基于辣根过氧化物酶-多孔植酸锆纳米粒子修饰玻碳电极的电化学生物传感器的制备方法

摘要

本发明公开了基于辣根过氧化物酶-多孔植酸锆纳米粒子修饰玻碳电极的电化学生物传感器的制备方法，将ZrOCl2酸性溶液，滴加入植酸钠溶液中，反应1h。冷却后离心，用超纯水再分散，制得纳米多孔植酸锆胶体；在抛光处理后的玻碳电极表面，滴适量植酸锆胶束分散液，晾干；然后将辣根过氧化物酶溶液滴到纳米植酸锆修饰的玻碳电极上，晾干；再滴加适量全氟磺酸溶液，晾干得到玻碳电极。本发明的优点是：制备了具有多孔结构的植酸锆胶体分散液，并将其用于固定生物酶，保持了酶的生物活性，实现了酶与电极间的直接电子转移；制备方法简单；对过氧化氢检测的响应时间较短，检测限低，重现性和稳定性好。

说明书

技术领域

本发明涉及一种电化学生物传感器，具体为基于辣根过氧化物酶-多孔植酸锆纳米粒子修饰玻碳电极的电化学生物传感器的制备方法。 

背景技术

生物活性酶的固定化是生物传感器制备过程中必经的步骤，选择一种合适的固定材料是提高生物传感器性能的关键因素之一，对传感器的各项性能起决定作用。因此，在过去的一段时间里，人们做了大量的工作以寻找合适的材料来固定生物酶和蛋白质。这些材料必须能够确保蛋白质在固定的过程中不发生失活，团聚，最重要的是不会破坏蛋白质的结构和性质。近年来，纳米材料在生物传感器领域的应用受到人们的广泛关注。由于纳米粒子具有比表面积大、表面活性中心多、催化效率高、吸附能力强、表面活性高等优点，由纳米粒子制成的生物传感器与传统的传感器相比，其尺寸减小、精度提高，而且具有庞大的界面，提供了大量物质通道，导通电阻很小，有利于传感器向微型化发展。另外，纳米技术引入化学和生物传感器领域后，提高了化学和生物传感器的检测性能，检测灵敏度大幅提高，检测的反应时间也得以缩短，并且可以实现高通量的实时检测分析。而且，大量的研究工作已经证明，纳米材料，例如：纳 米多孔材料，纳米层状材料，纳米片状材料，还有分子筛等等，是生物传感器中非常有前景的生物活性酶的固定材料。纳米ZrO₂和α-ZrP材料硬背成功的应用在固定蛋白质上。尽管纳米ZrO₂具有好的生物相容性，高比表面积，以及低毒性等优点，但是由于机械强度差，易脱落，而限制了其在生物传感器中的应用。同样的，由于α-ZrP材料导电性和酶固载能力差，很难实现酶与电极间的直接电子转移，也限制了它的应用。植酸及其盐，作为植物中磷元素的主要储存形式，具有较好的生物亲和性，是一种环境友好型试剂。植酸分子中的6个磷酸基与正电荷的金属离子和蛋白质具有很强的络合作用，是一种理想的螯合剂。目前，已有工作应用植酸作为分子联接剂与纳米粒子层层组装固定蛋白质，并研究了蛋白质的直接电化学。 

迄今为止，国内外尚未有利用多孔纳米植酸锆制备的检测过氧化氢生物传感器。所以发明一种响应快速，检测限低，灵敏度高，稳定性及重现性好的检测过氧化氢的生物传感器是一个迫切需要解决的重要技术问题。 

发明内容

本发明的目的是为了提供基于辣根过氧化物酶-多孔植酸锆纳米粒子修饰玻碳电极的电化学生物传感器的制备方法。这种传感器响应时间较短，检测限低，稳定性及重现性好。 

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现。 

基于辣根过氧化物酶-多孔植酸锆纳米粒子修饰玻碳电极的电化学生物传感器的制备方法，具体步骤如下： 

1)将0.001mol/L的植酸钠(IP₆)溶液加热至80～100℃，然后将0.001mol/L 的ZrOCl₂酸性溶液，在不断搅拌下缓慢滴加入上述溶液中，反应1h、冷却后离心，用超纯水再分散；通过直接沉淀法，制得纳米多孔植酸锆胶体； 

2)在抛光处理后的玻碳电极表面(7mm²)，滴3μL植酸锆胶体分散液，置冰箱内于4℃温度下晾干； 

3)将3μL 5mg/mL的辣根过氧化物酶(HRP)溶液通过滴涂法固定到纳米植酸锆修饰的玻碳电极上，置冰箱内于4℃温度下晾干； 

4)再滴加3μL 1％全氟磺酸(Nafion)溶液，置冰箱内于4℃温度下晾干，即制得辣根过氧化物酶-植酸锆修饰的玻碳电极。 

步骤1)中， 

所述的植酸钠和ZrOCl₂溶液的体积比为1∶3。 

所述的超纯水的电阻率大于18MΩ*cm。 

离心机的转速为5000rpm～7000rpm。 

步骤3)中，辣根过氧化物酶溶液为的辣根过氧化物酶溶解于pH为7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)中。 

利用植酸钠中磷酸键与金属离子的强络合能力，通过直接沉淀法合成了一种多孔植酸锆纳米材料，并且通过透射电子显微镜(TEM)和场发射扫描电子显微镜(FESEM)对其形貌进行了表征。另外，我们通过滴涂法将植酸锆多孔膜修饰到电极表面，进而固定辣根过氧化物酶(HRP)构建过氧化氢传感器，研究了它的电化学行为。紫外可见吸收光谱和电化学结果表明，由于植酸锆良好的生物亲和性，固定的HRP保持了其生物活性，实现了与电极间的直接电子转移。制得的生物传感器对过氧化氢的检测具有检测限低，响应时间短，生物亲和性高等优点。 

本方法中用多孔植酸锆制备的修饰电极，不仅将HRP很好的包埋于孔的内部，而且由于纳米多孔结构增加了电极表面的比表面积，从而极大的提高了电极表面酶的固载量。另外这种多孔结构为酶提供了良好的生物亲和性的环境，保持了其生物活性，实现了对H₂O₂的准确测定。 

本发明的优点是： 

1、制备方法简单，绿色环保，成本低。 

2、制备了具有多孔结构的植酸锆胶体分散液，并将其用于固定生物酶，保持了酶的生物活性，实现了酶与电极间的直接电子转移，实现了对H₂O₂的准确测定，且可以将其应用于医用消毒水中过氧化氢含量的检测。 

3、生物亲和性好，检测限低，重现性和稳定性好。 

附图说明

图1为传感器的制备过程简图； 

图2为A为纳米植酸锆分散液的TEM图，B是纳米植酸锆在电极表面的FESEM图； 

图3为纳米植酸锆的光电子能谱(XPS)图； 

图4为Zr-IP₆(a)HRP in PBS(b)和HRP与Zr-IP₆混合液(c)的紫外可见吸收光谱图； 

图5为不同修饰层数的电极的电化学交流阻抗图：(a)bare GCE，(b)Zr-IP₆/GCE，(c)HRP/Zr-IP₆/GCE，(d)Nafion/HRP/Zr-IP₆/GCE； 

图6为不同修饰电极的循环伏安曲线：(a)bare GCE(b)Nafion/Zr-IP₆/GCE(c)Nafion/HRP/Zr-IP₆/GCE，扫速：300mv/s； 

图7为传感器Nafion/HRP/Zr-IP₆/GCE对不同浓度H₂O₂的循环伏安曲线； 

图8为传感器Nafion/HRP/Zr-IP₆/GCE在PBS(pH 7.0)中连续加入H₂O₂的计时电流响应曲线(A)，响应电流与H₂O₂浓度的标准曲线(B)，工作电位：-0.23V。 

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明的技术方案做进一步说明。 

电化学实验在CHI 660D型电化学工作站(上海辰华仪器有限公司)上进行。TEM图由JEOL-JEM200CX型透射电镜得到；FESEM图在Hitachi S-4800型扫描电子显微镜测得；XPS图由PHI 5000Versa Probe型X-射线光电子能谱仪得到；紫外-可见(UV-vis)光谱实验采用UV-8500型紫外-可见分光光度计(上海天美科学仪器有限公司)；其他仪器为FE20实验室pH计(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；SK2200H超声仪(上海科导超声仪器有限公司)。 

实施例1 

基于多孔植酸锆纳米粒子制备的辣根过氧化物酶(HRP)生物传感器的制备方法：将0.001mol/L的ZrOCl₂酸性溶液，在不断搅拌下缓慢滴加入0.001mol/L加热至90℃的植酸钠溶液中(植酸钠和ZrOCl₂溶液的体积比为1∶3)，反应1h。冷却后离心(7000rpm)，用超纯水(＞18MΩ*cm)清洗，再分散，制得纳米多孔植酸锆胶体；取3μL植酸锆胶束分散液滴在倒置的处理干净的玻碳电极表面，置于冰箱内(4℃)晾干；然后将3μL 5mg/mL的辣根过氧化物酶(HRP)溶液(pH＝7.4PBS)滴到纳米植酸锆修饰的玻碳电极上，冰箱内(4℃)晾干；最后，滴加3μL1％全氟磺酸(Nafion)溶液于修饰电极表面，并置于冰箱内(4℃)晾干，即制得辣根过氧化物酶-植酸锆修饰的玻碳电极。 

实施例2 

基于多孔植酸锆纳米粒子制备的辣根过氧化物酶(HRP)生物传感器的制备方法：将0.001mol/L的ZrOCl₂酸性溶液，在不断搅拌下缓慢滴加入0.001mol/L加热至80℃的植酸钠溶液中(植酸钠和ZrOCl₂溶液的体积比为1∶3)，反应1h。冷却后离心(6000rpm)，用超纯水(＞18MΩ*cm)清洗，再分散，制得纳米多孔植酸锆胶体；取3μL植酸锆胶束分散液滴在倒置的处理干净的玻碳电极表面，置于冰箱内(4℃)晾干；然后将3μL 5mg/mL的辣根过氧化物酶(HRP)溶液(pH＝7.4PBS)滴到纳米植酸锆修饰的玻碳电极上，冰箱内(4℃)晾干；最后，滴加3μL1％全氟磺酸(Nafion)溶液于修饰电极表面，并置于冰箱内(4℃)晾干，即制得辣根过氧化物酶-植酸锆修饰的玻碳电极。 

实施例3 

基于多孔植酸锆纳米粒子制备的辣根过氧化物酶(HRP)生物传感器的制备方法：将0.001mol/L的ZrOCl₂酸性溶液，在不断搅拌下缓慢滴加入0.001mol/L加热至100℃的植酸钠溶液中(植酸钠和ZrOCl₂溶液的体积比为1∶3)，反应1h。冷却后离心(5000rpm)，用超纯水(＞18MΩ.cm)清洗，再分散，制得纳米多孔植酸锆胶体；取3μL植酸锆胶束分散液滴在倒置的处理干净的玻碳电极表面，置于冰箱内(4℃)晾干；然后将3μL 5mg/mL的辣根过氧化物酶(HRP)溶液(pH＝7.4PBS)滴到纳米植酸锆修饰的玻碳电极上，冰箱内(4℃)晾干；最后，滴加3μL1％全氟磺酸(Nafion)溶液于修饰电极表面，并置于冰箱内(4℃)晾干，即制得辣根过氧化物酶-植酸锆修饰的玻碳电极。 

Nafion/HRP/Zr-IP₆/GCE的制备过程如图1所示。 

通过透射电镜(TEM)和场发射扫描电子显微镜(FESEM)考察了植酸锆 胶体分散液及其在电极表面的形貌如图2所示，图2A是植酸锆胶体分散液的TEM图。图2B是电极表面植酸锆多孔膜的FESEM图。可以看到制备所得的植酸锆纳米粒子是连续的，多孔网状结构。这种结构极大的提高了酶在电极表面的负载量，并且为其提供了良好的生物微环境。 

光电子能谱(XPS)可以表征电极表面膜形成及组分。图3的XPS图中给出的峰分别对应于P_2p，Zr_3d，C_1s，O_1s，表明电极表面植酸锆膜的形成。另外，定量XPS分析结果给出Zr和P的摩尔比是1∶2，而一分子的IP₆中有六个磷酸基团，所以说这个化合物中Zr和IP₆的摩尔比是3∶1。 

紫外可见吸收光谱能提供酶或蛋白质构象变化信息，从吸收峰位置以及峰形上可了解酶是否变性。图4用紫外可见光谱对植酸锆胶体分散液，HRP和两者混合物进行了表征。从图4a得知，植酸锆在紫外可见区域没有明显的吸收峰，而HRP和植酸锆混合液中Soret带的吸收峰(图4b)位于395nm，与HRP(图4b)在PBS溶液中的吸收峰(396nm)相比，只有一个纳米的位移。另外，HRP的Q和CT带位于500和640nm，而这两个吸收峰在HRP和植酸锆混合液的紫外可见吸收光谱中也存在，峰形和峰位置无明显变化，说明HRP保持了其生物活性。 

用电化学交流阻抗法可以对电极组装过程进行表征，结果见图5。由图可见，裸玻碳电极的交流阻抗曲线(a)近乎为一条直线；当组装了植酸锆之后，阻抗曲线(b)在高频区出现一个小半圆，是因为当植酸锆组装到电极表面后，膜厚度增加，且植酸锆导电能力差，阻碍了Fe(CN)₆^3-到玻碳电极表面进行的电子交换，也就使组装植酸锆后的电极的电阻明显大于裸玻碳电极；当继续组装了酶(HRP)后，阻抗曲线(c)的半圆变得更大，是由于HRP是带负电荷的，组装到 电极表面，增加了电极表面的负电荷量，同时电极表面修饰层的结构变得更为稠密，进一步阻碍了Fe(CN)₆^3-到玻碳电极表面进行电子交换，这也证明酶成功地组装到了电极表面。同理，(d)中半圆进一步变大，说明Nafion也成功组装到了电极表面。 

图6是研究不同修饰电极在pH＝7.0的PBS溶液中的循环伏安曲线。从图中可以看出裸电极(a)和修饰电极Nafion/Zr-IP₆/GCE(b)在PBS(pH＝7.0)溶液均没有氧化还原峰，证明植酸锆是非电活性的。而Nafion/HRP/Zr-IP₆/GCE(c)有一对明显的氧化还原峰，这对氧化还原峰来源于HRP，即HRP中的血红素中FeIII/II的氧化还原反应：HRP(FeIII)+e＝HRP(FeII)。其中，Epa＝-0.356V，Epc＝-0.399V，ΔEp＝0.043V，证明电极反应是一个准可逆的过程，电子传递速度较快。结果说明植酸锆纳米粒子起到了促进HRP中的亚铁血红素与电极表面的电子传递的作用，而且保持了酶良好的生物活性。 

图7是修饰电极Nafion/HRP/Zr-IP₆/GCE对H₂O₂的电催化还原行为的研究。当在PBS(pH＝7.0)溶液中，加入H₂O₂后CV曲线峰形有很大的改变，与空白值相比(图7(a))，随着加入H₂O₂浓度不断增大，催化曲线还原峰电流增大，氧化峰电流减小甚至消失。由此可见，Nafion/HRP/Zr-IP₆/GCE修饰电极对H₂O₂有良好的电催化还原作用，同时说明植酸锆纳米粒子保持了酶的生物活性。 

图8是通过计时电流法定量的考察了Nafion/HRP/Zr-IP₆/GCE修饰电极对H₂O₂的检测。图8A是在-230mV的工作电位下，向缓慢搅拌的PBS(pH＝7.0)溶液中连续加入一定浓度的H₂O₂得到的i-t曲线。随着H₂O₂浓度的不断增加，还原电流逐级增加并在7s内快速达到95％的稳态电流。图8B是传感器对H₂O₂检测的标准曲线。分析结果给出，Nafion/HRP/Zr-IP₆/GCE修饰电极对H₂O₂检测的浓度响 应范围为6.67×10^-7到6×10^-6mol/L，线性相关系数为0.997(n＝9)，检测限为5.3×10^-7mol/L(信噪比S/N＝3)。 

表观米氏常数(apparent Michaelis-Menten constant， )是一种与酶的浓度无关的酶促反应特征常数，它可以表征酶与底物之间亲合力的大小。 可以通过Lineweaver-Burk方程求得： 

$1/I_{\mathrm{ss}}=K_M^{\mathrm{app}}/I_{\max }C+1/I_{\max }$

式中，I_ss是加入底物后测得的稳态电流，C是底物浓度，I_max是底物达饱和后测得的最大电流。米氏常数可根据稳态电流的倒数和H₂O₂浓度的倒数作图后，所得到的斜率和截距求得。计算得到本工作中Nafion/HRP/Zr-IP₆/GCE修饰电极的 较低的 说明植酸锆膜的多孔结构较好的维持了HRP的生物活性，可以实现对H₂O₂含量的测定。 

Nafion/HRP/Zr-IP₆/GCE修饰电极在PBS(pH＝7.0)中以300mV s^-1的速度连续扫描50圈，其电流响应没有明显变化。将其置于PBS(pH＝7.0)中，4℃下保存20天后，其电流响应仍能保持初始电流的94％。 

Nafion/HRP/Zr-IP₆/GCE修饰电极对1μmol L^-1 H₂O₂溶液连续测定5次的相对标准偏差(R.S.D.)为1.93％。4支同样方法制备的修饰电极在相同条件下对1μmol L^-1 H₂O₂响应电流的相对偏差为3.7％。 

实验结果表明该传感器具有令人满意的重现性和稳定性。 

通过对消毒水中H₂O₂含量的测定研究了该传感器的实际应用，结果见表1。将市售的消毒水样品用PBS(pH＝7.0)稀释1000倍，然后对其进行五次平行检测。五次检测的相对标准偏差是2.68％，与高锰酸钾氧化还原滴定得到的结果相比，没有明显差别，证明该传感器可以对实际样品中H₂O₂进行准确的检测。 

由表可见本发明制备的生物传感器具有与酶底物的亲和力好，能够实现酶与基底电极间的直接电子转移，且催化还原过氧化氢，对过氧化氢检测的检测限低等性能。