一种花色苷单体矢车菊-3-葡萄糖苷的制备方法

摘要

本发明涉及一种花色苷单体矢车菊-3-葡萄糖苷的制备方法。所述制备方法以黑莓为原料，将其打浆、浸提浓缩、除杂、纯化，得到花色苷单体矢车菊-3-葡萄糖苷。本发明的制备方法采用高速逆流色谱纯化矢车菊-3-葡萄糖苷，其溶剂体系由正丁醇、有机酸和水组成，原料成本低、毒性小从而降低了成本，提高了上相的循环使用率及仪器的操作弹性和连续性，减少了有毒有害成分在产品中的残留，安全性高，质量可控且操作简便。

说明书

技术领域

本发明涉及添加剂领域，尤其是一种花色苷单体矢车菊-3-葡萄糖苷的制备方法。

背景技术

黑莓是欧美地区广泛栽培的四大小果类果树的重要种类之一，1993年世界粮农组织(FAO)将其推荐为世界上第三代水果。黑莓果实柔软多汁、酸甜爽口、色泽艳丽、风味醇美，并且富含营养成分，如：花色苷、维生素C、维生素E、微量元素、氨基酸等，经常食用有延年益寿、轻身驻颜的神奇功效，在国外被称为“生命之果”，近年来，黑莓在我国的种植范围逐年扩大，国内外市场供不应求。

据测定，黑莓果中花色苷含量高达180mg/100g，花色苷为多酚类成分，具有预防血栓、抗癌、抗氧化、抗真菌、抗突变、延缓衰老等重要的生理活性，可作为天然色素、天然抗氧化剂以及营养补充剂加以应用。

目前已有报道黑莓中含有矢车菊-3-葡萄糖苷和矢车菊-3-芸香糖苷两种花色苷成分，通常采用传统的固-液柱色谱分离技术分离得到黑莓中花色苷单体成分。采用固-液柱色谱分离技术分离黑莓中花色苷单体成分时，常把硅胶作为固定相填充在色谱柱内，样品在被流动相洗脱的过程中会因吸附在固定相上而不能完全被洗脱，从而造成色谱柱对产品有死吸附的缺陷；同时，色谱柱对流动相溶剂的要求较高，需要色谱纯级别，成本较高。另一方面，现有的处于实验室研究水平的液-液逆流色谱分离技术所采用的溶剂体系由甲基叔丁基醚、乙腈、正丁酸、三氟乙酸和水五种溶剂组成，其中乙腈和三氟乙酸的价格高、毒性大，溶剂难以循环再利用，不利于花色苷的大量制备，因此有待于开发一种能克服现有技术缺陷的花色苷单体矢车菊-3-葡萄糖苷的制备方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种花色苷单体矢车菊-3-葡萄糖苷的制备方法，所述制备方法以黑莓为原料，将其打浆、浸提浓缩、除杂（糖、酸等成分）、纯化，得到花色苷单体矢车菊-3-葡萄糖苷。本发明的制备方法成本低、回收率高、进样量大，且操作简便。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种花色苷单体矢车菊-3-葡萄糖苷的制备方法，包括如下步骤：

A、原料预处理：将经过挑选、清洗的黑莓果打浆，得到黑莓果浆；

B、粗提：配制1%盐酸乙醇（v/v）溶液，按料液比为1：10的比例，将配好的盐酸乙醇溶液加入到黑莓果浆中，常温浸提、过滤三次，然后合并滤液并将滤液用旋转蒸发器在40～50℃真空蒸发，浓缩滤液至膏状，得到黑莓浸膏，并回收乙醇；

C、装柱：将经乙醇处理的大孔吸附树脂装入树脂柱中，再用去离子水冲洗；

D、除杂：将黑莓浸膏用少量去离子水溶解得到黑莓上柱液，并注入树脂柱中，然后用去离子水洗涤树脂，再用60%的乙醇将花色苷成分从树脂上解吸下来，将所得到的解吸液用旋转蒸发器在40～50℃真空蒸发，得到花色苷粗品，同时回收乙醇；

E、纯化：按正丁醇∶有机酸∶水的体积比为100∶1～10∶100的比例制备色谱纯化溶剂体系，用高速逆流色谱仪将花色苷粗品进行纯化，得到花色苷单体矢车菊-3-葡萄糖苷。

所述的花色苷单体矢车菊-3-葡萄糖苷的制备方法，步骤C中所述大孔吸附树脂为AB-8型大孔吸附树脂。

所述的花色苷单体矢车菊-3-葡萄糖苷的制备方法，步骤E中所述的溶剂体系为正丁醇∶有机酸∶水=100∶1∶100。

所述的花色苷单体矢车菊-3-葡萄糖苷的制备方法，步骤E中所述的有机酸为甲酸。 

所述的花色苷单体矢车菊-3-葡萄糖苷的制备方法，步骤E中所述有机酸为乙酸。

本发明与现有技术相比有如下优点：

1、本发明的花色苷单体矢车菊-3-葡萄糖苷的制备方法采用高速逆流色谱纯化矢车菊-3-葡萄糖苷，其溶剂体系由正丁醇、有机酸（甲酸/乙酸）和水组成，因涉及的原料成本低、毒性小从而降低了成本，提高了上相（正丁醇）的循环使用率及仪器的操作弹性和连续性，减少了有毒有害成分在产品中的残留，安全性高，质量可控。

2、本发明的花色苷单体矢车菊-3-葡萄糖苷的制备方法所采用的分离手段及高速逆流色谱（HSCCC）纯化技术纯化花色苷单体矢车菊-3-葡萄糖苷工艺，拓宽了高速逆流色谱两相溶剂体系中有机酸（甲酸/乙酸）的种类和用量。

3、本发明的花色苷单体矢车菊-3-葡萄糖苷的制备方法操作简便、可连续进样制备产品，提取分离纯化过程中所使用的乙醇、正丁醇等有机溶剂可循环利用，大孔吸附树脂可重复使用；高速逆流色谱纯化所使用的溶剂体系由正丁醇、有机酸和水组成，固定相和流动相均为液相，可借助于气体的压力清除在色谱仪内可能的残留物，克服了现有技术固-液柱色谱固定相对产品有死吸附的缺陷。因此，本发明既有效地降低了矢车菊-3-葡萄糖苷单体的制备成本，又减少了其制备过程中有机废料的排放，产品可广泛用于食品、药品、化妆品等领域。    

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作一详细描述。

实施例1：一种花色苷单体矢车菊-3-葡萄糖苷的制备方法，包括如下步骤：

A、原料预处理：将经过挑选、清洗的黑莓果打浆，得到黑莓果浆；

如果不是时令季节，原料可以用黑莓冷冻果，需先将冷冻果解冻然后进行挑选、清洗。黑莓冷冻果可购于北京市林业科学院。本实施例的打浆设备采用本领域通用的螺旋榨汁机。     

B、粗提：配制1%盐酸乙醇（v/v）溶液，按料液比1：10的比例，将配好的盐酸乙醇溶液加入到黑莓果浆中，常温浸提（24小时）、过滤三次，经三次浸提和过滤后黑莓果浆基本呈无色，然后合并滤液并将滤液用旋转蒸发器在40～50℃真空蒸发，浓缩滤液至膏状，得到黑莓浸膏，并回收乙醇；

本实施例的乙醇（95%的工业乙醇）、盐酸（分析纯）均购于北京化工厂，在乙醇中加入盐酸一方面可以促使花色苷从黑莓细胞组织中完全地、快速地溶出；另一方面可以维持花色苷的结构，防止花色苷降解，此外，还可以水解花色苷的酰基，最大限度地得到只有糖基的花色苷。

本实施例的旋转蒸发器型号为Laborate 4000，购于德国海道夫公司。

C、装柱：将经乙醇处理的大孔吸附树脂装入树脂柱中，再用去离子水冲洗；

本实施例的步骤C中所述大孔吸附树脂为AB-8型大孔吸附树脂；先将AB-8大孔吸附树脂用95%的乙醇浸泡24小时，然后用95%的乙醇进行洗涤，再用去离子水清洗；将经过处理的AB-8大孔吸附树脂缓慢装入树脂柱中，再用去离子水冲洗，至柱中颗粒干净，不再沉降为止。

本实施例的AB-8大孔吸附树脂购于河北沧州宝恩吸附材料科技有限公司。

D、除杂：将黑莓浸膏用少量去离子水溶解得到黑莓上柱液，并用恒流泵注入到树脂柱中，令树脂吸附黑莓中的花色苷成分，用去离子水洗涤树脂，除去水溶性的糖、酸等成分，再用60%的乙醇将花色苷成分从树脂上解吸下来，并将得到的解吸液用旋转蒸发器在40～50℃真空蒸发除去乙醇，得到花色苷粗品，同时回收乙醇。

本实施例所采用的恒流泵型号：BT1-100，购自上海琪特分析仪器有限公司。

AB-8大孔吸附树脂的作用是在水相环境下，可以吸附花色苷等黄酮类成分，而对糖、酸等水溶性较大的成分不吸附，因此，可以对黑莓浸膏（黑莓粗提物）进行初分离。

E、纯化：按正丁醇∶有机酸∶水的体积比为100∶1～10∶100的比例制备色谱纯化溶剂体系，用高速逆流色谱仪将花色苷粗品进行纯化，得到高纯度(95%以上)花色苷单体矢车菊-3-葡萄糖苷。

本实施例色谱纯化的溶剂体系中各溶剂体积比的比例，即正丁醇∶有机酸∶水为100∶1∶100。

本实施例溶剂体系中的有机酸为甲酸，也可以是乙酸。

高速逆流色谱仪的操作参数：温度25℃，正转(FWD)，转速850rpm，黑莓上柱液流速为2mL/min，上样量200mg。高速逆流色谱纯化操作可连续进样，配制的溶剂体系上相（正丁醇）可重复使用。

本实施例所使用的纯化设备为高速逆流色谱仪，型号为HSCCC-300A，购自上海同田生物科技有限公司。

所述一种花色苷单体矢车菊-3-葡萄糖苷的制备方法，以加工1000g黑莓果原料为例，其制备步骤如下：

A、将经过挑选、清洗的黑莓果打浆，置于榨汁机中打浆，得到黑莓果浆； 

B、粗提：配制1%盐酸乙醇溶液，按料液比1∶10（w/v），将配好的盐酸乙醇溶液10L加入1000g黑莓果浆中，常温浸提24小时后过滤；在滤渣中再加入1%盐酸乙醇溶液10L，第二次浸提24小时后过滤；在滤渣中再加入1%盐酸乙醇溶液10L，第三次浸提24小时后过滤；经三次浸提和过滤后黑莓果浆基本呈无色，将三次过滤的滤液合并，然后将约30L滤液用旋转蒸发器在40～50℃真空蒸发，浓缩滤液至膏状，得到黑莓浸膏，并回收乙醇。

C、装柱：将经乙醇处理的200g AB-8大孔吸附树脂缓慢装入树脂柱中，再用去离子水冲洗，至柱中颗粒干净，不再沉降为止。

D、除杂：将黑莓浸膏用少量去离子水完全溶解得到黑莓上柱液，用恒流泵注入树脂柱中，令树脂吸附黑莓中的花色苷成分，然后用去离子水洗树脂柱除去水溶性的糖、酸等成分，再用乙醇解吸树脂上吸附的花色苷成分，并将得到的解吸液用旋转蒸发器在40～50℃真空蒸发除去溶剂乙醇，得到花色苷粗品，同时回收乙醇；

E、纯化：按正丁醇∶甲酸∶水的体积比为100∶1∶100的比例制备10L色谱纯化溶剂体系溶液，用高速逆流色谱仪将花色苷粗品进行纯化，得到高纯度(95%以上)花色苷单体矢车菊-3-葡萄糖苷。

高速逆流色谱仪操作参数：温度25℃，正转，转速850rpm，流速为2mL/min，上样量200mg，将上述得到的花色苷粗品注入高速逆流色谱法进行纯化，即得到高纯度的矢车菊-3-葡萄糖苷，纯化体系中甲酸可用乙酸代替，色谱操作可连续进样，配制的溶剂体系上相（正丁醇）可重复使用。