用于治疗类风湿性关节炎或急性骨髓性白血病的环戊二烯并G喹唑啉衍生物

摘要

一种含L-Glu-γ-D-Glu二肽基团的式(I)环戊二烯并[g]喹唑啉衍生物：其中：R

说明书

发明背景

本发明涉及环戊二烯并[g]喹唑啉衍生物的应用。更特别是其涉及用于治疗类风湿性关节炎(RA)和急性骨髓性白血病(AML)的环戊二烯并[g]喹唑啉衍生物。

已经开发出显示涉及它们的既抑制胸苷酸合成酶(TS)的能力并且也涉及它们对抗多种细胞系的抗癌活性的良好活性水平的环戊二烯并[g]喹唑啉衍生物。

WO 94/11354 A1(British Technology Group Limited)公开了下式三环化合物：

其中R¹是氢、氨基、C_1-4烷基、C_1-4烷氧基、C_1-4羟基烷基或C_1-4氟代烷基；

R²是氢、C_1-4烷基、C_3-4链烯基、C_3-4链炔基、C_2-4羟基烷基、C_2-4卤代烷基或C_1-4氰基烷基；

Ar是可任选带有一个或两个取代基的亚苯基、噻吩二基、噻唑二基、吡啶二基或嘧啶二基，所述取代基选自卤代、羟基、氨基、硝基、氰基、三氟甲基、C_1-4烷基和C_1-4烷氧基；和

R³是下式之一的基团：

-NHCH(CO₂H)-A¹-Y¹    -NH-A³-Y³

或R³是N-连接的天然存在的氨基酸，其选自L-丙氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸和L-苯基丙氨酸。在公开的化合物中的是L-Glu-γ-D-Glu化合物CB300638，其也在Clinical Cancer Research，5，1999年11月(增刊)，#566(Theti等)和Proceedings of the American Association for Cancer Research，41，2000年3月，#33(Jackman等)中提到，以及在J.Med.Chem.，2000，43，1910-1926中的第1923页作为化合物7b公开。

WO 95/30673 A1(British Technology Group Limited)公开了下式的环戊二烯并[g]喹唑啉：

其中R¹是氢、氨基、C_1-4烷基、C_1-4烷氧基、C_1-4羟基烷基或C_1-4氟代烷基；

R²是氢、C_1-4烷基、C_3-4链烯基、C_3-4链炔基、C_2-4羟基烷基、C_2-4卤代烷基或C_1-4氰基烷基；

Ar¹是可任选带有一个或两个取代基的亚苯基、噻吩二基、噻唑二基、吡啶二基或嘧啶二基，所述取代基选自卤代、羟基、氨基、硝基、氰基、三氟甲基、C_1-4烷基和C_1-4烷氧基；和

R³是下式之一的基团：

-A¹-Ar²-A²-Y¹    -A⁵-CON(R)CH(Y⁴)Y⁵    -A⁸-X-Ar⁴

叶酸受体(α-FR；膜相关叶酸-结合蛋白)的α-同工型是糖基磷脂酰肌醇锚定的细胞膜蛋白质，其对叶酸和更具生物相关性还原的叶酸具有非常高度的亲合力(Kd～0.1nM)。叶酸内化的机制是受体-介导的内吞作用。α-FR在许多癌症中过度表达，尤其是在卵巢源性癌中过度表达，其中在90％的病例中高度和均匀地过度表达；参见Cancer Res.51，5329-5338，1991(Campbell等，1991)。此外，高α-FR表达已与进行性的、抗铂疾病和差的预后相关联-参见Int.J.Cancer 74，193-198，1997和Int.J.Cancer 79，121-126，1998(两者均为Toffoli等)。β-同工型在上皮和非上皮来源的肿瘤中广泛表达，其表达水平一般分别为低/中和高，见在Critical Rev.Therap.在Drug Carrier Systems 15，587-627，1998(Reddy和Low)中的综述。

叶酸受体(α和β)在一些成人正常组织中表达(低至中度表达)。已经报告，与对RFC(还原性-叶酸载体)的亲合力比较，一般类别的环戊二烯并[g]喹唑啉中的某些化合物，对于α-叶酸受体表达人肿瘤细胞系具有高水平选择性。在WO 03/020300 A1、WO 03/020706 A1和WO03/020748 A1(BTG International Limited)中公开了这样的化合物。L-Glu-γ-D-Glu化合物CB300945在公开的化合物中，其也在Tetrahedron，63(7)，2007年2月12日，1537-1543(Bavetsias等)和Cancer Research 65，2005年12月15日，11721-11728(Gibbs等)中提到。

通常在胎盘组织和在造血细胞中找到FR-β，其在骨髓单核细胞系中表达，并且尤其在嗜中性粒细胞成熟期间或单核细胞或巨噬细胞激活期间表达水平提高。然而，在正常造血细胞上表达的FR-β，不同于在激活的巨噬细胞上的表达，例如，是非功能性的，其不能结合叶酸和使其内化。FR-β在得自慢性骨髓源性白血病(CML)患者的恶性细胞上表达并在大约70％的AML患者的恶性细胞上表达。

WO 03/072091-A1(The Ohio.State University Research Foundation)采用以下发现，即在通过FR-β诱导剂使来自骨髓性白血病患者的恶性细胞中FR-β的表达增加。骨髓性白血病细胞，优选AML细胞中的FR-β表达是功能性的，其结合叶酸并使其内化，此与在大多数正常造血细胞中的FR-β表达不同，其是非功能性的。这样的功能性的FR-β是与叶酸共轭的治疗剂的标靶。

Jansen在第13届蝶啶和叶酸的化学和生物学的国际学术讨论会(13th International Symposium on Chemistry & Biology of Pteridines & Folates)的题为″Antifolates in chronic inflammatory diseases/rheumatoid arthritis：what can we learn from cancer and vice versa，″Pteridines，16：46，2005的摘要中指出，甲氨蝶呤(MTX)是类风湿性关节炎患者的治疗方案中的锚定药物(anchor drug)。他进一步推测表现结合亲合性的、基于环戊二烯并[g]喹唑啉的TS抑制剂，接近叶酸并因而可为在治疗癌症及炎症疾病中有意义的FR-标靶药物。

发明简述

作者现在已经发现，某些普通种类的环戊二烯并[g]喹唑啉中的化合物对β-叶酸受体表达细胞系具有意想不到的高水平的选择性。这样的化合物具有两个结构特征，即三环结构和在与叶酸比较时对谷氨酸盐侧链的修饰。因此，本发明包括含有L-Glu-γ-D-Glu二肽基团的式(I)环戊二烯并[g]喹唑啉衍生物：

其中：

R¹是氨基、C_1-4烷基、C_1-4羟基烷基、C_1-4氟代烷基或甲氧基-C_1-4-烷基；

R²是C_1-4烷基、C_3-4链烯基、C_3-4链炔基、C_2-4羟基烷基、C_2-4卤代烷基或C_1-4氰基烷基；和

Ar是可任选带有一个或两个取代基的亚苯基、噻吩二基、噻唑二基、吡啶二基或嘧啶二基，所述取代基选自卤代、羟基、氨基、硝基、氰基、三氟甲基、C_1-4烷基和C_1-4烷氧基。

化合物(I)任选为药学上可接受的盐或酯的形式；

所述化合物用于治疗类风湿性关节炎或急性骨髓性白血病。

本发明化合物显示一个或多个以下优点：

1.当生长在生理浓度的叶酸中时，细胞过度表达β-FR的高选择性，并具有RFC的正常表达；

2.有效的TS抑制，对RFC的低亲合力和对β-FR中等至高亲合力；

3.TS-特异活性和体内抗水解酶；和

4.在用中等β-FR表达的主要的中国仓鼠卵巢细胞系筛选中的选择活性。

在本说明书中，术语烷基、链烯基和链炔基包括直链和支链基团，但是提及单个烷基，诸如丙基时，则仅特指直链基团。类似的约定应用在其它通称上。而且，用于环戊二烯并[g]喹唑啉核的编号系统为如下显示的常规编号系统：

本文以标准方式指定氨基酸残基(Pure and Applied Chemistry，1974，40，317和European Journal of Biochemistry，1984，138，9)。因此，例如，依据上下文，γ-谷氨酰基表示残基H₂NCH(CO₂H)CH₂CH₂CO-或-NHCH(CO₂H)CH₂CH₂CO-，在这些残基中的碳原子从α-羧基碳原子开始编码为1位。

将会观察到的是，本发明的环戊二烯并[g]喹唑啉含至少三个不对称碳原子[存在于基团-N(R²)-与三环系统的附着点上和在基团L-Glu-γ-D-Glu的α-碳原子上]，并且因此可存在外消旋体和光学活性形式。应该理解的是，本发明包括外消旋体和光学活性形式两者，如何通过立体有择合成或通过分离异构体化合物的混合物，可获得这样的光学活性形式，这应是公知常识。应该认识到，一个异构体可比另一个更有意义，这是由于其展示出的活性或由于较优越的物理特性，例如水溶性的性质所致。

也应该理解的是，式(I)的环戊二烯并[g]喹唑啉可展示出互变异构现象，并且在本说明书中显示的结构式仅代表一种可能的互变异构形式。

也应该理解的是，某些式(I)的环戊二烯并[g]喹唑啉可以溶剂化物以及非溶剂化物的形式，例如，水合物的形式存在。

当R¹或R²为C_1-4烷基时，其适宜的值，或者可存在于Ar上的C_1-4烷基取代基的适宜的值，是例如甲基、乙基、丙基或异丙基。

可存在于Ar上的C_1-4烷氧基取代基的适宜的值是，例如，甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基或丁氧基。

可存在于Ar上的卤代取代基的适宜的值是，例如，氟代、氯代或溴代。

当R²是C_3-4链烯基时，其适宜的值是，例如，丙-2-烯基、丁-2-烯基、丁-3-烯基或2-甲基丙-2-烯基；和当其为C_3-4链炔基时的适宜的值是，例如，丙-2-炔基或丁-3-炔基。

当R²是C_2-4羟基烷基时，其适宜的值是，例如，2-羟基乙基或3-羟基丙基；当其为C_2-4卤代烷基时的适宜的值是，例如，2-氟代乙基、2-氯代乙基、2-溴代乙基、3-氟代丙基、3-氯代丙基或3-溴代丙基；和当其为C_1-4氰基烷基时的适宜的值是，例如，氰基甲基、2-氰基乙基或3-氰基丙基。

当Ar是亚苯基时的适宜的值是，例如，1，3-或1，4-亚苯基，特别是1，4-亚苯基。

当Ar是噻吩二基时的适宜的值是，例如，噻吩-2，4-二基或噻吩-2，5-二基；当其为噻唑二基时的适宜的值是，例如，噻唑-2，4-二基或噻唑-2，5-二基；当其为吡啶二基时的适宜的值是，例如，吡啶-2，4-二基、吡啶-2，5-二基、吡啶-2，6-二基或吡啶-3，5-二基；和当其为嘧啶二基时的适宜的值是，例如，嘧啶-2，4-二基、嘧啶-2，5-二基或嘧啶-4，6-二基。

如所指出的，Ar可携带一个或两个取代基。当存在取代时，Ar中的优选的取代水平，是或者两个取代基或者特别是一个取代基；而一个或两个取代基可便利地位于邻近结合至基团-CO-L-Glu-γ-D-Glu的原子，卤代取代基，诸如氟代是优选的。

本发明的环戊二烯并[g]喹唑啉的适宜的药学上可接受的盐形式是，例如，与无机酸或有机酸，例如盐酸、氢溴酸、三氟乙酸或顺丁烯二酸所成的酸加成盐；或碱金属，例如钠、碱土金属，例如钙的盐或铵盐，例如，四(2-羟基乙基)铵盐。

本发明的环戊二烯并[g]喹唑啉的适宜的药学上可接受的酯形式是，例如，与最多至6个碳原子的脂族醇形成的酯，例如，甲基、乙基或叔丁基酯。

该化合物含三个羧基。盐或酯可为单-酸-二-盐或-酯、二-酸-单-盐或-酯，或甚至三-盐或-酯。优选R¹是C_1-4烷基或C_1-4羟基烷基。更优选R¹是甲基，或特别是羟基甲基。

优选R²是甲基、乙基、丙基、丙-2-烯基、丙-2-炔基、2-羟基-乙基、2-氟乙基、2-溴乙基或2-氰基乙基。更优选R²是甲基，或特别是丙-2-炔基。

优选Ar是可任选带一个或两个选自氯代和特别为氟代的取代基的1，4-亚苯基；噻吩-2，5-二基、噻唑-2，5-二基或吡啶-2，5-二基。更优选Ar是1，4-亚苯基或具有2-氟代取代基的1，4-亚苯基，如2，6-二氟代-1，4-亚苯基或特别是2-氟代-1，4-亚苯基，或是吡啶2，5-二基。最优选Ar是1，4-亚苯基或2-氟代-1，4-亚苯基。

本发明的优选的环戊二烯并[g]喹唑啉具有式(I)，其中R¹是C_1-4烷基或C_1-4羟基烷基，特别是羟基甲基；

R²是甲基、乙基、丙基、丙-2-烯基、丙-2-炔基、2-羟基乙基、2-氟乙基、2-溴乙基或2-氰基乙基；和

Ar是可任选带有一个或两个选自氯代且特别为氟代的取代基的1，4-亚苯基；噻吩-2，5-二基、噻唑-2，5-二基或吡啶-2，5-二基。

本发明的进一步优选的环戊二烯并[g]喹唑啉具有式(I)，其中R¹是甲基或羟基甲基；

R²是甲基或丙-2-炔基；和

Ar是1，4-亚苯基或具有2-氟代取代基的1，4-亚苯基，如2，6-二氟代-1，4-亚苯基或特别是2-氟代-1，4-亚苯基，或是吡啶2，5-二基。

本发明特别优选环戊二烯并[g]喹唑啉具有式(I)，其中R¹是甲基或羟基甲基；

R²是甲基或优选丙-2-炔基；和

Ar是1，4-亚苯基或2-氟代-1，4-亚苯基。

本发明的特别具体优选的环戊二烯并[g]喹唑啉是：

N-{N-{4-[N-(2-甲基-4-氧代-3，4，7，8-四氢-6H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基]苯甲酰基}-L-γ-谷氨酰基}-D-谷氨酸；或

N-{N-{4-[N-(2-羟基甲基-4-氧代-3，4，7，8-四氢-6H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基]苯甲酰基}-L-γ-谷氨酰基}-D-谷氨酸；或其药学上可接受的盐或酯；

以及这两个化合物的6S异构体。

尽管本发明化合物可以作为立体异构体的混合物存在，但优选的是将它们拆分为一种光学活性异构形式。这样的需要使该化合物的合成变得复杂，并且因此优选它们含尽可能少的不对称碳原子，以与实现所需的活性相符。

然而，如前所指出的，本发明的环戊二烯并[g]喹唑啉含至少三个不对称碳原子。在环系统的6位上的这些不对称碳原子优选具有6S取向而不是6R取向。上文描述的优选的化合物(I)因而优选在该不对称碳原子上具有这样的构型，或不优选为其中这些不对称碳原子的一个或两个未经拆分的的混合物。

可通过任何已知的可适用制备化学相关化合物的方法制备本发明的环戊二烯并[g]喹唑啉。

本发明的环戊二烯并[g]喹唑啉本身可为活性的，或可为在体内转化为活性化合物的前药。可将本发明的环戊二烯并[g]喹唑啉，以包含与药学上可接受的稀释剂或载体组合的环戊二烯并[g]喹唑啉的药用组合物的形式，给予包括人的温血动物。该组合物可为适宜口服使用的形式，例如，片剂、胶囊剂、水性或油性溶液剂、混悬剂或乳剂；适宜局部应用的形式，例如，乳膏剂、油膏剂、凝胶剂或者水性或油性溶液剂或混悬剂；适宜经鼻应用的形式，例如，嗅剂、鼻喷雾剂或滴鼻剂；适宜经阴道或直肠应用的形式，例如，栓剂；适宜经吸入给药形式，例如，作为细微粉碎的粉剂，诸如干粉剂、微晶形式或液体气雾剂；适宜经舌下或颊应用的形式，例如，片剂或胶囊剂；或适宜胃肠外应用的形式(包括静脉、皮下、肌肉内、血管内或输注应用)，例如，灭菌水性或油性溶液剂、乳剂或混悬剂。一般，可通过常规方式采用常规赋形剂制备以上的组合物。

通常环戊二烯并[g]喹唑啉将以动物的每平方米体表面积50-25000，特别为50-5000mg，即大约1500，特别为1-100mg/kg范围的剂量给予温血动物。然而，当需要时，可采用超出该范围的剂量，特别是，当优选的给药模式包括使用皮下输注时，则剂量范围可增大至1-1000mg/kg。优选采用的每日的剂量范围为10-250mg/kg，特别为30-150mg/kg。然而，每日剂量将必须依据被治疗的主体、特定的给药途径和被治疗的疾病的严重程度而作出变化。因此，可通过治疗任何具体患者的执业医师确定最佳剂量。

因此，本发明也包括在需要这样治疗的患者中治疗类风湿性关节炎或急性骨髓性白血病的方法，该方法包括给予所述患者有效量的如上文定义的环戊二烯并[g]喹唑啉衍生物。

通常以每平方米动物体表面积5-25000，特别为5-500mg，即大约0.1-500，特别为0.1-10mg/kg的剂量范围给予该化合物。然而，当需要时，可采用超出该范围的剂量。可采用局部给予本发明环戊二烯并[g]喹唑啉。因此，例如，对于局部给药，可采用的每天剂量范围在，例如，0.1-10mg/kg。

可以单位剂型，即以各自包含单位剂量或单位剂量的倍数或约数量的不连续部分的形式，例如，片剂或胶囊剂，配制含该喹唑啉的组合物。这样的单位剂型可，例如，含范围在1-250或1-500mg的一定量的环戊二烯并[g]喹唑啉。

通过以下实施例阐述本发明。

图的简述

图1：RA-滑膜组织的免疫组织化学：(A)兔同种型(isotype)染色、(B)FR-β染色和(C)巨噬细胞染色(3A5)的光学显微镜检查。(D)FR-β、(E)CD-68(巨噬细胞)以及(F)D和E的合并的免疫荧光(双重)染色。注意：核被染成蓝色(Dapi-染色)。

图2：(A)在MTX治疗前RA患者(n＝15)的滑膜组织中的3A5(巨噬细胞)和FR-β阳性细胞/mm²之间的相关性。滑膜里衬下层(sublining layer)/mm²的阳性细胞计数中值，对于FR-β为126(范围：9-630)而对于3A5为219(范围：11-622)。线性回归：R＝0.64；p＝0.04。(B)用MTX治疗4个月后的DAS28改善(ΔDAS28)和FR-β在巨噬细胞上的表达(阳性细胞/mm²)之间的相关性(R＝0.31；p＝0.11)。

图3：滑膜组织和离体培养的RA外周血淋巴细胞(PBLs)中的FR-βmRNA表达。在RA患者的外周血淋巴细胞(PBLs；n＝9)、单核细胞(n＝9)、离体培养的巨噬细胞(n＝25)、离体活化的T-细胞(n＝22)和滑膜组织(n＝7)中所测定的FR-βmRNA表达的中值。在这些样品中的FR-β表达显示为在CHO-β细胞(用FR-β转染的中国仓鼠卵巢(Chinese Hamster Ovarian)细胞；在这些细胞中的表达设定为1.00)中表达的百分率。

图4：对于新的一代叶酸拮抗剂，FR-α(白色柱)和FR-β(灰色柱)的相对结合亲合力。通过在材料和方法章节中描述的[³H]-叶酸置换FRα表达KB-细胞和FRβ转染的CHO-β细胞，测定药物的FR-α和FR-β结合亲合力。结合亲合力表现为相对叶酸结合亲合力的百分率。结果为3-5次分开的实验的均值±SD(SD＜30％)。为了比较，RFC对叶酸拮抗剂的亲合力表示为：基于先前公布的资料，++++(高亲合力)、+++(中等亲合力)、++(低亲合力)、+(亲合力差)、+/-(亲合力非常差)。

图5：由加或不加1μM叶酸的BGC 945(A)、CB300635(B)和增补或不增补叶酸(1μM)或亚叶酸(20nM)的AG2034(C/D)对CHO/WT和CHO/FR-β细胞的生长抑制。结果为3次实验的均值(SD＜20％)。

发明详述

实施例1：开发作为新的一代叶酸拮抗剂，以激活类风湿性关节炎患者滑膜组织中的巨噬细胞的潜在递送途径的叶酸受体-β

导言

叶酸拮抗剂甲氨蝶呤(MTX)是在治疗类风湿性关节炎(RA)患者中最广泛应用的缓解病情的抗风湿药物(DMARD)的锚定-药物。其或者作为单一药物使用或者与其它DMARDs(如，柳氮磺胺吡啶和羟基氯喹)联合使用，并且在大多数包括生物药剂(抗-TNFα或-CD20单克隆抗体)的治疗策略中MTX的应用是必要的。

MTX的细胞药理学的首要关键步骤是可由至少3种不同途径介导的细胞通路；还原型叶酸载体(RFC)、膜-相关叶酸受体(MFR)或质子偶合(低pH)叶酸转运蛋白(PCFT)。后者转运蛋白主要涉及肠内叶酸摄取。其它转运途径通过促进天然还原型叶酸辅因子和叶酸拮抗剂如MTX的摄取保持着免疫活性细胞(immune competent cells)的生理和药理学关联性。RFC和MFR在(抗)叶酸摄取(跨膜载体对内吞作用/饮液作用(potocytosis)、底物特异性(低亲合力叶酸/高亲合力MTX对高景合力叶酸/低亲合力MTX)和组织特异性(组成型表达对限制性表达)的机制上有所不同。

对于MFR，已经鉴定三种同工型(α、β和γ)。MFR的α-同工型体在特殊类型的癌症(卵巢癌)中过度表达，而γ-同工型是来自造血细胞的分泌蛋白。已经描述FR-β同工型在RA患者和关节炎动物模型的发炎的滑膜液中活化的巨噬细胞上的选择性表达。随后，FR-β被公认为对于关节炎成像和对于在治疗上的选择性抗体-引导的或叶酸-偶联物引导的毒素和其它小分子/高分子的传递是有吸引力的标靶。迄今为止，仅已在癌症细胞/组织过度表达FRα上探究用叶酸拮抗剂靶向FR。

在过去的几十年，已经从围绕抗MTX的公共机制的观点设计并临床评价第二代叶酸拮抗剂，所述机制包括经由RFC削弱的转运、有缺陷的聚谷氨酰基作用(polyglutamylation)、增强的标靶酶DHFR的活性和/或增加的药物流出。基于该背景，第二代抗叶酸剂(antifolates)包括更有效经由RFC转运、更有效聚谷氨酰基作用或独立的聚谷氨酰基作用，或靶向叶酸代谢中的除DHFR外的其它关键酶，如，胸苷酸合成酶(TS)或甘氨酰胺核糖核苷酸转甲酰基酶(transformylase)的化合物。在本研究中，发明人开始调查独特的第二代抗叶酸剂是否可用作对于RA患者滑膜组织中FR-β表达细胞和/或免疫活性细胞的选择性靶向药物。发明人已经确定TS抑制剂BGC 945为实现高FR-β结合亲合力和低RFC亲合力标准，因此使在FR-β表达细胞中能选择性摄取药物的原型抗叶酸药物。

材料和方法

药物

叶酸自Sigma Chem.Co，St.Louis，MO获得，L-亚叶酸自Merck Eprova，Schaffhausen，瑞士获得，甲氨蝶呤自Pharmachemie，Haarlem，Netherlands和培美曲塞(Pemetrexed)/(Eli Lilly)经由Vumc药学部获得。以下叶酸拮抗剂药物自指定的公司/研究所获得；雷替曲塞(Raltitrexed)//ZD 1694(AstraZeneca，UK)、PT523和PT644(Dr.A.Rosowsky，Harvard Medical School，Boston，MA)、G W1843(Glaxo Welcome，USA)、CB300635(Institute of Cancer Research，Sutton，UK)、BGC 9331和BGC 945(6RS和6S)(BTG International Limited，London，UK)、5，10-二脱氮四氢叶酸(DDA THF)(Eli Lilly，Indianapolis，IN)和AG2034(Agouron/Pfizer Pharmaceuticals，San Diego，CA)。在表2和3中描述了这些叶酸拮抗剂的化学结构。[3′，5′，7，9-³H]叶酸(20-40Ci/mmol，MT783)购自Moravek，Brea，CA。

细胞系

使野生型中国仓鼠卵巢(CHO-WT)细胞、用FR-β转染的CHO细胞(CHO-FR-β)和表达FR-α的人鼻咽表皮样瘤KB细胞(美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)，Manassas，VA)生长在补充了10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、0.15mg/ml脯氨酸和100单位/ml青霉素和链霉素的无叶酸的RPMI 1640培养基(Gibco，Grand Island，NY)中。CHO-FR-β和KB细胞的[³H]叶酸结合能力分别为0.5-1pmol/10⁶细胞和20-40pmol/10⁶细胞。将人单核细胞-巨噬细胞THP1细胞(美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)，Manassas，VA)生长在补充了10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、0.15mg/ml脯氨酸和100单位/ml青霉素和链霉素的、含2.2μM叶酸的RPMI 1640培养基(Gibco，Grand Island，NY)中。所有细胞系均保存在37℃的含5％CO₂的潮湿空气中。

滑膜组织样本

在本研究中，发明人分析了源自15位处于治疗前和用MTX(MTX的起始剂量：7，5mg/周；在12周内逐步增加至15mg/周)治疗4个月后的活动期疾病的RA-患者的膝关节的滑膜组织活组织切片。活动性疾病定义为≥6个肿胀或触痛关节和对医师的和患者的疾病活性的中等或更差水平的评估(疾病活性评分-28；DAS-28)。所有患者至少临床累及1个膝关节。允许用低剂量泼尼松(＜10mg/天)和伴随的稳定剂量的非甾体抗炎药物(NSAID)治疗。在纳入本研究之前，没有患者曾经使用过MTX。在使用其它的DMARDs的患者中，终止治疗后历经28天的廓清期(washout phase)。如先前作为被莱顿大学医学中心(荷兰)医学伦理委员会(Medical Ethics committees of Leiden University Medical Center(Netherlands))和利兹大学医学中心(UK)(Leeds University Medical Centre(UK))认可的关节研究的部分所描述的内容，实施关节(内窥)镜检查操作(arthroscopy procedure)。参见Arthritis Rheum.2002；46(8)：2034-2038和2000；43(8)：1820-1830(均由Kraan等著)。

发明人将7例来自机械性关节损伤的患者的样本纳入非炎症对照滑膜组织，所述样本由荷兰，阿姆斯特丹，VU大学医学中心整形外科系(VU University Medical Center，Amsterdam，Netherlands)Dr.B.J.van Royen提供。为了收集周围血液样本，所有患者签署知情同意表，并且对于“DMARD耐药性”的研究经荷兰，阿姆斯特丹，VU大学医学中心医学伦理委员会认可。

FR-β免疫组织化学

采用如先前所描述的3-步免疫过氧化酶方法，对来自RA患者和对照组的滑膜组织活检组织进行低温恒温器切片(4μm)免疫组织化学染色。参见Cancer Res.2001；61(8)：3458-3464(Maliepaard等)和2000；60(18)：5269-5277(Scheffer等)。用FR-β(稀释度1∶3000)，同种型(isotype)对照组：正常兔-血清的特异性抗体染色切片。分别用3A5(稀释度1∶100)和抗-CD3-PE(稀释度1∶25；Dako，Glostrup，Denmark)单克隆抗体(同种型对照组：鼠免疫球蛋白)染色巨噬细胞和T-细胞。将生物素化的猪抗-兔IgG(Dako；稀释度1∶200)和兔抗-鼠IgG(Dako；稀释度1∶300)用作次级抗体。采用0.4mg/ml AEC(氨基乙基咔唑)显色。在用苏木素对比染色后，封片。如先前所描述的，通过数字影像分析法，分析染色的切片的FR-β、3A5和CD3表达。参见Arthritis Res.Ther.2005；7(4)：R862-R867(Haringman等)。简言之，为了将各标记代表的区域用于图像采集，使用400x放大倍率。用3-像素重叠将这些区域分成6个高倍视野(hpfs)。通过分析18个连续的hpfs，对每mm²内膜里衬层和滑膜里衬下层的阳性细胞的损伤数目计数，评估阳性细胞。

双重-标记的免疫荧光

通过猪-抗-兔HRP-标记的抗体(稀释度1∶200；Dako，Glostrup，Denmark)探测FR-β并且依据制造商的说明书，用若丹明/thyramine(红色荧光素)显色(稀释度1∶1000)。通过利用链霉亲和素Alexa-488作为底物(稀释度1∶750；绿色荧光素；Molecular Probes，Eugene，OR)的山羊-抗-鼠生物素化的抗体(稀释度1∶100；Dako，Glostrup，Denmark)探测CD68。用含1μg/ml DAPI(用于核染色)(Vector Laboratories Inc.，Burlingame，CA)的Vectashield封片。用荧光显微镜(Leica DMRB，Rijswijk，Netherlands)检查细胞。

分离RA-患者外周血细胞和培养条件

通过对Ficoll-Paque Plus(Amersham Pharmacia Biotechnologies，UK)进行梯度离心法(于400×g 35分钟)，从新鲜获得的血液样本中分离外周血单核细胞。离心后，小心收集核分裂间期细胞(interphase)并用补充了1％BSA的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次。计数淋巴细胞部分并将其再悬浮于含10％FCS、2mM L-谷氨酰胺和100μg/ml青霉素和链霉素的IMDM培养基(Invitrogen，Breda，Netherlands)中。于37℃在培养瓶中孵育2小时后，通过粘着分离单核细胞，随后通过在10ng/ml巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)(Strathmann Biotech，Hamburg，Germany)的存在下，培养单核细胞7天使RNA提取或巨噬细胞分化。

通过以1×10⁶个细胞/ml密度，用单克隆抗-CD28(5μg/ml，CLB-CD28/lSanquin，Amsterdam，Netherlands)和抗-CD3(1μg/ml，CLB-T3/4.E，Sanquin，Netherlands)，在山羊抗-鼠(Dako，Glostrup，Denmark)涂布的24孔板中孵育，收集单核细胞粘着后留在混悬液中的外周血淋巴细胞(PBLs)，用于RNA分离或用于T-细胞激活。48小时刺激后，收集活化的T-细胞用于RNA分离和通过使用流式细胞仪(floW-cytometry)(FACScalibur，Becton & Dickinson)检测CD25表达来测定活化状态。

在RA-患者的滑膜组织和外周血细胞中的FR-βmRNA表达

使用Qiagen RNeasy Plus分离试剂盒(Qiagen，Venlo，Netherlands)，按照制造商提供的说明书分离自RA患者的自滑膜组织的RNA(n＝7)、PBLs(n＝9)、单核细胞(n＝9)、巨噬细胞(n＝25)和活化的T-细胞(n＝22)。在RNA分离之前，通过在液氮中添加RPE缓冲液后预冷的研钵中研磨冷冻的滑膜组织样本，将它们粉碎。使用NanodropND-1000分光光度计(Nanodrop Technologies，Wilmington，USA)测定RNA总浓度。先前描述的实时逆转录-PCR(RT-PCR)方法被用于同时检测FR-β和甘油醛-3-磷酸盐(内参基因)的mRNA水平。参见Cancer Res.2006；66(11)：5875-5882(Qi等)。

采用自Applied Biosystems(Foster City，CA)的Taqman Reverse Tran-script Reagents，按照制造商的方案，实施逆转录步骤。简言之，在逆转录酶中，将400ng的总RNA与随机六聚物引物(random hexamer primers)(50μmol/L)、RN酶抑制剂(1个单位/μL)、MultiScribe逆转录酶(5个单位/μL)和三磷酸脱氧核苷混合物(各为2.5mmol/L)混合。首先将10-μL反应混合物于25℃孵育10分钟，然后于48℃孵育30分钟和最后于95℃孵育5分钟。

在12.5μL的PCR Mastermix(Applied Biosystems)、各0.5μL的正向引物和反向引物(CTGGCTCCTTGGCTG-AGTTC，′GCCCAGCCTGGTTATCCA)和0.5μL的Taqman探针(6FAM-TCCTCCCAGACTACCTGCCCTCAGC-TAMERA)的存在下，实施后来的对于FR-β的实时PCR步骤。控制GAPDH基因的引物和Taqman探针购自Applied Biosystems。PCR条件为于50℃下2分钟，然后于95℃下10分钟，随后于90℃下每次15秒40个循环，最后于60℃下1分钟。采用Gene Amp 5700序列探测系统(AppliedBiosystems)监测并记录所产生的荧光数据。所有样本按一式三份设立并规格化为GAPDH值。

对新的一代叶酸拮抗剂的FR-β/FR-α和RFC结合亲合力的分析

基本上如先前所描述的实施竞争性结合[³H]-叶酸和对FR-β和FR-α的新的抗-叶酸药物的完整的细胞结合试验。参见Mol.Pharmacol.1995；48：459-47和CancerRes.1995；55(17)：3795-3802(两者均为Westerhof等)。简言之，通过在PBS+1mM EDTA上孵育，将CHO-β细胞(FR-β转染的中国仓鼠卵巢细胞)和KB细胞(FR-α表达细胞)分开。将分离的细胞悬浮于冰冷的HEPES-缓冲盐水(140mM NaCl、20mMHEPES、6mM KCl、2mM MgCl₂、6mM D-葡萄糖，用NaOH调节至pH 7.4)中，分别至细胞浓度为3×10⁶和1×10⁶个细胞/ml。将1ml的细胞悬液加至含在缺乏或存在递增浓度的天然叶酸或叶酸拮抗剂下的100pmol[³H]-叶酸(比放射性：2,000dpm/pmol)的一系列Eppendorf管中。于4℃下，10分钟后，将细胞在Eppendorf离心管中离心(30s，10,000rpm)，吸取上清液，将细胞团块再悬浮于200μl水中并分析放射性(Optima Gold闪烁液，United Technologies，Packard，Brussels，Belgium)。通过在1000-倍摩尔过量的未标记的叶酸的存在下检测细胞-相关放射性测定[³H]的非特异结合(通常＜2％特异性结合)。测定需要从FR-β或FR-α置换50％的[³H]叶酸的天然叶酸和选择的叶酸拮抗剂的浓度并且呈现为相对于叶酸的结合亲合力。为了比较，自先前的研究提出天然叶酸和叶酸拮抗剂的RFC的亲合力的数据。参见Mol Pharmacol 1995；48：459-471 Westerhof等)和Cancer Res.2005；65(24)：11721-11728(Gibbs等)。

细胞增殖抑制试验以1×10⁴/cm²的密度将CHO-WT和CHO-FRβ细胞接种于24-孔组织培养板的各孔中。24小时后，加入在缺乏或存在(阻断FR)1μM叶酸下的8个浓度(以2.5-倍增量递增)的叶酸拮抗剂药物。72小时孵育后，如先前所描述的，通过胰蛋白酶化作用收获细胞并计数，以了解细胞发育能力。参见Mol. Pharmacol.1999；55(4)：761-769(Jansen等)。

在其它实验中，用人单核-巨噬细胞THP1细胞测试叶酸拮抗剂的抗增殖作用。最后，将含1.25×10⁵个细胞的1ml的细胞悬液置于24-孔组织培养板的各孔中并与8个浓度(以2.5-倍增量递增)的叶酸拮抗剂一起孵育。在72小时药物暴露后，用血球计进行细胞计数和通过台盼蓝染色排除法(trypan blue exclusion)检查发育能力。

结果

FR-β滑膜组织免疫组化

所有RA滑膜组织的免疫组化染色显示在内膜里衬层以及滑膜里衬下层高度表达FR-β。FR-β的染色模式与3A5(巨噬细胞)染色一致，尽管T-细胞区域显示无染色(图1A-C)。实际上，更详细的荧光显微镜分析证实FR-β和CD68(巨噬细胞标记物)共同定位于滑膜组织浸润巨噬细胞和内膜巨噬细胞的细胞膜上(图1D-F)。在整形外科对照组的非炎性滑膜组织中，未观察到对FR-β的染色，与数目低的巨噬细胞(未显示)一致。

通过计算机辅助的数字影像分析法分析染色结果。发现滑膜里衬下层中的3A5和FR-β表达(细胞计数/mm²)之间存在显著相关性(p＝0.04)(图2A)。滑膜里衬下层/mm²中的阳性细胞计数中值，对FR-β为126(范围9-630)，而对3A5为219(范围11-622)。巨噬细胞的中值数在用MTX治疗后4个月后减少(滑膜里衬下层/mm²中的阳性细胞计数自219减至119，p＝0.14)。在用MTX治疗4个月后，FR-β表达与DAS28改善(ΔDAS28)正相关(r＝0.31)，但是并未达到统计学上的显著性意义(p＝0.11)(图2B)。

RA患者的RA-滑膜组织和外周血细胞中的FR-βmRNA表达

为了进一步确认滑膜组织中FR-β的差异表达，通过滑膜组织活组织切片检查的PCR分析，测定FR-βmRNA水平，与RA-患者的外周血细胞，包括淋巴细胞、体外活化的T-细胞和外周血液单核细胞和离体单核细胞-衍生的巨噬细胞中的FR-βmRNA水平进行比较。用相对于CHO-FR-β细胞(设定为100％)呈现FR-βmRNA水平。FR-βmRNA表达排列为RA-滑膜组织最高(与CHO-β细胞比较，中值为17％)＞离体单核细胞-衍生的巨噬细胞(与CHO-β细胞比较，3％)＞外周血淋巴细胞(PBLs)(0.7％)＞＞单核细胞(0.02％)和离体活化的T-细胞(＜0.001％)(图3)。

FR-β和FR-α对叶酸拮抗剂的结合亲合力的比较

FRα对选择的叶酸拮抗剂的结合亲合力先前已由Westerhof等报告，但是它们与FR-β同工型重叠或差异至何程度尚未确定。为此目的，测定由FR-β与FRα相比较的对DHFR、TS和GARTF酶的一系列叶酸-基抑制剂的结合亲合力，并且在图4中显示。至于叶酸，FR-β与FRα两者均展示对该组DHFR的叶酸拮抗剂抑制剂的相当低的亲合力。FR-β对MTX的结合亲合力大约比叶酸的低50-倍。对PT523的结合亲合力比对MTX(0.3％的叶酸)的显著低，而PT644，PT523的5-甲基类似物，显示与MTX相当的亲合力。众所周知，FR-α对于所有的测试的叶酸-基TS抑制剂展示出良好的结合亲合力，但是FR-β对培美曲塞、雷替曲塞和BGC 9331的结合亲合力比FRα的显著低(16-30倍)。观察到FR-β对TS抑制剂CB300635(叶酸的161％)和(6RS)-BGC 945(叶酸的89％)和(6S)-BGC 945(叶酸的46％)的高结合亲合力的保持力。FR-β也展示出对GARTF酶抑制剂DDATHF(叶酸的27％)和AG2034(叶酸的54％)的特异性(proficient)结合亲合力，即使是FRα对这些化合物的结合亲合力为2.5-倍高。综合起来，这些结果证明FR-β对叶酸拮抗剂的结合亲合力存在大的差异，其中多个叶酸拮抗剂比MTX显示显著较高的结合亲合力。

叶酸拮抗剂诱导的FR-β表达细胞的生长抑制

为了调查用于目前研究的叶酸拮抗剂是否将全部转达(convey)对巨噬细胞-样类型的细胞的潜在生长抑制作用，此参数被用于调查人单核细胞-巨噬细胞THP1细胞(表1)。与RFC作为THP1细胞中主要转运途径一致的是，观察到所有叶酸拮抗剂的强有力的生长抑制作用，除了CB300635和BGC 945，这两个化合物对RFC的亲合力差。由于THP1细胞系模型是FR-阴性的(与活化的滑膜巨噬细胞对比)，对FR-β显示最高结合亲合力的三个叶酸拮抗剂(CB300635、AG2034和BGC945)的效能进行评价，该效能通过激发CHO-FR-β细胞的细胞生长抑制而靶向FR-β。对抗CHO/WT细胞，BGC 945仅在细胞外浓度＞1000nM时诱导生长抑制(图5A)。显著地，在显著低的BGC 945浓度(10-50nM)诱导CHO/FR-β细胞的生长抑制。向这些细胞培养物中加入的叶酸使BGC 945的活性完全消除，与FR的阻断一致。尽管显示对FR-β的最高结合亲合力，CB300635没有显著地诱导CHO/FR-β细胞中的生长抑制的效力(图5B)。共同-给予叶酸消除CB300635活性的信息提示，FR-β涉及细胞对该化合物的摄取。最后，AG2034可利用两种组成型表达的RFC和FR作为细胞进入的通路(图5)。如此，AG2034显示对抗CHO/WT细胞的生长抑制潜力并且在更大程度上显示对CHO/FR-β细胞的生长抑制潜力(图5C/D)。始终如一地，通过FR-β阻断(用叶酸)和RFC阻断(用LV)消除AG2034的生长抑制作用仅为部分的(图5C/D)。

讨论

由于MTX是治疗RA的许多治疗方案中的锚定-药物，对可辅助预知和/或改善MTX的治疗反应的遗传学、生化和代谢参数的描述已经获得相当可观的最新利益。该项研究特别集中在细胞膜转运MTX的作用上，该作用在活化的滑膜巨噬细胞中主要由叶酸受体β同工型介导。给出的注意是FRs的分子和功能特性以及组成型表达的RFC有相当差异，FR-β的更好理解的特性可通过FR-β超过RFC的选择性靶向来促进更有利的治疗窗。

发明人在本文显示，FR-β表达主要与巨噬细胞共同定位于RA患者的内膜里衬层和滑膜里衬下层，并且可因此为有吸引力的叶酸拮抗剂的标靶。对第二代叶酸拮抗剂系列的结合亲合力进行筛选，其中的一些证明具有抗癌活性，揭示该组DHFR抑制剂均具有相当低的FR-β亲合力。此与先前报告的、证明FR的α同工型对具有2，4-NH₂-基结构的叶酸拮抗剂的亲合力低的结构活性关系一致(参见表2)。有趣的是，虽然证明FRα对所有测试的胸苷酸合酶的叶酸-基抑制剂具有相对高的结合亲合力，对于FR-β而言，此仅保留分享3-环结构和/或谷氨酸盐侧链修饰的共同的化学特性的3个化合物(CB300635、GW1843和BGC 945)(参见表2和3)。后者的修饰也显著抑制其经由RFC的转运能力，并且因而使之产生更大的FR-选择性。实际上，通过BGC 945的选择性靶向FR-α而非RFC在FRα过表达细胞系中得到证明。除了叶酸-基TS抑制剂外，还有FR-β也展示出对分类为可经由RFC和FR两者转运的叶酸拮抗剂药物的叶酸-基GARTF酶抑制剂(AG2034和DDATHF)的中等至高的结合亲合力。

FR-β-转染的CHO细胞被用作模型系统，以评估通过传达抗增殖作用的FR-β-介导的细胞摄取叶酸拮抗剂的功效。该细胞系模型可具临床代表性，其以与RA患者滑膜组织中的FR-βmRNA水平一致的[3H]-叶酸结合水平和FR-βmRNA水平(图4)为基础。观察到对于BGC

945，对照组(RFC-表达)CHO细胞和FR-β转染的细胞之间的活性的最大差异，与经由RFC转运的差亲合力和高FR-β结合亲合力相一致。FR-β介导的BGC 945的摄取可通过阻断受体与过量的叶酸接触而被抑制剂，此意味着使滑膜组织/血浆中天然叶酸循环，可或者通过受体占领/竞争或者通过受体向下调节削弱体内BGC 945的潜在活性。

实施例2：本发明的化合物

表3显示以下本发明化合物的结构：

·CB300638(BGC 638)        ·CB300944

·(6S)-CB300638            ·CB300945(BGC 945)

·CB300935                 ·(6S)-CB300945

·CB300936                 ·CB300947

·CB300940                 ·CB300951

依据在WO 94/11354 A1、WO 03/020300 A1、WO 03/020706 A1、WO 03/020748 A1、J Med.Chem.，2000，43，1910-1926、Tetrahedron，63(7)，2007，1537-1543(Bavetsias等)和Cancer Research65，2005，11721-11728(Gibbs等)中给出的方法制备这些化合物。

实施例3：制剂

以下阐述在人中的治疗或预防应用的、含式(I)的环戊二烯并[g]喹唑啉，特别是药学上可接受的盐的形式的代表性药物剂型：

(a)片剂I                     mg/片

环戊二烯并[g]喹唑啉盐        100

乳糖Ph.Eur.                  182.75

交联羟甲纤维素钠             12.0

玉米淀粉糊(5％w/v糊剂)       2.25

硬脂酸镁                     3.0

(b)片剂II                    mg/片

环戊二烯并[g]喹唑啉盐        50

乳糖Ph.Eur.                  223.75

交联羟甲纤维素钠             6.0

玉米淀粉                     15.0

聚乙烯吡咯烷酮(5％w/v糊剂)   2.25

硬脂酸镁                     3.0

(c)片剂III                   mg/片

环戊二烯并[g]喹唑啉盐        1.0

乳糖Ph.Eur.                  93.25

交联羟甲纤维素钠             4.0

玉米淀粉糊(5％w/v糊剂)       0.75

硬脂酸镁                     1.0

(d)胶囊剂                    mg/胶囊

环戊二烯并[g]喹唑啉盐        10.0

乳糖Ph.Eur.                  488.5

硬脂酸镁                     1.5

(e)注射剂I                   (50mg/ml)

环戊二烯并[g]喹唑啉盐        5.0％w/v

1M氢氧化钠溶液               15.0％v/v

0.1M盐酸(调节pH至7.6)

聚乙二醇400                  4.5％w/v

注射用水至100％

(f)注射剂II                  (10mg/ml)

环戊二烯并[g]喹唑啉盐        1.0％w/v

磷酸钠BP                     3.6％w/v

0.1M氢氧化钠溶液             15.0％v/v

注射用水至100％

(g)注射剂III                 (1mg/ml，缓冲至pH 6)

环戊二烯并[g]喹唑啉盐        0.1％w/v

磷酸钠BP                     2.26％w/v

柠檬酸          0.38％w/v

聚乙二醇        4003.5％w/v

注射用水至100％

可通过药学领域熟悉的常规方法制备以上制剂。可采用常规措施，例如，用邻苯二甲酸二乙酸纤维素包衣料对片剂(a)至(c)进行肠溶包衣。

表1.叶酸拮抗剂对抗人单核细胞-巨噬细胞THP1细胞^#的生长抑制作用

表2：比较性化合物的结构

表3：本发明化合物的结构