提高轮枝拟青霉GZ中虫草菌素产量的方法

摘要

本发明公开了一种提高轮枝拟青霉GZ中虫草菌素含量的方法，包括GZ接在PDA斜面培养基上，26℃，培养5d，活化3次，以v/v为5％再接入到PDA液体种子培养基中，140rpm，26℃，摇瓶培养3d，得液体母种，以v/v为4％接种量接入到白砂糖2％、麦芽糖1％、牛肉膏2％、酵母膏3％的发酵培养基中，同时添加十六烷v/v为2-8％％，140rpm，26℃，摇瓶培养7d即得。本发明发酵条件稳定、简单，菌体容易培养，提高虫草菌素产量效果好，可大规模工业化生产。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体来说涉及一种利用两相培养体系提高轮枝拟青霉GZ中虫草菌素含量的方法。

背景技术

两相培养，也称双相培养，两相发酵，双相发酵，细胞培养-分离耦合过程。利用在植物细胞或是微生物培养中加入水溶性或脂溶性的有机物，或者是具有吸附作用的多聚化合物，使培养体系由于分配系数的不同而形成上下两相，细胞在其中一相中生长并合成次生代谢物，而这些产物又通过主动或被动运输方式释放到细胞外，并被另一相所吸附。两相培养大大减轻了产物本身对细胞代谢的抑制作用，提高代谢产物产率，保护了产物免受培养基中催化酶或酸对产物的影响。

液-液两相培养作为提高次级代谢产物的一种工艺在植物培养方面已经成熟，他一方面可以提高次级代谢产物的含量，另一方面也简化了下游分离纯化过程。但液-液两相培养在现代微生物方面的应用研究甚少，用于提高虫草菌素含量方面更是空白。虫草菌素(cordycepin)是一类首次从蛹虫草中分离出来的核苷类抗菌物，具有多种生物活性，但虫草菌素为次级代谢产物，产量不高，使其应用受到了限制。

发明内容

本发明的目的在于克服上述缺点而提供的一种发酵条件稳定、简单，菌体容易培养，提高虫草菌素产量效果好，可大规模工业化生产的提高轮枝拟青霉GZ中虫草菌素含量的方法。

本发明的一种提高轮枝拟青霉GZ中虫草菌素含量的方法，包括GZ接在PDA斜面培养基上，26℃，培养5d，活化3次，以5％(v/v)再接入到PDA液体种子培养基中，140rpm，26℃，摇瓶培养3d，得液体母种，以4％(v/v)接种量接入到白砂糖2％、麦芽糖1％、牛肉膏2％、酵母膏3％的发酵培养基中，同时添加十六烷2-8％％(v/v)，140rpm，26℃，摇瓶培养7d即得。

GZ菌种已于2009年12月14日保藏在中国典型培养物保藏中心(地址：中国 武汉 武汉大学)，保藏号：CCTCC NO：M 209302，名称为：轮枝拟青霉(Paecilomyces verticillatus GZ)

上述提高轮枝拟青霉GZ中虫草菌素含量的方法，其中PDA斜面培养基的制备方法为：马铃薯200g切块，用水煮沸30min，过滤取汁，加葡萄糖20g，琼脂20g，水补足1000mL，pH自然；灭菌条件：121℃，30min。

上述提高轮枝拟青霉GZ中虫草菌素含量的方法，其中PDA液体种子培养基的制备方法为：马铃薯200g切块，用水煮沸30min，过滤取汁，加葡萄糖20g，水补足1000mL，pH自然；灭菌条件：121℃，30min。

上述提高轮枝拟青霉GZ中虫草菌素含量的方法，其中发酵培养基的制备方法为：分别精密称取白砂糖20g、麦芽糖10g、牛肉膏20g、酵母膏30g，水补足1000mL，pH自然；灭菌条件：121℃，30min。

本发明与现有技术相比，具有明显的有益效果，从以上技术方案可知：轮枝拟青霉(Paecilomyces verticillatus GZ)菌株来源可靠，对温度、pH等自然环境条件的适应范围广；所需培养基质容易获得，发酵条件稳定、简单；两相培养体系对细胞无毒、安全，不会萃取培养基中微量组分，使菌体容易培养和保存，产虫草菌素条件稳定，可作为提取虫草菌素的后备菌株，扩充资源库。两相培养体系中采用十六烷提高虫草菌素产量效果好(比未加有机溶剂十六烷的对照提高224％)，在真菌次级代谢产物提高方面有很大的应用前景。该技术路线合理，能够实现液体发酵工业化生产虫草菌素。

具体实施方式

以下通过试验例来进一步说明本发明的有益效果。

试验例：

(1)有机相筛选

将油酸，邻苯二甲酸二丁酯，油酸丁酯，十六烷，液体石蜡，聚乙二醇400分别以6％浓度加入到发酵培养基中，接入4％液体母种，26℃，140rpm，摇瓶培养7天。观察菌丝体生长情况，发现添加油酸丁酯和油酸会影响GZ菌株生长，使其生物量明显降低，十六烷和液体石蜡对GZ菌株生长影响不明显，且生物量降低不明显，而聚乙二醇400和邻苯二甲酸二丁酯却会使GZ-01的生物量明显提高。但通过HPLC测定虫草菌素总量，十六烷可大幅度的提高虫草菌素产量，因此，选择十六烷为两相培养体系中的有机相，对此进行添加时间和添加浓度的筛选。

(2)十六烷添加浓度的筛选

十六烷分别以2％、4％、6％、8％、10％的浓度加到发酵培养基中，接入4％液体母种，26℃，140rpm，摇瓶培养7天，制备待测液，HPLC测定结果显示：当十六烷添加浓度为2％-8％时，虫草菌素产量随添加浓度的增加而升高，但随着添加浓度的增加，虫草菌素产量反而降低。因此，确定十六烷最佳添加的浓度为8％。

(3)十六烷添加时间的筛选

将4％液体母种接入发酵培养基中，26℃，140rpm，摇瓶培养0d、1d，2d，3d，4d，5d时分别加入8％十六烷，继续摇瓶培养到7天，制备待测液，HPLC测定结果显示：随着十六烷添加时间的推后，虫草菌素产量呈下降趋势。因此，确定十六烷最适合添加时间为0d，即与GZ菌株一同发酵培养。

(4)十六烷提高虫草菌素含量的工艺筛选

GZ接在PDA斜面培养基上，26℃，培养5d，活化3次，以5％(v/v)再接入到PDA液体种子培养基中，140rpm，26℃，摇瓶培养3d，得液体母种，以4％(v/v)接种量接入到白砂糖2％、麦芽糖1％、牛肉膏2％、酵母膏3％的发酵培养基中，同时添加十六烷8％(v/v)，140rpm，26℃，摇瓶培养7d。经检测：虫草菌素总量为116±1.0mg/L，比未加十六烷的发酵体系提高224％。

实施例1-3：

一种提高轮枝拟青霉GZ中虫草菌素含量的方法，包括以下步骤：

(1)孢子悬液的制备：

轮枝拟青霉GZ菌株接于斜面培养基，26℃培养5d，活化3次，用无菌吐温-80生理盐水洗下孢子，转入带有玻璃珠的无菌三角瓶中，振荡，充分打散孢子，用4层无菌镜头纸过滤除去菌丝，制成孢子数为10⁶倍的孢子悬液。

(2)液体母种的制备：

取制好的孢子悬液，以5％接种量接于PDA液体种子培养液中，26℃，140rpm，摇瓶培养3天，获得液体母种。

(3)发酵：

GZ接在PDA斜面培养基上，26℃，培养5d，活化3次，以5％(v/v)再接入到PDA液体种子培养基中，140rpm，26℃，摇瓶培养3d，得液体母种，以4％(v/v)接种量接入到发酵培养基中，同时添加2-8％(v/v)十六烷，140rpm，26℃，摇瓶培养7d即得。

PDA斜面培养基的制备方法为：马铃薯200g切块，用水煮沸30min，过滤取汁，加葡萄糖20g，琼脂20g，水补足1000mL，pH自然；灭菌条件：121℃，30min。

PDA液体种子培养基的制备方法为：马铃薯200g切块，用水煮沸30min，过滤取汁，加葡萄糖20g，水补足1000mL，pH自然；灭菌条件：121℃，30min。

发酵培养基的制备方法为：分别精密称取白砂糖20g、麦芽糖10g、牛肉膏20g、酵母膏30g，水补足1000mL，pH自然；灭菌条件：121℃，30min。

  3   8％    116±1.0mg/L    224％