一种制备环糊精溶菌酶包合物的方法及制备的饲料添加剂、及该包合物在配合饲料中的应用

摘要

一种制备环糊精溶菌酶包合物的方法及制备的饲料添加剂、及该包合物在配合饲料中的应用。包合物的制备方法为将5-90％的溶菌酶和10-95％的环糊精(按重量计)混合，40-90℃，包合1-3h即得；经环糊精包合后的溶菌酶的耐热性得到了显著提高。该方法溶菌酶包合物制备过程中加入极少量或根本不加水；不需加入任何有机溶剂，无溶剂残留，后处理方便；工艺简便，包合速度快。然后将溶菌酶和溶菌酶的包合物按照1∶1-3的比例组成一种饲用添加剂；该溶菌酶和包合物组成的饲用添加剂对胃蛋白酶都有较好的耐受性，且按照0.05％-0.5％的添加量混入到配合饲料中，搅拌均匀后，体外抑菌效果非常明显。

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用环糊精包被技术处理溶菌酶来提高其对温度和酶切的耐受性的方法，通过该方法得到一种可作为饲料添加剂的产物，属于酶工程技术领域。

背景技术

溶菌酶(Lysozyme，EC3.2.1.17)是专门作用于微生物细胞壁的水解酶，又称细胞壁溶解酶(Muramidase)，是一种绿色、无污染、无公害、无残留的、安全性很高的高盐基蛋白质，能专一性地作用于肽聚糖的糖苷链使之断裂，使细菌细胞壁变得松驰，失去对细胞的保护作用，最后细胞溶解死亡，而对没有细胞壁的人体细胞不会产生不利影响。由于其具有选择性抑菌的特点，目前已被许多国家和组织批准为食品防腐剂或保鲜剂使用。目前，溶菌酶作为畜禽饲料添加剂才刚起步，仅前苏联、法国做了一些初步研究，但国内有人报道运用溶菌酶于畜禽生产取得了较好效果。溶菌酶对仔猪腹泻有防治作用，它与免疫球蛋白在功能上有着紧密的联系，并能与其他生命活性物质入补体，增强抗体的活性，从而杀灭细菌。另有报道，溶菌酶可用于防治胃肠炎、消化不良、化脓等疾病，在饲喂肉仔鸡、犊牛、仔猪等畜禽上已经证明；溶菌酶正成为一种“绿色”饲用酶制剂，在国内外畜牧及水产养殖业中将会具有广阔的应用价值和巨大的发展前景。然而，目前对于饲用酶制剂的评估主要集中在对产品活性的简单测定方面，主要是酶的活性，而对于酶制剂在动物消化道内真正发挥作用的有效酶活评估还很少见，由于肠道内的复杂环境使得这部分内容的研究非常困难。众所周知，在酶制剂到达动物消化道相应位点发生作用之前，其活性会受到各种各样形式的损失。首先是在饲料加工过程中，高温和湿度会造成酶制剂活性降低；之后进入动物胃中，会受到胃酸和胃蛋白酶的切割；进入小肠之后，也会收到胰酶等蛋白酶的作用，造成酶制剂活性的损失。因此，对于饲用酶制剂来说，其不仅要经受饲料加工过程中高温高湿等热处理，还要经受动物胃肠道内不同pH环境和内源蛋白酶的影响。以往的报道对饲用酶制剂的酶学性质性研究较多，如最适温度、pH和热稳定性等，而对其在动物肠道中的稳定性研究较少。一种解决酶制剂耐酸解、耐酶切的有效方法就是对产品进行包被处理，来提高产品在肠道内的稳定性，充分发挥其应有的特征。

环糊精(Cyclodextrin，简称CD)为无毒无味的白色粉末状固体，是直链淀粉在由芽孢杆菌产生的环糊精葡萄糖基转移酶作用下生成的一系列环状低聚糖的总称，由于连接葡萄糖单元的糖苷键不能自由旋转，使得环糊精形成了略呈锥形的圆环，环糊精的伯羟基围成了锥形的小口，其仲羟基围成了锥形的大口。基于环糊精本身的结构特点，所以它具有疏水的内腔和亲水的表面。其中β-环糊精(β-CD)作为分子载体，在医药工业，食品和其它工业领域得到了广泛应用。近年来，有关用环糊精及其衍生物包合挥发油、维生素和常用药物等的报道已屡见不鲜，但有关溶菌酶的包合处理技术目前还未见报道。本发明就是利用环糊精的疏水空腔生成包合物的能力，使溶菌酶与环糊精生成包合物，来达到稳定溶菌酶的物化性质，减少氧化及热敏性等目的，为溶菌酶在饲料工业中的推广应用提供一定的理论依据，从而为溶菌酶在饲料行业中发挥更好的经济效益和社会效益奠定基础。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种制备环糊精溶菌酶包合物的方法及其在配合饲料中的应用，为溶菌酶在饲料工业中的推广应用提供一定的理论依据，从而为溶菌酶在饲料行业中发挥更好的经济效益和社会效益奠定基础。

本发明所需要解决的技术问题，可以通过以下技术方案来实现：

本发明主要内容包括三个方面，第一个方面，将一定量的溶菌酶与环糊精混合，控制温度和时间即得成品，通过饲料加工过程中高温高湿条件对包合处理后溶菌酶活的影响，来评价包合处理后溶菌酶的稳定性。

(1)溶菌酶包合物的制备

采用密封加热法，将溶菌酶样品和环糊精混合，温度控制在40-90℃，包合时间为1-3h。

其中，溶菌酶的用量为5-90％，环糊精的用量为10-95％(按重量百分比计)，制得溶菌酶包合物。

(2)溶菌酶包合物的酶活

精密称取包合物0.01g溶于PBS(pH6.2)的缓冲溶液中，充分摇匀后稀释100倍备用；同时以溶菌酶与环糊精直接混合后的混合物作为对照组，按照溶菌酶酶活的测定方法，检测包合物的酶活。

溶菌酶直接与环糊精混合后的酶活随着温度的升高逐渐下降，在100℃时，残留酶活为20％左右，说明未包合的溶菌酶结构受到了破坏；而环糊精包合的溶菌酶在高温下仍然保持着较高的酶活，在100℃时保留20min后，残留酶活在83％以上。结果说明使用环糊精包合的溶菌酶的稳定性明显提高。

(3)溶菌酶包合物在饲料制粒过程中的耐热性能实验

酶是具有生物活性的蛋白质，大多数酶制剂不具有耐受90℃以上高温的性质。饲料在生产过程中，粉碎、预混、制粒等过程都会造成酶制剂活性损失甚至不可逆失活。为分析包合物的热稳定性，准确称取一定量的溶菌酶样品于试管中，分别置于不同温度的蒸汽(即湿法)和热空气(即干法)中保温一定的时间后，按照溶菌酶酶活的检测方法检测各自酶活。

溶菌酶样品在干法的不同温度条件下保温后酶活下降不明显。保温3min后，相对酶活全部都在92％以上；保温5min后，相对酶活全部都在91％以上；湿法保温对溶菌酶的酶活影响比干法明显。保温3min后，相对酶活全部都在90％以上，酶活损失较小，这与干法保温的结果相似；5min后相对酶活在88％-93％之间。综合干法保温和湿法保温对包合物溶菌酶酶活的影响结果可知，无论干法或湿法，在75℃-90℃高温下保持3min后，溶菌酶的酶活损失均较小，这些条件足以满足饲料在制粒过程中所经受的温度和时间，说明饲料制粒过程中的高温不会明显的影响到包合后溶菌酶的酶活，即溶菌酶包合处理后完全能够承受一般制粒工艺中的高温和高湿处理过程。

本发明的第二方面，将未包合的溶菌酶和溶菌酶包合物按照一定的比例混合组成一种饲用添加剂。

在畜禽的体内，由于食糜在胃中的停留时间为两小时左右，其强酸环境(pH2-3)外加胃蛋白酶的作用等会使很多的酶制剂变性，从而降低酶的生物利用率。本部分的内容就是针对这些问题和缺点加以改进，提供一种溶菌酶在配合饲料中的应用方法，使其能够顺利通过胃的强酸环境，提高对胃蛋白酶的耐受性，从而降低酶活的损失，而达到小肠后能较快的发挥作用，最大限度地提高酶制剂的利用率。

将溶菌酶样品与溶菌酶包合物以1∶1～3的比例混合均匀，即得一种饲用添加剂样品，、搅拌均匀。

所述溶菌酶与溶菌酶包合物的重量比为1∶2。

本发明的第三方面，一种环糊精溶菌酶包合物在配合饲料中的应用，其特征在于，将溶菌菌酶与溶菌酶包合物以重量比1∶1-3的比例混合均匀，即得一种饲用添加剂，分别按照0.05％-0.5％的添加量混入到配合饲料中，搅拌均匀。

将溶菌酶样品与溶菌酶包合物以1∶1～3的比例混合均匀，即得一种饲用添加剂样品，分别按照0.5％、0.25％和0.05％的添加量混入到配合饲料(未添加任何抗生素)中，搅拌均匀。

将溶菌酶样品与溶菌酶包合物分别以1∶1，1∶2，1∶3的比例混合均匀，即得一种饲用添加剂样品，通过对胃蛋白酶的耐受性实验，确定溶菌酶和溶菌酶包合物合适的组成比例。

准确称取一定量的胃蛋白酶，溶解于5mL柠檬酸-磷酸盐缓冲溶液中(1.0mg/mL，pH2.0)，然后分别取溶菌酶和溶菌酶包合物不同比例组成的饲用添加剂样品，于37℃，100rpm振荡溶解2h后，取一定量上清液，用缓冲溶液稀释100倍后，按照溶菌酶活力的测定方法，检测各样品的酶活，同时设立对照组，即以未经胃蛋白酶处理的添加剂的酶活为100％，其余经过处理的酶活力与之相比得到的百分比即为该样品的相对剩余酶活。

在pH 2.0～5.0的酸性范围内，经胃蛋白酶处理2h后，溶菌酶样品与溶菌酶包合物按照不同比例组成的饲用添加剂对胃蛋白酶表现出较好的耐受性，相对剩余酶活均始终保持在80％以上；

尤其是按照1∶2比例组成的饲用添加剂，在pH 2.0保温2h后相对剩余酶活为98％，说明溶菌酶包合物对胃蛋白酶具有较强的耐受性，稳定性得到了明显提高。

所述溶菌酶样品与溶菌酶包合物按照1∶2比例组成的饲用添加剂，分别按照0.05％-0.5％的添加量混入到配合饲料中，搅拌均匀。

说明此比例组成的饲用添加剂能够顺利通过胃的强酸环境，酶活损失减少，酶的作用时间得到延长，可以在肠道内发挥作用，提高生物利用率。

具体实施方式

为了使本发明的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

(一)溶菌酶包合物的制备及稳定性

(1)溶菌酶包合物的制备

采用密封加热法，将溶菌酶样品和环糊精混合，温度控制在40-90℃，包合时间为1-3h。其中，溶菌酶的用量为5-90％，环糊精的用量为10-95％(按重量计)，即得成品包合物。

(2)溶菌酶包合物的酶活

精密称取包合物0.01g溶于PBS(pH6.2)的缓冲溶液中，充分摇匀后，取一定量溶液用PBS缓冲液稀释100倍备用；同时以溶菌酶与环糊精直接混合后的混合物作为对照组，按照溶菌酶酶活的测定方法，检测包合物的酶活。

表1  溶菌酶包合物稳定性的实验结果

从表1中可以看出，溶菌酶直接与环糊精混合后的酶活随着温度的升高逐渐下降，在100℃时，残留酶活为20％左右，说明未包合的溶菌酶结构受到了破坏；而环糊精包合的溶菌酶在高温下仍然保持着较高的酶活，在100℃时保留20min后，残留酶活在83％以上。结果说明使用环糊精包合的溶菌酶的稳定性明显提高。

溶菌酶酶活测定：采用比浊法测定溶菌酶包合物的酶活，即以溶壁微球菌悬浮液作为底物(25℃)，在450nm波长处分别在不同时间测定OD₄₅₀的数值。酶活定义：在本实验条件下，每分钟OD₄₅₀数值下降0.001为一个活力单位；

(3)溶菌酶包合物在饲料制粒过程中的耐热性能实验

酶是具有生物活性的蛋白质，大多数酶制剂不具有耐受90℃以上高温的性质。饲料在生产过程中，粉碎、预混、制粒等过程都会造成酶制剂活性损失甚至不可逆失活。为分析溶菌酶包合物的热稳定性，准确称取一定量的溶菌酶包合物样品于试管中，分别置于不同温度的蒸汽(即湿法)和热空气(即干法)中保温一定的时间后，按照溶菌酶酶活的检测方法检测各自酶活。

表2  溶菌酶包合物的耐热性能实验结果(％)

表2表明，溶菌酶样品在干法的不同温度条件下保温后酶活下降不明显。保温3min后，相对酶活全部都在92％以上；保温5min后，相对酶活全部都在91％以上；湿法保温对溶菌酶的酶活影响比干法明显。保温3min后，相对酶活全部都在90％以上，酶活损失较小，这与干法保温的结果相似；5min后相对酶活在88％-93％之间。综合干法保温和湿法保温对包合物溶菌酶酶活的影响结果可知，无论干法或湿法，在75℃～90℃高温下保持3min后，溶菌酶的酶活损失均较小，这些条件足以满足饲料在制粒过程中所经受的温度和时间，说明饲料制粒过程中的高温不会明显的影响到包合后溶菌酶的酶活，即溶菌酶包合处理后完全能够承受一般制粒工艺中的高温和高湿处理过程。

(二)溶菌酶和溶菌酶包合物组成的饲用添加剂

在畜禽的体内，由于食糜在胃中的停留时间为两小时左右，其强酸环境(pH2-3)外加胃蛋白酶的作用等会使很多的酶制剂变性，从而降低酶的生物利用率。本部分的内容就是针对这些问题和缺点加以改进，提供一种溶菌酶在配合饲料中的应用方法，使其能够顺利通过胃的强酸环境，提高对胃蛋白酶的耐受性，从而降低酶活的损失，而达到小肠后能较快的发挥作用，最大限度地提高酶制剂的利用率。

将溶菌酶样品与溶菌酶包合物以1∶1，1∶2，1∶3的比例混合均匀，即得一种饲用添加剂样品，通过对胃蛋白酶的耐受性实验，确定合适的组成比例；然后将合适比例组成的饲用添加剂分别按照0.05％、0.25％和0.5％的添加量混入到配合饲料中，搅拌均匀，分别研究加酶后配合饲料的抑菌效果。

准确称取一定量的胃蛋白酶，溶解于pH为2.05mL柠檬酸-磷酸盐缓冲溶液中(1.0mg/mL)，然后分别取溶菌酶和溶菌酶包合物不同比例组成的饲用添加剂样品，于37℃，100rpm振荡溶解2h后，取上清液作适当稀释，按照溶菌酶活力的测定方法，检测各样品的酶活，同时设立对照组，即以未经胃蛋白酶处理的添加剂的酶活为100％，其余经过处理的酶活力与之相比得到的百分比即为该样品的相对剩余酶活。

表3  溶菌酶与溶菌酶包合物组成的饲用添加剂耐胃蛋白酶的实验结果

  溶菌酶∶溶菌酶包合物  1∶1  1∶2  1∶3  相对酶活(％)  90  98  87

表3表明，在pH 2.0的酸性环境中，经胃蛋白酶处理2h后，溶菌酶样品与溶菌酶包合物按照不同比例组成的饲用添加剂对胃蛋白酶表现出较好的耐受性，相对剩余酶活均始终保持在85％以上；尤其是按照1∶2比例组成的饲用添加剂，在pH 2.0保温2h后相对剩余酶活为98％，对胃蛋白酶具有较强的耐受性，稳定性得到了明显提高。因此，按照1∶2比例组成的饲用添加剂能够顺利的通过胃的强酸环境，酶活损失最少，酶的作用时间得到延长，可以在肠道内发挥作用，提高生物利用率。

将溶菌酶样品与溶菌酶包合物以1∶2的比例混合均匀，即得一种饲用添加剂样品，分别按照0.05％、0.25％和0.5％的添加量混入到配合饲料中，搅拌均匀，分别研究加酶后配合饲料的抑菌效果。

实施例1：

取溶菌酶样品与溶菌酶包合物以1∶2的比例混合均匀后组成的饲用添加剂样品1000g，加入饲用添加剂0.5g(即添加量0.05％)，充分混合均匀，然后准确取混合样品1.0g，置于装有50mL自来水的三角瓶中；同时设立对照组，即直接准确称取配合饲料1.0g加入到50mL自来水中，于37℃，200rpm振荡培养18h后，肉眼观察有无菌体生长，显微镜观察菌体的种类，然后采用稀释涂布平板法进行菌落计数。

表4添加量为0.05％的饲用添加剂在配合饲料中的体外抑菌实验结果

实施例2：

取溶菌酶样品与溶菌酶包合物以1∶2的比例混合均匀后组成的饲用添加剂样品400g，加入饲用添加剂1.0g(即添加量0.25％)，充分混合均匀，然后准确取混合样品1.0g，置于装有50mL自来水的三角瓶中；同时设立对照组，即直接准确称取配合饲料1.0g加入到50mL自来水中，于37℃，200rpm振荡培养18h后，肉眼观察有无菌体生长，显微镜观察菌体的种类，然后采用稀释涂布平板法进行菌落计数。

表5添加量为0.25％的饲用添加剂在配合饲料中的体外抑菌实验结果

实施例3：

取溶菌酶样品与溶菌酶包合物以1∶2的比例混合均匀后组成的饲用添加剂样品200g，加入饲用添加剂1.0g(即添加量0.5％)，充分混合均匀，然后准确取混合样品1.0g，置于装有50mL自来水的三角瓶中；同时设立对照组，即直接准确称取配合饲料1.0g加入到50mL自来水中，于37℃，200rpm振荡培养18h后，肉眼观察有无菌体生长，显微镜观察菌体的种类，然后采用稀释涂布平板法进行菌落计数。

表6添加量为0.5％的饲用添加剂在配合饲料中的体外抑菌实验结果

从以上结果可以看出，配合饲料中加入溶菌酶样品后，微生物的种类和数量都发生了明显的减少。添加量为0.5％的实验组中只有芽孢菌生长，且数量级明显降低，0.25％和0.05％实验组中有少量的杆菌和球菌生长。根据本实验室的前期结果，溶菌酶能有效的抑制畜禽中常见的致病菌，如大肠埃希氏菌，沙门氏菌、魏氏梭菌和金黄色葡萄球菌等，相同浓度的溶菌酶对芽孢菌的抑制作用较弱。综合以上结果，可以看出，加酶后配合饲料的抑菌作用非常明显，能有效的抑制常见的肠杆菌和球菌等微生物的生长。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。