，并通过连接处120通过微型通道121、打开的微型阀110、微型通道101、通道14到连接结构4。

如果连接结构6是通风口而没有对气压的任何附加控制，则通过对连接结构4施加真空，可获得等价的效果。空气压力或真空可将腔室3内任何液体移到废液连接结构4。当磁体300靠近腔室3时，顺磁性珠粒可保持在腔室3那侧上，其结果，液体被移走。当磁体300足够远离腔室3时，顺磁性珠粒不可保持在腔室3那侧上，其结果，液体和珠粒被移走。

为了清洁顺磁性珠粒，用磁体300将珠粒拉倒腔室3那侧(见图6)，而液体被移除到废液。450微升缓冲剂可从试剂集管分配，并通过打开微型阀180和150添加到腔室3。如果需要的话，可释放珠粒，然后，通过移动磁体300再捕捉珠粒，然后移走液体。这总共重复三次，以产生准备用于处理试样的珠粒。

从拭子上的细胞中裂解和萃取核酸

拭子可加载到插入到连接7内的注射器筒内，然后通过试剂连接结构5添加裂解的缓冲剂进行裂解，使微型阀180和170打开。在某些实施例中，可使用Orapure或DNA IQ化学品。

裂解的细胞材料移至腔室3的运动和与珠粒的混合

通过对注射器施加压力或通过对通风口6施加真空，可将连接到连接结构7的注射器中的材料移入腔室3内。当使用真空时，微型阀170、150和220被打开。真空通过微型通道231、221、211和通道9和19通过腔室3连接微型通道151、152、171和161，以将材料从连接结构7拉到腔室3内。当顺磁性珠粒被加载和在腔室3内清洗时，裂解的试样材料与腔室3内珠粒混合，使磁体处于远的位置。

珠粒上核酸的纯化

顺磁性珠粒然后用裂解试样进行培育。连续的空气或气体流可辅助混合。磁体300然后移至关闭位置，珠粒被捕捉在腔室3的壁上。试样裂解物然后可从腔室3移走到废液，根据制造商的规格书要求添加多份体积的冲洗溶液，用于Orapure化学品或DNA IQ化学品。珠粒上的试样组分现已被纯化，并准备用于筒中的反应，或出口到试样产物连接结构。在一实施例中，珠粒用来富集来自试样的核酸组分。

通过试样产物连接结构8输出试样

通过在试剂连接结构5上施加压力并使微型阀180、150和130打开，珠粒上的纯化试样组分可移动到连接结构8。在一实施例中，连接结构8与诸如C形弯曲管(Cole Parmer)的反应通道250连接，而附加反应在反应通道内进行。

STR标记的多元PCR扩增

DNA扩增可通过PCR扩增来实施。本发明能进行PCR反应以及许多其它DNA扩增和修改反应。反应可在腔室3内、附连到呈管子250的连接结构8的反应通道250内(图3、图4、图6)，或连接到管子250的其它装置或微型装置内实施。这表明试样准备对于包括热循环的DNA反应的应用。

在反应通道内捕捉含有核酸的珠粒

通过施加压力或通过施加到端部252的真空，将通过试样产物连接结构8的纯化DNA输出移动到端部251处的反应通道250内。致动器330在软件控制下将磁体320移动到靠近珠粒捕捉区域340的位置内。可使用不同大小和形状的固定磁体(诸如稀土磁体)以及电磁铁或超导磁体。当含有珠粒的溶液移动通过区域340时，磁场将珠粒吸引到反应通道一侧，并将它们固定在位置上。然后，通过离开空气中的珠粒区域340的试剂连接结构5，在空气压力作用下后跟流体。

添加试剂和将试样移动到反应区域内

试剂可从如上所述的试剂集管中添加。在一实施例中，试剂从反应通道250的端部252添加。端部252附连到包括微型阀510、520、530和540的微流体微芯片500。诸如微型阀510、520和530或510、520和540的任何三个微型阀可形成泵。微型阀530通过微型通道连接到下游装置535，下游装置535可连接到通向试剂容器的管子。微型阀540通过微型通道连接到下游装置545，下游装置545可连接到通向试剂容器的管子。

反应混合物(诸如至少一个DNA聚合酶、dNTP、缓冲剂和盐)包括但不限于：试剂容器600内的主混合物和引物(诸如化验专用引物或广义适用的用于多目标病原体的引物组)，或诸如由普洛麦格公司(Promega)(美国威斯康辛州麦迪逊市(Madison，WI))生产的PowerPlex16的完全PCR主混合物，或由应用生物系统公司(Applied Biosystems)(美国加利福尼亚州福斯特市(Foster City，CA))生产的IdentiFiler或MiniFiler，反应混合物可由微型阀530、520和510形成的微型泵通过管子610和微型通道531、521、511和512输送到如图6所示的反应通道250的端部252内。MOVe微型阀可精确地定位流体，并将流体移动到反应混合物遇到包括核酸的珠粒的区域340。磁体320通过致动器330移离反应通道250，该致动器330从反应通道250的内表面释放珠粒。微芯片500上的MOVe微型阀将珠粒泵送到装置400内，使反应通道250的区域形成温度控制的区域350。区域350可保持在等温温度上或热循环或本技术领域内技术人员公知的其它变化上。区域350可以是温度调制器或热偶联到温度调制器上。

图7示出温度控制装置400，其可使用温度调制器进行热调制以进行加热和冷却，使反应通道热循环。在一实施例中，温度调制器包括珀耳帖模块、红外线模块、微波模块、热空气模块或光模块。在另一实施例中，PCR反应试样在反应通道内移动通过一个或多个恒温区域。

图9示出PowerPlex16STR反应的扩增，其取自口腔拭子试样中在筒1内进行了准备，并使用图7的温度控制装置400在反应通道250内进行处理。STR标记由对装置1000进行Mg优化的标准条件下扩增。

温度控制装置400还可具有探测器410。该探测器可探测光学的检测特性，诸如吸光率、荧光性、化学发光性、成像和本技术领域内技术人员公知的其它形态特性，或者诸如IR、NMR，或Raman光谱学。探测器可包括光源，其用来激发PCR反应试样中的荧光性或发光性染料，激励光可用光探测器(诸如CCD、CMOS、PMT，或其它光学探测器)检测。在一实施例中，光源是连贯光源，诸如激光或激光二极管。在另一实施例中，光源不是连贯光源，诸如发光二极管(LED)或卤素光源或水银灯。

对于核酸扩增来说，实时PCR是核酸化验方法的一个实例，该方法可在温度控制区域350内的管子250内实施，并用探测器410进行探测。

微芯片上的反应

除了传输到管子之外，如图6所示，装置1000可将材料传输到微芯片。为了便于该溶液移动到微流体装置上以作处理，微芯片可特殊地设计成有大的MOVe阀，以用于大体积泵送和珠粒捕捉，用于与输入和输出毛细管接口的台阶形端口，用于试剂引入的侧端口以及1μL反应腔室。为求微芯片的细节可参照图11、图12和图14。

图11示出微芯片的示意图。图11中的左图示出珠粒从筒和设备装置引入和捕捉。大的泵101和磁性珠粒捕捉腔室103通过毛细管从筒中馈送。输入毛细管指出试样在何处通过筒添加。输出毛细管指出试样在何处通过筒移走。珠粒可放置在输入毛细管内，然后，通过输入毛细管和磁性珠粒捕捉腔室103之间的阀的泵送，移到磁性珠粒捕捉腔室内。阀用黑圆和相对的三角形表示。可移动磁体可邻近于磁性珠粒捕捉腔室定位，以在承载珠粒的溶液流过磁性珠粒捕捉腔室时捕捉磁性珠粒。右图示出当试样移到反应腔室内时，STR预混合中的珠粒和DNA的再悬浮。右图中两个箭头表示STR预混合和DNA在何处可添加到微芯片。箭头所指部位和反应腔室之间的阀可用来将DNA或STR预混合泵送到磁性珠粒捕捉腔室内以使珠粒再悬浮，然后进入到反应腔室内。

图12和图13示出从筒装置中传输之后捕捉在微芯片上的珠粒。通过使用邻近于微芯片定位的磁体，使得磁场施加在微芯片的腔室内，就可实施珠粒的捕捉。图12和图13中显示的是大容量(500nL)MOVe阀，其可用来泵送和捕捉珠粒。珠粒的捕捉显示为插入在捕捉珠粒床内。如图13所示，磁体1103定位在微芯片的阀1101上。由于磁体施加的磁场作用，可通过流体通道1111和1107流入或流出阀的珠粒，对着阀壁而被捕捉。通过气动通道1109可致动阀，其可输送相对于阀流体腔室的正压或负压，导致阀的弹性体层上升或下降。

微芯片上一微升的反应已经成功地进行，有良好的信号强度和相对良好的位置平衡。图17示出在微芯片上使用一微升进行反应的反应结果，以及与等价的微芯片外反应和仅含有尺寸标准的无模板控制(NTC)作比较。峰表示探测到核苷酸基对。

珠粒上反应产物的纯化

在一实施例中，使用施加到试剂连接结构5的真空，使微型阀200和130打开，令路径通过201、212、211至连接点210和通道19和9连接到腔室3，通过131、141和140连接到反应通道250，则珠粒上的反应产物可移到筒1内。微芯片500上的微型阀可调制真空和流动。反应产物可移到腔室3内，腔室可用如上所述清洗过的珠粒加载到位。

使用珠粒纯化、免疫磁性分离、与珠粒的反应、毫微颗粒、量子点或其它类型的颗粒，利用亲合力或本技术领域内技术人员公知的其它互相作用力，珠粒可捕捉许多类型的生物分子。

继续该STR实例，在STR扩增完成之后，反应产物使用真空传输回到筒1。在注射之前，使用用于DNA与口腔拭子隔离的装置上的同样的Orapure磁性珠粒，使扩增的STR产物被纯化、脱盐和集中。此时，珠粒仅用于乙醇；没有使用如前所述的用于拭子萃取的PEG/NaCl溶液。

珠粒加载到立方体混合腔室内，用70％的乙醇捕捉和清洗珠粒。然后，从循环区域将5-10μL的STR反应拉回到腔室内，并拉回到与珠粒接触。电泳缓冲剂(因为在分离子系统上的可供性而选定)的20μL跟踪溶液被拉通过以清除反应通道内任何剩余的STR反应溶液，添加100％乙醇以使溶液达到95％总浓度的乙醇。

图19示出在拭子萃取器上以此方式准备标准材料并在MegaBACE上进行分析的数据。产物在构造为拭子萃取器的试样准备装置中使用筒1用Orapure珠粒清洗，并与使用手工准备的已用CleanSeq(安进科公司(Agencourt))处理过的控制器清洗的产物相比较。与脱开装置进行的相同过程比较，观察到约～60％的复原。应该指出的是，清洗过拭子萃取器的材料得出比普通使用过程更有效的注射，该过程将试样稀释到1∶50至1∶100。

在另一实施例中，后扩增的STR清洗装置将STR反应预混合物输送到热循环器；在隔离的DNA珠粒捕捉过程中计量试样；在STR扩增产物上进行珠粒清洗；将洗脱的产物输送到阴极；以及在准备分离和探测装置和试样注射过程中将试剂提供到阴极组件。

四通道后扩增STR清洗装置组合了图47所示的微芯片ChipA与放大的流体集管，该集管带有清洗腔室(图71)并安装在气动控制集管上(图72)。安进科公司(Agencourt)的CleanSeq珠粒被输送到清洗腔室，试样通过反应管子250从热循环器泵送到清洗腔室，并添加乙醇。通过空气发泡来混合试样，以便于将DNA捕捉到珠粒上。在装置的底部处致动磁体，致使DNA和珠粒被捕捉在清洗腔室的底部；然后，将剩余的液体泵送到废液中。磁体移动离开装置，甲酰胺溶液中含有荧光标签DNA尺寸标准的洗脱液被泵送到清洗腔室内。STR扩增产物在该溶液中被洗脱，在纯化和富集试样和尺寸标准泵送到阴极之前，磁体再次被致动而捕捉珠粒，准备注射到分离毛细管内。

使用Chip A来测试后扩增装置，突出了因该微芯片的试剂通道内高的阻力而引导和泵送乙醇通过微芯片Chip A的问题。微芯片设计，即Chip E(图73)，通过加宽通道和用一对MOVe微型阀来代替三通MOVe路由器，显著地改进了后扩增装置的功能和强度。

实例2：通用试样准备

前一实例说明了一个实施例，其中，所公开的装置可用来准备用于分析的试样，并显示了STR扩增的一个实例。另一实施例涉及通用试样准备模块(USPM)的使用。USPM装置可包括试样处理筒1，伴有操作筒的装置，微处理器以及可容易地与下游分析装置接口的软件。在一实施例中，USPM可与分析装置紧密地集成在一起以形成模块化的试样-结果系统。筒可构造成可丢弃的一次性使用的装置，该装置可处理拭子或液体(包括浮质试样)以用于现场监视过程，或者可构造成重复使用的流动格式，以用于稀有阳性的远距离操作。利用附连到顺磁性珠粒上的特殊抗体(其连接选定的目标)，可赋予USPM的目标特异性；不同筒可提供给各种目标的混合物。

USPM可使用多步骤的完全自动的过程来对下游分析准备生物试样。图18中的一个实例可使用拭子或液体；操作者可选择试样类型，然后将试样插入输入端口内。第一步骤可应用免疫磁性分离(IMS)来捕捉、集中和纯化来自溶液的目标分子，并纯化到顺磁性珠粒上。已经测试过的目标包括细胞、孢子、病毒、蛋白质或毒素。对于毒素和蛋白质的检测，或对于用作触发装置，从IMS捕捉到的目标可直接输出到下游分析装置。对于核酸检测，第二步骤可使用机械或其它裂解技术来裂解细胞或孢子以释放DNA和/或RNA。第三步骤即核酸纯化步骤可吸收、集中和纯化核酸到第二组的顺磁性珠粒上，并输出带有核酸的珠粒，或纯化的释放出的核酸，以用于下游的分析。

参照筒1，免疫磁性分离可使用试剂珠粒来实施，试剂珠粒具有抗体或其它免疫磁性、亲合力磁性或表面化学测性分离。例如，带有抗体的免疫磁性珠粒可添加到筒1，以捕捉、纯化和集中细胞、病毒、孢子、毒素和其它在珠粒上的生物分子。

用于USPM的上游试样处理可在试样准备装置内进行，其可在微流体筒1内处理0.6mL以上的试样(图21)。研制出约为1立方英寸尺寸的试样处理筒(图3、图21)，自动地从拭子中除去采集到的口腔细胞，裂解细胞，纯化磁性珠粒上释放的细胞DNA。珠粒床通常为100nL，并可用微流体装置或全尺寸qPCR反应来用于下游STR分析。

试样准备装置使用一与立方体底部接口的MOVe微型阀微芯片(图3，标以2的箭头)以引导压力驱动的流动，该流动包括流体、珠粒和试剂和反应容器中的试样。MOVe微型阀替代了传统阀和容器之间的管子，由此，提供不泄露的定向的流体运输，并能使全部立方体和试样准备装置小型化。

该试样准备装置技术已用于从如上所述的口腔拭子中自动地萃取DNA。图10示出在自动试样准备装置内使用压力驱动流动、振动混合、MOVe阀、致动的磁体和磁性珠粒来从25μl血样中自动地准备DNA。全自动过程在不到5分钟时间内产生准备用于STR分析的DNA。

我们开发了自动化系统，其使用涂敷有专用于所感兴趣目标的抗体的磁性珠粒，来从液体试样(1-10mL)中捕捉、集中和纯化细胞、病毒和毒素。因此，各种目标已经用该自动化系统被集中和纯化。使用该方法，E.coli细胞在低至15细胞/mL/试样的细胞浓度下被捕捉和探测(图27)。使用Bacillus孢子、Gm⁺和Gm^-蔬菜细胞、模型病毒(抗菌素fd)、SEB和卵清蛋白作为目标，获得大于90％捕获效率的类似结果。纯化试样可在试样准备装置内进一步处理(例如，裂解和核酸纯化)，并被移动到微芯片上以作分析，或用于芯片外的PCR/qPCR装置。

我们已经显示了IMS捕捉在诸如浮质的复杂试样中和在生物学杂乱存在之中工作得很好(参见美国专利出版物20080014576，本文以参见方式引入其全部内容)。对于生物学杂乱，我们已指出，高达10⁵倍率水平的添加细菌，仅产生两倍的捕捉效率的降低。对于复杂试样，使用许多不同的浮质试样进行的添加实验建立起这样的结果：浮质试样将B.cereus孢子对IMS珠粒的粘结力减小到小于50％。因此，复杂、真实世界中试样内的灵敏度损失小于一半。

我们使用IMS来捕捉、集中和探测毒素。我们已开发出IMS化验用于卵清蛋白和SEB、多元化验，并开发出使IMS化验自动化的两代完全集成的微流体系统。1mL试样中可以可靠地探测到不到10ng的SEB，不干扰紧密相关的Staphylococcal肠毒素。

我们已经显示出，IMS可以：

·在高干扰背景下从试样中选择目标有机物(选择性)，

·区别两种不同张力或细菌种类(特殊性)，

·从宽范围试样内在很大范围的浓度中有效地捕捉细胞和毒素(灵敏度、强度)

·从mL至nL体积显著地减小目标试样体积。

本发明及其装置和方法能够实施IMS并将其连接到核酸萃取中。

USPM中的下一步骤是：当目标是细胞、病毒、朊病毒或孢子时，裂解捕捉到的目标。裂解孢子特别有挑战性。已经开发出MagMill或磁性驱动的裂解或均质装置，来有效地裂解Bacillus和其它孢子以及蔬菜细胞。MagMill由通过电动机2001(图74)致动的快速转动的磁体2000组成，磁体2000驱动装在含有试样的容器2003或隔间(图75)内的另一磁体2002的转动。装在含有试样的容器内的磁体2002可具有任何形状。例如，磁体可具有杆、球、圆柱、矩形、卵形、六角形，或推进器形状。或者，磁体可具有通孔，使得液体可被强制通过孔，当磁体通过磁场转动时可提高施加到试样上的剪力。同样基本的部件可小型化、纳入到微流体的格式中，或连接到微流体格式。总的效果类似于磁性搅动板，使得试样在试样管中快速地呈漩涡。使用由MagMill处理器致动的磁性驱动的试样搅动，可实现孢子裂解而无需硅石、氧化锆或其它珠粒。当孢子通过磁体和容器壁之间时，通过产生的剪力可实现裂解。磁体可以大于约10、50、100、150、200、250、500、750、1000、1500、2000、2500、5000或10000rpm的转速转动。

该装置以与使用硅石/氧化锆珠粒(图76)的传统珠粒击打方式相同的效率来粉碎孢子。孢子(3.2×10⁷)裂解在1ml体积中，其活力由在胰蛋白酶大豆琼脂(Tryptic Soy Agar)上的电镀来确定；结果是两个单独实验的平均值，各实验以双份试样进行(总数n＝4)。与使用96％的氧化锆/硅石或80％的硅石珠粒的传统珠粒击打裂解产物(BioSpec击打器)相比，磁性驱动的孢子裂解产物的非活力为93％。同样的型式由qPCR确认。

使用MagMill的优点(相对于传统的珠粒击打)在于，机械方面的设计更加结实，因此能够承受多次使用循环而不坏，使用磁体在试样中的搅动就可裂解试样，而无需纳入硅石/氧化锆珠粒，这些珠粒已经显现出粘结释放的DNA，造成后继检测灵敏度的丢失。MagMill的基本特征可在集成到试样准备装置内的小型化格式中重构建。系统可能尺寸做小来配合微流体微芯片。尽管结构上有变化，但驱动裂解的原理(快速转动试样内的磁体)保持不变。

实例3：库结构的试样准备

筒1技术和试样准备装置还可进一步用来在带有珠粒基操纵的DNA试样的小体积中执行一系列复杂分子生物反应。DNA可被处理而准备基因组库，以用于下一代的测序系统(即，Roche 454系统，或应用生物系统公司(AppliedBiosystems)的SOLiD系统)、实时PCR或其它DNA化验系统。

通过纳入逆转录步骤，用基本上相同的方法，RNA库也可转换到DNA库。建立RNA库的优点在于，最后扩增库中的表现形式将直接镜像反映原始开始的材料，这是因为扩增将基于单一分子扩增。

库构造模块(LCM)的设计理念是一种固定大量试剂并提供流体控制的手段，所述流体控制是针对处理个别库的小量处置的库构造模块(LCM)筒。LCM手段可通过DevLink软件控制在LCM筒中的流体流动、混合、温度和珠粒操纵。储存在温度控制容器内的一阵列的试剂可通过MOVe阀块(由计算机指令的气动装置致动)进入。由单一分子产生带有附连扩增的DNA的珠粒的工作流动显示在图29中。库构造模块(LCM)使用筒作为优选的实施方式。

MOVe阀与传统阀相比极其耐用、紧凑和廉价，其具有约10nL的死体积，且与低至100nL的分配体积相兼容。该方法可使用压力驱动的流动，通过MOVe阀块从试剂容器中移动流体到LCM处置的筒内的反应腔室，并流出到最终试样输出容器(图25)。可使用加压流动、振动混合和气动驱动的MOVe阀，使试剂和基底在试样准备装置内混合；使用DevLink控制的致动磁体可捕捉和释放磁性珠粒。

每个可处置的LCM筒可包含嵌入的MOVe阀(图28)。MOVe阀引导来自试剂容器的流体，并连接三个反应腔室。一个腔室即处理腔室A可实施顺序溶解基的分子生物反应。第二个即纯化腔室B可对中间产物的珠粒基执行纯化。第三个即退火腔室C可对玻璃珠粒执行最后的退火。退火腔室可包括过滤器，用来使珠粒与周围溶液分离。气动管路(P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7和P8)可控制微芯片的阀，所述阀可控制和/或强制流体流动到腔室。

通过MOVe阀的压力驱动的流动可在腔室之间移动流体。处理腔室和退火腔室可混合内容物并包括热控制。

下一部分中，作为实例将描述使用LCM准备DNA库试样的工作流程。容易看到，RNA库可在逆转录步骤之后作准备。

演示前述emPCR的微流体的反应

用于库构造模块的起始输入可以是雾化、剪碎的DNA，其已成为800-1000bp大小的碎片并被纯化，已移去了小的碎片(＜500bp)。也可在LCM上有选择地粘结到磁性珠粒，例如，AMPure(安进科公司(Agencourt))，来实现尺寸的碎花。输入DNA可在BioAnalyzer2100(安捷伦公司(Agilent))上通过染色粘结(Pico-Green，Quant-it，Invitrogen)对大小和浓度进行评价。反应顺序示意地显示在图29中的库构造模块方块内。

碎片端抛光

在一实施例中，DNA雾化产生碎片，其优势是在操纵可进一步发生之前(Bankier1987)，磨损的端部需要填入/端部弄钝。还需要5’氢氧基终端进行磷酸化，用于其后的适配器的绑扎。这可通过T4DNA聚合酶和T4多(聚)核苷酸激酶的一系列活动来实现。基底可与反应缓冲剂、BSA、ATP、dNTP组合，两种酶取少量的反应体积，起初为25uL，首先在12摄氏度下培育15分钟，然后，在25摄氏度下培育15分钟。温度控制可通过安装在硬仪器接口上的珀耳帖装置来实现。抛光反应的控制可依赖于荧光标签的dNTP的引入，化验使用荧光成像和量化或使用放射性标签的dNTP。

微流体的基于珠粒的纯化

抛光之后，通过在珠粒上沉积来纯化碎片。LCM仪器可将流体移动到LCM筒(见图28)，以强迫DNA到珠粒上，致动磁体将珠粒集中在纯化腔的壁上，然后清洗珠粒。根据需要DNA可从珠粒中洗脱，DNA可移动到处理腔室A，丢弃珠粒或将珠粒移动到另一腔室作进一步处理。该方法可在整个过程中反复使用多次。因此柱基的纯化被珠粒基的纯化替代。试样准备装置常规地纯化筒中的DNA，其使用分别用于DNA测序、法医和生物防御应用的磁性SPRI珠粒(安进科生物科学公司(Agencourt Biosciences))、DNA IQ(普洛麦格公司(Promega))，以及羧酸盐珠粒(英杰公司(Invitrogen))。纯化的产物可在BioAnalyzer(安捷伦公司(Agilent))上进行化验，并采用染料连接法(Pico-Green、Quant-it、Invitrogen)。

适配器的绑扎

接下来，适配器绑扎到纯化DNA上。纯化腔室内的DNA可首先从珠粒洗脱到绑扎缓冲剂，缓冲剂通过压力驱动的流动移动到反应腔室，以及添加适配器和连接酶。适配器可含有嵌套的PCR和测序引物部位、钝的3’端和5’突出物；每对中的一个适配器可在5’端上具有一个生物素。每个适配器可包括用来识别试样的核苷酸基和处理步骤的“键”，以及用来辅助基部调用(base-calling)的“测序键”。绑扎和进一步选择可为碎片在每一端上选定不同的适配器(一个带有生物素，一个不带)。此时在连接到链霉胍珠粒之前，绑扎产物又可需要在纯化腔室内的珠粒上被纯化，将库移回到处理腔室。

绑扎可用诸如快速连接酶(新英格兰生物实验室公司(New EnglandBiolabs))的连接酶、缓冲剂和适配器来实施，并在25摄氏度下培育15分钟。使用PCR引物部位和对于探针的5’测序引物部位，可对Q-PCR的适配器绑扎化验产物。比较起始材料量和相应步骤之后的产量，可计算出目标的绑扎和复原的效率。还有，通过生物素-链霉胍连接，可将适配器预连接到顺磁性珠粒，这导致珠粒连接的碎片可经受第二轮的与第二适配器的绑扎。该方法可防止产生不带有生物素适配器的碎片和带有两个生物素适配器的碎片，在处理过程中这两者都被丢失。这可显著地改进最后的模板产量。在绑扎之后，产物又被珠粒纯化。

库的停止流通

在库连接缓冲剂内再悬浮的预洗过的涂敷链霉胍的珠粒可从试剂容器添加到纯化绑扎反应产物，产物已经移回到处理腔室并用RT处的混合培育20分钟。然后，材料是在纯化腔室内的链霉胍珠粒上的纯化过的珠粒，以除去适配器的二聚物。

缺口修补

绑扎导致3’的缺口，其可用Bst DNA聚合酶(大碎片)进行修补。填充缓冲剂和dNTP可直接添加到珠粒，并在65摄氏度下培育30分钟。然后，珠粒可在纯化腔室内纯化。

u

25uL的预混合Melt溶液(125mM NaOH)可直接添加而在纯化腔室内清洗珠粒、混合，使用磁体来球化珠粒，以及移动到处理腔室的生成的表面飘浮物，腔室内可添加62.5uL的中性溶液(0.15％醋酸)。用变性剂对珠粒进行第二轮处理，导致总体积为113uL的单链模板。它们在10uL体积内洗脱之前又被纯化。

输入材料的自动化、上游标准化，或使用限量的珠粒，是可大大地辅助库均匀生产和扩增的各种步骤，这可导致免除此时对质量的检查。

在一实施例中，进行连续的质量评估和功能量化。如果需要的话，使用安捷伦(Agilent)2100Bioanalyzer可离线评估SS库的质量，Bioanalyzer可提供碎片的尺寸范围；还可用Q-PCR或染料粘结(RiboGreen、Quant-iT、Invitrogen)来评估产量。通过形成稀释系列、实施乳化的PCR(emPCR)和焦磷酸测序，还可进一步功能地测试库，以对emPCR确定工作稀释度。自动的碎片分离也可被包括在装置内。

粘结而捕捉珠粒

前面步骤中准备的SS DNA可被退火到控制的微孔玻璃(CPG)或苯乙烯珠粒，使粘结的DNA捕捉的引物与绑扎的适配器的端部互补。处理诸如所述的非磁性的珠粒，可需要使用泵送的过滤技术(避免使用离心法)。因为所用试剂可纯化任何的颗粒，珠粒可使用库尔特计数器(Coulter Counter)(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter))进行预清洗和量化，过滤器的堵塞不是一个问题。

珠粒可添加到模板库，现为单链，并混合而有利于退火腔室内单一模板/杂交溶液中珠粒的退火。起初，珠粒-模板混合物可被分为可整除的份数，以备其后的乳化发生，以及在标准热循环器内从80摄氏度保持10摄氏度间隔地梯度下降进行退火。温度梯度能力也可被包括在LCM装置内。过滤的再悬浮(即，清洗过的珠粒)可用回洗过滤器来实现。SS库的杂交可通过在珠粒杂交之前或之后对Q-PCR的悬浮物内未杂交的SS DNA的化验来进行评估。在此处理阶段，珠粒上的单链模板可被传输到emPCR生产模块或作进一步处理的类似装置。

实例4：连接试样准备装置和微芯片基的试样清洗和分离

图34和图35示出带有筒2907和微芯片2901的装置，该装置设计成包括如图32所示的叉形注射器设计，以及凝胶填充集管2903和相关的部件。筒流体地连接到气动集管和管子2905。可测试注射器设计、分离通道长度和分离聚合物的不同结构。图36示出使用叉形阴极注射器在微芯片通道上进行轨道注射和分离的M13T的电泳图，以及在共焦距的微芯片电路试验板系统上的试样探测。试样均匀地用同样表示的短和长DNA碎片进行注射。结果表明M13轨道DNA阶梯可均匀地注射，而单一基的成对分解可在不到20分钟时间内获得大约330基础对。与使用传统双T设计的注射相比，可获得较高试样信号强度。当与探测系统集成时，微芯片保持在恒定50℃下，以获得良好分解率的分离。

使用这些过程，对于MOVe集成的场扩增堆叠的液体试样的注射可获得良好的结果(图37)。该数据用所有试样的加载、操纵和注射过程来产生，这些过程使用MOVe微型阀在软件控制之下实施。数据已经最小化地处理，从使用八个二极管通道到四个染料轨道的探测器中纠正颜色。

一个组合了叉形阴极和MOVe试样准备装置的微芯片的实施例显示在图38中。该装置包括附加的过程，这些过程能与其余的系统集成，即，试样准备装置(图22中所示的1000)、反应通道(图6中所示的250)以及如STR实例中所述的STR纯化的输出。图38示出带有MOVe流体的叉形阴极和用于与后扩增的STR纯化系统集成的穿梭试样加载。这些部分是：1-试剂输入端口，2-试剂泵头，3-试样输入端口，4-规格标准/洗脱输入端口，5-捕捉阀，6-废液端口，7-洗脱阀，8-废试样端口，9-阴极，10-阴极端口，11-试样阀，12-试样端口，以及13-分离通道。位于通道下游的阳极端口未予示出。

引入待分离的试样作为乙醇中的珠粒溶液。这可以是如上所述地珠粒输出上的纯化反应产物。在一实施例中，试样是STR反应。在其它实施例中，试样可以是由其它反应化学品产生的不同长度的核酸碎片，化学品包括由桑格化学测序的DNA。含有试样的溶液从试样输入端口流到废试样端口，使捕捉阀和其它干预阀都打开。打开的捕捉阀便于减慢流体流动和被放置在阀上方或下方的固定磁体捕捉的珠粒。乙醇溶液完全地流动通过系统，其后被空气通过，得到相对干的和清洁的珠粒床，阀内使纯化的产品。此时，阀关闭和重打开(与其它阀相协调)，以从相关端口中填充洗脱溶液。对于STR分析和需要内部尺寸标准化的其它分析来说，洗脱可包含尺寸的标准化。溶液在洗脱阀和捕捉阀之间移动，以便于在洗脱阀内与溶液混合、结束。试样阀然后与洗脱阀协调地打开，所述洗脱阀关闭而使试样“穿梭”通过试样通道，让通道被填充。试样FASS注射可按如上所述地进行。该装置另外附加的值得注意的功能是：在一实施例中，试剂输入端口和试剂泵被用来提供计量的STR反应预混合物，将预混合物提供到试样准备装置上的拭子萃取DNA之后的反应通道(图6中所示的250)；在其它实施例中，装置可提供诸如循环的顺序混合物的其它核酸反应试剂，或提供PCR试剂以实施PCR扩增，其后提供循环测序试剂来实施如需要集成的珠粒基清洁反应的循环序列。其它化学过程将为本技术领域内技术人员所明白。

实例5：集成的核酸隔离、扩增、分离和探测系统

带有筒和热调节装置的试样准备装置可集成到下游探测系统中，以形成一个试样一结果的全集成系统。该系统可做成紧凑的格式，该格式可与实验室、诊所和现场操作兼容，如图39所示，做成为工作台上装置或便携式的装置。图39示出一个使用五个通道拭子萃取组件800来萃取拭子或其它材料的系统实施例，其使用筒1来纯化来自输入的口腔拭子、液态、固体和其它材料的核酸。珠粒上的纯化的核酸是在热循环模块400内扩增的PCR。在一实施例中，试样是在拭子萃取组件800中纯化的珠粒，其使用筒1来纯化理想的产物到珠粒上。珠粒移动到分离和探测模块900，以接纳珠粒上的产物、洗脱试样和将其分离，其使用毛细管电泳或微芯片毛细管电泳或其它分离方法，以及诸如激光诱导的荧光性或质量光谱学的探测方法。对于毛细管电泳或微芯片毛细管电泳来说，凝胶注射模块850泵送分离基体或凝胶或其它材料，以提供分离的柱和再生它们。在另一实施例中，如果分离是HPLC或其它液体套色版方法，则凝胶注射模块850可泵送套色版介质。电子和电源模块860提供控制和电源功能。气动模块870提供调节过的空气和真空来操作拭子萃取组件800。试剂储存在试剂容器880内。试剂可以储存在溶液或诸如准备就绪(GE医疗保健公司(GE Healthcare))和冻干形式的脱水或稳定形式中。

在一实施例中，系统构造成执行口腔拭子的STR分析。口腔拭子在组件800中萃取，并使用用于STR扩增的试剂在热循环模块400内扩增。扩增的试样使用珠粒上的核酸萃取物进行纯化，例如可使用Orapure或DNA IQ化学品和珠粒。珠粒上纯化的STR产物然后移动到分离和探测模块900，珠粒被捕捉和DNA被洗脱，最好在带有MOVe微型阀的微芯片上进行。然后，试样较佳地注射到微芯片上的叉形阴极注射器，或注射到偶联在微芯片上的毛细管电泳的毛细管上，其使用毛细管凝胶电泳分离和诸如动态涂敷凝胶的凝胶、V2E(GE医疗保健公司(GE Healthcare))、聚二甲基丙烯酰胺、POP基体族(应用生物系统公司(Applied Biosystem))、羟甲基纤维素、瓜林(guarin)以及线性聚丙烯酰胺。带有荧光标签的探测过的产物通过激光诱导荧光性探测器，该探测器探测产物通过时的峰值。

在另一实施例中，系统构造成以集成的DNA测序器。试样在组件800中萃取，萃取的试样在热循环模块400中使用用于PCR扩增的试剂进行扩增。DNA萃取物可以是非专用的，其使用诸如Orapure(安进科公司(Agencourt))的珠粒基纯化方法，或可使用杂交或其它方法来从输入试样中选择一个或多个区域以产生不复杂的试样。本技术领域内的技术人员将会认识到，带有IMS的USPM工作流后跟核酸的纯化，该工作流可适用于试样准备装置800，拭子萃取被许多其它的初始纯化工作流所替代。PCR扩增可以是单一区域或对于目标多区域是多元的。扩增的PCR试样使用在珠粒上的核酸萃取来进行纯化，例如，使用Orapure或DNA IQ化学品和珠粒。珠粒上纯化的PCR产物然后可移动到热循环模块400，添加循环测序的主混合物，并使试样循环测序化。这可以用荧光标签或作为四组非标签的引物，其用于通过UV或其它方法的无标签的探测。然后，循环测序的试样移动到组件800和纯化过的珠粒，以移走不希望的离子和标签以及其它材料。然后，珠粒移动到分离和探测模块900，珠粒被捕捉和DNA被洗脱，最好在带有MOVe微型阀的微芯片上进行或进入到毛细管内。试样然后较佳地注射到叉形阴极注射器内，其在微芯片上或偶联到微芯片上的毛细管电泳的毛细管上，并使用带有凝胶的毛细管凝胶电泳分离和诸如动态涂敷凝胶的凝胶、V2E(GE医疗保健公司(GE Healthcare))、聚二甲基丙烯酰胺、POP基体族(应用生物系统公司(Applied Biosystem))、羟甲基纤维素、瓜林(guarin)以及线性聚丙烯酰胺。带有荧光标签的探测过的产物通过激光诱导荧光性探测器，该探测器探测产物通过时的峰值。

在其它实施例中，实施蛋白质、碳水化合物或其它化验物的化验，并用质量分光镜、成像、HPLC、GC，或本技术领域内技术人员公知的任何其它分析方法进行检测。

对于DNA，处理过的试样可通过以下方法扩增：PCR、滚动圆周、平衡的DNA、EXPAR，以及本技术领域内技术人员公知的其它DNA扩增方法，或通过质量分光镜或单一分子探测方法。RNA可用逆转录酶实时-PCR进行处理，或为DNA微阵列准备的试样，或其它分析方法。实时或终点分析可用装置来实施。对于蛋白质，化验可在筒内进行，包括酶化验、夹心免疫化验、抗体沉积、蛋白质消化、蛋白质和缩氨酸标签，以及其它普通使用的蛋白质分析方法。同样地，其它细胞组分或化学物可使用标准方法在装置内进行萃取或纯化。分子生物方法容易适用于该装置。试样可在单一筒内的装置上被完全地分析，可被移动到单独的筒，或在单独一起中作分析或进一步处理，其包括毛细管电泳系统或微芯片的毛细管电泳；多维凝胶和毛细管电泳；质量分光镜、带有HPLC、ICP多维质量分光镜、Raman分光镜、颗粒、毫微颗粒，以及珠粒基的探测、成像，包括有荧光、IR、光学的，或本技术领域内技术人员公知的任何其它分析系统。

对于DNA测序、碎片定尺寸以及法医，传授了以下做法：包括筒的完全试样一结果的仪器的集成，用来从许多输入和试样类型和微芯片基的毛细管电泳装置来准备DNA，以分离DNA碎片。

实例6：带有四个处理通道的装置

微芯片或微流体微芯片可用来扩增mRNA、集中磁性珠粒上的核酸，以及将纯化的试样注射到电泳分离毛细管内。如图45和图46所示，微芯片505可与筒503和气动集管507接口。图45示出微芯片、筒和气动集管的扩展图。图46示出筒与微芯片接口的视图，微芯片又与气动集管接口。筒可完全地覆盖微芯片的表面。此外，块体501具有多个孔509，它们将帮助保持培育材料被输送到筒503的端口511或从其中输送出来。块体可以是加热块或温度控制块。孔509可用来固定移液管末端或用作大体积的反应器或处理器。块体509可被加热或冷却来控制被输送到筒和从筒和微芯片中取出的材料温度。块体可以与筒热接触。筒的端口可通向容器，容器流体地连接到与微芯片505上的端口515匹配的端口。微芯片505可具有与气动集管的端口517匹配的气动管路端口519。气动集管的端口可具有O形环的垫圈，其将气动集管密封到微芯片，允许输送高和低的压力而无泄漏，或减少压力或真空的损失。筒、微芯片和气动集管可使用螺栓或其它紧固物件固定在一起，所述紧固物件穿过筒和气动集管的孔513、501。

微芯片Chip A的示意图显示在图47中。微芯片包括三层：(i)承载流体通道和井的顶部流体层(例如，玻璃)，(ii)承载气动通道和井的底部气动层(例如，玻璃)，以及(iii)中间柔性薄膜(例如，250um厚，PDMS层)(未示出)。PDMS薄膜可以是无特色的。PDMS薄膜可响应于施加到由气动通道系统形成的局部区域(图47中虚线)上的正压或负压而挠曲。气动和流体通道的蚀刻深度通常为50um，并可设计成提供最小的水力阻力。微流体系统内的阀可包括泵阀。泵阀可以大于其它阀，根据要求的泵容量而定，并可缺乏阀座。除去阀座可增大泵送容量，或增大泵每个行程所泵送的流体体积。其它的阀可以较小并具有阀座，阀座允许阀牢固地关闭。如此减小体积的开/关阀可减小微流体微芯片内的总的空隙空间。入口阀和出口阀可以是如此的开/关阀。

如图47所示，微芯片具有四个相同的处理通道，对于微芯片外或微芯片内的磁性珠粒基核酸集中和毛细管电泳试样注射，每个通道可控制试剂流动。四个处理通道由共有的“试剂轨道”馈送，其可从四个输入井(第五井可用作废液端口)选择输入试剂。个别的试样可从专用通道试样井被馈送到各个处理通道内，并可平行地处理(所示微芯片是4丛处理装置)。每个处理通道可具有0.8μL的泵、试样输入井、两个输出井和一个废液井。诸如磁性珠粒的珠粒可被捕捉在任何的井内，例如，一个或两个输出井。该输出井可与筒或流体集管接口。

微芯片Chip A的照片显示在图48中。微芯片可安装在顶部流体集管和底部气动集管之间，前者匹配于通向微芯片顶表面上的井的流体容器，而后者匹配于通过O形环密封通向微芯片底表面上的井的气动控制管路。微型阀和泵可由一气动控制系统致动，该系统由诸如DevLink数据或其它软件的计算机数据驱动。该系统可供应正压(约为+10psi)来关闭阀，和/或负压(约为-20psi或真空)来打开阀。相同的气动系统可操作微芯片泵，作用负压来填充泵体(在弹性体层的流体通道一侧上)，而作用正压来放空泵体。如本文中所述，泵送作用依赖于泵和侧腹入口阀和出口阀的协作作用。

实例7：使用带有四个处理通道的装置的mRNA扩增

ChipA用来实施Eberwine方案的第一逆转录反应。开发了有效的混合和培育方法。

为了提供对大约10ul反应提供温度控制，制造带有八个200ul移液管末端的简单加热铝块509，并匹配到如图45、图46和图49所示的流体集管。每个移液管末端连接到微芯片输出。在实验中，实际上仅使用了4个连接到微芯片输出-1井(如图47所示)的末端。用粘结剂附连到块体外表面上的薄膜加热器来实现加热(50℃)。热电偶插入到块体中心内，用DevLink PID控制回路来控制加热器。

对于混合，开发DevLink指令，通过交替地从各个相应容器中泵送约0.6ul试样到与输出-1匹配的移液管末端，来按1∶1比例混合试样和试剂。用食品染料进行的实验证实了交替地泵送有效地混合了末端内的两种组分。

为了实施反应，全部的RNA和T7助推引物(水中)的混合物用移液管滴入试样井容器内，而含有Superscript III逆转录酶的双倍浓度的RT混合物用移液管滴入试剂容器内。在15ul加载到末端(12泵循环)后，指令终止，反应继续在50℃下培育15分钟。此时，移去末端，放空到0.2ml PCR管，通过在热循环器内在85℃下培育5分钟而终止反应。

除了完全在工作台上实施并在热循环器内在50℃下培育15分钟的这些反应之外，可同样地处理正向控制反应。负向控制反应可(在工作台上)混合并通过在85℃下培育5分钟立即终止。

使用Gusb引物和探针组(ABI)，TaqMan实时量化PCR可分析各种反应。对于含有大约500ng总RNA(Rat Liver)和10U/μL Superscript III RT的15μL反应的结果显示在图50中。显示取自通道1-4的结果，结果为完全在由iK表示的台上所实施结果。在图50中，成对的条显示为对于每个通道1、2、3、4，而iK代表复制的反应。这些结果显示，微芯片和台上反应在其第一链Gusb c DNA的产量上是相同的。两个反应产生介于26和27之间的Ct。负向控制反应产生Ct＞35(数据未示出)。

实例8：带有珠粒清洗腔室的装置

微芯片和微流体微芯片可用来扩增mRNA，用来集中和纯化磁性珠粒上的核酸。图51示出具有微芯片1307的装置的展开图，该微芯片可与由两片1313、1315制成的筒和气动集管1301接口。筒由具有蜿蜒通道1311、井、容器和腔室的第一片和具有井和腔室的第二片1315制成。蜿蜒的通道可用来提高热分配片和包含在蜿蜒通道内的流体之间的热传递。第二片和第一片可以粘结在一起，使得蜿蜒通道在顶侧上封闭。筒可以重叠或与热分配片1317热接触，该热分配片1317从热控制块1323、1321分配热量。热控制块可以是热电的冷却器(TECs或珀耳帖装置)、薄膜加热器，或其它热控制装置。热分配片和热块可以粘结或不粘结或固定到筒上。螺钉、螺栓，和/或铰链可便于将热分配片和/或热块固定到筒上。图52示出与微芯片接口的筒的视图，该微芯片又与气动集管接口。气动块可具有用于螺栓和/或螺钉和端口1303的环形空间1305、1309，所述端口1303接口在气动管路和微流体微芯片的气动层之间。气动层的附加视图显示在图53、图54、图55和图56中。图53和图55示出用虚线表示图中隐匿不见的边缘。图53和图54示出气动层的三维图。图55和图56示出气动层的俯视图。

图57和图58示出微流体微芯片、微芯片Chip B以及珠粒清洗腔室的示意图。现参照图58，微芯片具有四个主要部分：试剂轨道、珠粒轨道、处理器1和处理器2。两个轨道和两个处理器具有镜面对称的几何特性。微芯片构造成任何的试剂轨道可馈送到任一处理器。用于顶部处理器的阀V_r和V_b和用于底部处理器的阀V_rb和V_bb控制着处理器的进入。在顶部处理器的试剂处理和酶反应过程中，阀V_r打开和V_b关闭。在底部处理器的试剂处理和酶反应过程中，阀V_rb打开和V_bb关闭。在清洗过程中，反向地应用，即，对于顶部处理器来说，阀V_r关闭和V_b打开，而对于底部处理器来说，阀V_rb关闭和V_bb打开。可以看到，顶部和底部处理器可以平行地或分开地进行操作。试剂和珠粒轨道的设计紧密地跟从ChipA的设计。每个轨道可分别通过阀V_r1-4和V_b1-4进入四个不同的试剂R1-4和B1-4，每个轨道具有废井RW和BW，可分别通过阀Vrw和Vbw进入。每个处理器具有一试样输入井S、两个输出井Oa、Ob，以及珠粒侧通道，可分别通过阀Vs、Voa、Vob、Vbs进入。珠粒侧通道分别具有珠粒容器R和进入废井W和洗脱井E的两个阀Vw和Ve。用于阀控制的气动管路和端口在图57中用虚线示出。

为了以下的解释起见，假定处理器1和处理器2平行地同样进行操作，并假定Chip B是双元装置，可同时处理两个试样。为简明起见，只详述顶部处理器的操作。然而，非平行操作也是可能的。还假定井Oa和Ob连接到流体集管或管子内的合适容量的容器。容器可以是移液管末端、筒中的容器，或通过管子连接到较大的体积。微流体微芯片可具有75μm通道深度、250μm(最后)流体通道宽度，以及0.6μl(估计的)泵送行程体积。

参照图58，包括试剂1和试样的反应可通过交替4循环的泵送A、B、C、D组装在井Oa内。假定所有阀起初是关闭的。在循环A中，阀V_rl和V_r打开，允许泵P在向下行程中从井R1抽取试剂(施加到泵P的负压，打开阀)。在循环B中，阀V_rl和V_r关闭，阀V_oa打开，允许泵P在向上行程中将内容物(在此实例中从R1)排出到井Oa内(施加到泵P的正压，关闭阀)。在循环C中，阀V_s打开阀V_oa关闭，允许泵P在向下行程中从井S抽取试样。在循环D中，阀V_s关闭和V_oa打开，允许泵P在向上行程中将其内容物排入到井Oa内。这四个循环重复，直到足够的体积被压入到Oa内为止。试样和试剂之间的混合比由循环AB∶CD之比确定。在上述过程中，混合比为1∶1，但原则上可以是任何值。最后，通过用合适的阀替代V_r1，可使用类似的程序来混合任何的试剂(R1-4)和试样S。参照图58，在4循环泵中，在第一步骤中流体可沿第一方向从第一源井泵送到泵阀内的一空间。在第二步骤中，通过将流体从泵送阀移动到混合井，流体可沿与第一方向相对的方向泵送。可重复第三和第四步骤，使第二源井替代第一源井。沿相对方向的泵送可获得在混合井内的混合，这是让源井、混合井和泵送阀沿着通道定位而使泵送阀不位于源井和混合井之间的结果。该构造可减小微流体微芯片内的死空间，提高混合效率，改进试剂和试样处理的均匀性。同样地，该结构可通过合适阀的打开和关闭而允许一中心泵在微流体微芯片上的许多不同井之间移动液体。

图57和图58内所示的阀和这里所示的任何其它阀有时可放置成T形的连接。阀可关闭从T接头的一个通道到通向T接头的另两个通道的流动，而继续允许另两个通道之间的流动。例如，关闭阀V_oa可阻止流体从泵P流向Oa，但如果阀V_s为打开的，则不阻止流体从泵P流向S。或者，阀可阻碍通向T接头的所有通道之间的流动。这情况可适用于放置在接头4、5、6或更多通道处的各种阀。各种阀按需要可被仅用于试剂或珠粒通道内的阀所替代。

实例9：使用带有珠粒清洗腔室的装置的mRNA扩增

如上所述，Eberwine mRNA扩增程序是三个二元添加的一连串过程。为了执行Eberwine程序，R1含有RT混合物，R2含有2S(第二链)混合物，以及R3含有T7混合物，如图58所示。二倍(2X)体积的2S混合物可添加到RT反应，一倍体积的T7混合物可添加到2S反应，如图44所示。对于2S混合物添加来说，这要求2∶1的泵送比(AB∶CD)，对于T7混合物添加来说，要求1∶1的泵送比。

使用上述方法，可从井S和2X RT混合物、从井R1形成总RNA+引物的1∶1混合物的第一反应(RT)。在合适的培育时间之后，通过从井Oa(不是井S)中抽取，并从井R2(不是井R1)中抽取，第二链反应可在井Ob内组合。可使用一类似于以上实例8中所述的四循环的泵送方案A、B、C、D。在循环A中，阀V_r2而不是V_r1打开；在循环B中，阀V_ob而不是V_oa打开；在循环C中，阀V_oa而不是V_s打开；以及在循环D中，阀V_ob而不是V_oa打开。为了获得要求的2∶1，对于从Oa抽取的每个循环，两个循环可从R2内抽取。

在另一合适的培育时间之后，第三(T7)反应可在井Oa内以类似过程(从R3和Ob中抽取，1∶1比例)组合。因此，最后T7反应可驻留在Oa内。在合适培育时间之后，aRNA可准备作纯化。

纯化包括珠粒轨道而不是试剂轨道的操作。因此，在微芯片操作的该阶段过程中，阀V_r保持关闭，而V_b可打开。

为了纯化aRNA，容器R必须首先用磁性珠粒加载。这可以用2循环的程序来完成，其类似于实例8中的循环A和B，不同之处在于，输入到泵P可通过阀Vb4和Vb(循环A)，从泵P的输出可通过阀Vbs和Vw(循环B)。该程序可将珠粒浆从井B4抽取到泵P内，并通过容器R将珠粒浆从泵P排出到废井W内。当浆通过容器R时，珠粒可被放置在容器R下方的磁体捕捉。

在aRNA(井Oa内)可被捕捉之前，它必须与粘结缓冲剂混合。这可使用另一类似于实例8中所述的四循环程序来实现，不同之处在于，粘结缓冲剂可从珠粒轨道内的井B1抽取，混合物可积累在井Ob内。

通过将井Ob内容物泵送通过容器R并流出到废井W内，然后，井Ob内的aRNA可被容器R内的珠粒捕捉。这可用2循环的程序来实现，在该程序中，泵P通过阀Vob进行填充(循环A)，并通过阀Vbs和Vw放空(循环B)。

然后，加载的珠粒可用从井B2泵送来的乙醇进行清洗。这可以用2循环的程序来实现，在该程序中，泵P通过阀Vb2和Vb进行填充(循环A)，并通过阀Vbs和Vw放空(循环B)。在乙醇从井B2中排空之后，可继续泵送，将空气抽取到珠粒上方以干燥珠粒。

最后，通过泵送水通过容器R，用2循环的程序来实现aRNA可从珠粒中洗脱到井E内，在该程序中，泵P通过阀Vb3和Vb进行填充(循环A)，并通过阀Vbs和Ve放空(循环B)。

实例10.使用带有实时PCR探测的装置的短RNA扩增

微RNA(miRNA)是短(19-25核苷酸)单链RNA，其由处理较大RNA而产生的，而siRNA是短(20-25核苷酸)双链RNA，其也由处理较大RNA而产生的。miRNA隐含在mRNA的调节转变中，而siRNA可以是基因的默认或活动的转录。miRNA和siRNA联合地称作小RNA，它们可使用这里所述的装置进行化验。为了化验小RNA，图58中装置可重新配置成：1)R3含有多(聚)腺苷化短RNA的混合物，2)R4含有实时PCR引物和实时主混合物，以及3)R1中的RT混合物可包含带有5’顺序的poly T顺序，用于实时PCR扩增而代替T7促进物。反应可如实例9中所述进行，例外的是，首先，polyA尾部将添加到小RNA，以使用作为试剂源的R3来产生多(聚)腺苷的小RNA。逆转录和第二链合成可如实例9中所述进行操作。然后用混合实时PCR引物和来自R4的主混合物与第二链的产物，来替代T7转录的最后步骤。实时PCR引物然后使用带有实时探测的PCR来进行扩增。该扩增可脱离微芯片发生，或探测器和热循环可纳入到微芯片上或加热块509内。微芯片上的实时PCR可以是以前所述的例如Jovanovich，S.，I.Blaga，和D.Rank.的微流体的装置。美国专利出版物2007/0248958和PCT出版物WO/2006/032044，本文以参见方式引入它们内容。显然，本技术领域内技术人员将会明白到，通过省略多(聚)腺苷步骤，其它的mRNA可如该实例中所述进行处理。

尽管这里显示和描述了本发明的优选实施例，但本技术领域内的技术人员显然明白，如此的实施例仅是借助于实例来提供的。本技术领域内的技术人员现会想到许多的改变、变化和替代而不脱离本发明的范围。例如，任何的MOVe阀、泵、路由器或其它本文中所述的MOVe装置都可被任何气动致动的阀、泵、路由器或其它装置所替代。应该理解到，在实践本发明时，可使用对这里所述本发明的各种实施例的各种替代方案。以下的权利要求书意欲定义本发明的范围，并由此包括纳入权利要求书及其等价物范围之内的那些方法和结构。