鹿药中新化合物呋甾皂苷的分离鉴定及其抗肿瘤用途

摘要

鹿药中新化合物呋甾皂苷的分离鉴定及其抗肿瘤用途。本发明对鹿药设计、分离得到了一种呋甾皂苷类新化合物，新化合物命名为：26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(25R)-呋甾-5-烯-3β，12，17α，22ξ，26-五醇-12-O-乙酰基-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷{26-O-β-D-glucopyranosyl-(25R)-furost-5-en-3β，12，17α，22ξ，26-pentol 12-O-acetyle-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranoside}。本发明采用MTT法对此新化合物进行了抗肿瘤活性检测，实验结果显示此化合物具有抑制人肺腺癌SPC-A-1细胞生长的活性，IC

说明书

技术领域

本发明涉及天然药物化学领域，具体涉及一种新的呋甾皂苷化合物的分离鉴定及其抗人肺腺癌SPC-A-1细胞的活性。 

背景技术

鹿药为百合科鹿药属多年生草本植物鹿药(Smilacina japonica A.Gray)的干燥根茎及根，为民间常用中药。鹿药属植物全世界约有25种，我国有14种，2变种，除新疆、青海、宁夏和内蒙古，全国都有分布，野生资源储量十分丰富。鹿药属植物具有药食两用价值，除根茎及根可入药，地上幼嫩茎叶是人们喜爱的山野菜，其中鹿药种在全国各地分布最为广泛。 

《中药大辞典》中记载鹿药性味“甘、苦、温、无毒”，具有补气益肾、祛风除湿、活血调经的功能，常用于治疗痨伤，阳痿，偏、正头痛，风湿骨痛，痈疖肿毒，跌打损伤，乳腺炎，月经不调等症。而有关药用成分及现代药理研究几乎是空白，制约了鹿药资源的开发与利用。 

皂苷类化合物是广泛分布于植物界的一类次生代谢产物，是许多药用植物的有效成分，具有防治心脑血管疾病、抗肿瘤、抗病毒、治疗白血病、免疫调节、抗炎、抗过敏、降血糖、抑制生育、杀虫、抗真菌、调节内分泌、抗氧化、保肝等多种生物活性和广泛的药理作用。皂苷化合物是新药研究过程中重要的先导化合物来源而受到研究人员的关注。 

本发明通过研究鹿药的化学成分，并对其中所获得的一种新呋甾皂苷化合物进行抗肿瘤活性检测，旨在获得显效的新化合物或先导物质，并为鹿药的化学成分与生物活性研究奠定基础，为更好的研究、开发、利用鹿药植物资源提供科学依据。 

发明内容

本发明对鹿药设计、分离得到了一种呋甾皂苷类新化合物，新化合物结构式为： 

命名为：26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(25R)-呋甾-5-烯-2β，12，17α，22ξ，26-五醇-12-O-乙酰基-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷 

{26-O-β-D-glucopyranosyl-(25R)-furost-5-en-3β，12，17α，22ξ，26-pentol12-O-acetyle-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranoside}。 

本发明采用MTT法对此新化合物进行了抗肿瘤活性检测，实验结果显示此化合物具有抑制人肺腺癌 SPC-A-1细胞生长的活性，它的IC₅₀值为7.67μg·mL^-1。 

附图说明

图1新化合物的ESI-MS图谱 

图2新化合物的IR图谱 

图3新化合物的¹³C NMR谱 

图4新化合物的¹H NMR谱 

图5新化合物的HMQC谱 

图6新化合物的HMBC谱 

图7新化合物的TOCSY谱 

图8新化合物的结构式 

具体实施方式

实施例一  新化合物的提取、分离和鉴定 

1.实验材料和方法 

1.1样品 

鹿药采自吉林省九台市土门岭地区，由吉林农业大学中药材学院杨利民教授鉴定，将其根茎洗净后自然阴干，机械粉碎，备用。 

1.2仪器与试剂 

仪器：DL-1000E智能超声波清洗器(上海之信仪器有限公司) 

RE52-99旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂) 

Agilent 1100高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司) 

X-4数字显微熔点测定仪(温度未校正，北京泰克仪器有限公司) 

FTIR-8400S傅立叶变换红外光谱仪(KBr压片，日本岛津) 

UV-1700紫外分光光度计(日本岛津) 

AV400核磁共振仪(瑞士Bruker公司) 

MATLCQ电喷雾质谱仪(美国Finigan公司) 

试剂：D101型大孔吸附树脂(天津市海光化工有限公司) 

柱色谱及薄层色谱用硅胶(青岛海洋化工厂产品) 

HPLC分析用甲醇、乙腈为色谱纯(美国Fisher ChemAlert Guide)；水为纯净水；其余试剂均为分析纯。 

1.3提取与分离 

取粉碎的鹿药根茎2.8kg，加5倍体积的90％乙醇浸泡12h，超声提取40～50min，过滤，滤渣再依次加入5倍体积的80％、70％乙醇提取2次，每次40～50min，合并提取液，减压浓缩至无醇味，得棕色浸膏，将浸膏水溶后过D101大孔吸附树脂柱层析，先用蒸馏水洗脱至流出液无色，再依次用30％、50％、70％、90％浓度的乙醇洗脱，每次洗脱至流出液无色，将各洗脱部分分别减压浓缩至干，取其中70％乙醇洗脱部分(12g)干法上硅胶柱(200～300目，300g)，氯仿-甲醇(9∶1～2∶8，V/V)梯度洗脱，100mL/瓶接收。经薄层色谱检测，合并相同组分，得流分I、II、III、IV、V、VI、VII7部分，流分III经反复硅胶柱色谱分离，得到1个新单体化合物，经HPLC检验纯度达到97％。 

2.新化合物的理化性质、波谱数据及结构确定 

白色颗粒；mp.201～204℃；易溶于甲醇；Libermann-Burchard反应阳性，Molish反应阳性，与Ehrish试剂显红色，提示化合物为呋甾皂苷；ESI-MS给出正离子峰m/z：977[M+H]⁺，917[M-59(AcO)]⁺，结 合¹³C NMR谱给出分子式为C₄₇H₇₆O₂₁，不饱和度为10，分配在皂苷元的A、B、C、D、E 5个环，3个糖，1个双键和1个羰基上；IR(KBr)， 3421(OH)，2931(C-H)，1735(C＝O)，1629(C＝C)，1458，1377，1245，1047，977，956，918，892，864，838，810，798，其中977，918，892，864为甾体皂苷的特征吸收谱带，(强度：892＞918)但不明显，C-27位甲基δ_H0.567(3H，d)，δ_C17.25，与其相关的C-26位上的两个氢的化学位移相似(δ_H3.39，3.38)表明为25R构型甾体皂苷。 

¹H NMR(C₅D₅N，400MHz)高场区出现甾体骨架的4个特征甲基质子信号δ(ppm)：0.57(3H，d，J＝5.6Hz，CH₃-27)，0.84(3H，s，CH₃-18)，0.95(3H，s，CH₃-19)，1.11(3H，d，J＝7.2Hz，CH₃-21)，在HMQC谱显示分别对应的4个甲基碳信号¹³C NMR(C₅D₅N，100MHz)δ：17.25，17.41，19.52，9.85。 

¹H NMR低场区有3个特征的糖端基质子信号δ：4.78(1H，d，J＝7.6Hz，H-1of Glu)，4.90(1H，d，J＝7.6Hz，H-1 of 26-O-Glu)，5.40(1H，s，H-1of Rha)，¹³C NMR数据及HMQC显示3个相应的糖端基碳信号分别为δ：99.7，106.2，99.4。¹H NMR高场区还有1个鼠李糖的甲基质子信号1.67(3H，d，J＝6.8Hz，H-6 of Rha)，对应的碳信号为18.70，与标准糖的甲苷信号及偶合常数比较可知，化合物有3个糖残基，其中2个为葡萄糖，均为β构型，1个为鼠李糖，为α构型，碳谱中糖的信号没有大于80ppm的，说明糖都为吡喃型糖。在HMBC谱及TOCSY谱中显示δ：106.2，75.3，78.1，71.2，78.6，67.6的6个碳上相连的氢相关，为1组葡萄糖碳信号，此糖为C-26位苷化糖；99.7，99.4显示为苷元3位羟基上连有两分子糖基，δ99.7与δ3.99(H-3，δ_C77.76)相关，HMBC谱及TOCSY谱中显示与δ99.7为1个自旋体系的碳信号为δ：77.6，76.9，76.8，70.2，61.1，此为1组糖的碳信号，与碳对应的氢信号显示氢之间的偶合常数较大，说明为葡萄糖，葡萄糖基以β-1苷键与苷元3位C相连，鼠李糖基以α-1，2苷键与葡萄糖基C-2连接。 

¹H NMR低场区有1个烯氢δ5.18(1H，br s)信号，对应¹³C NMR谱中有2个双键碳信号：δ122.13和δ140.66，结合HMQC显示δ5.18与δ122.13相关，因此说明苷元有一个双键，为Δ⁵⁽⁶⁾，δ140.66(C-5)，δ122.13(C-6)。 

¹³C NMR谱中给出甾体皂苷C-22的特征碳信号δ109.95，与δ1.11(CH₃-21)远程相关，HMQC显示C-22为季碳，F环开环，C-22位应连有1个羟基(OH)；δ90.16和δ90.25为C16，17位由于氧取代而产生的重叠并移向低场的碳信号，δ90.25与δ0.84(CH₃-18)和氢信号δ1.11(CH₃-21)远程相关，进一步确定δ90.25为C-17信号，C-17连有1个OH。 

¹³C NMR最低场有1个δ170.93羰基碳信号，在HMBC谱中δ170.9的羰基与δ2.26(3H，s，CH₃-Ac)，δ5.74(δc76.15)，δ1.87(C-11)的质子相关，与同属植物竹叶菜中分离得到的竹叶菜苷C比较，其12位碳的化学位移不同，在综合质谱中碎片917[M-59(AcO)]⁺，说明δ170.9为乙酰基的羰基碳信号，此基团连接在甾体母核的12位。通过HMQC、HMBC和TOCSY谱对分子中的C、H信号进行了归属(见表1和结构式1)。相关图谱见附图1～7。 

通过以上分析确定化合物为26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(25R)-呋甾-5-烯-3β，12，17α，22ξ，26-五醇-12-O-乙酰基-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷，结构式见附图8。 

表1  新化合物的¹³C NMR和¹H NMR数据(溶剂：氘代吡啶) 

Table 1 ¹³C NMR and ¹H NMR data of new compound(recorded in pyridine-d₅) 

实施例二新化合物的抗肿瘤活性检测 

1.实验材料与方法 

1.1仪器与试剂 

仪器：96孔细胞培养板(Costa公司) 

培养箱(NUAIRΞUS AUTOFLOW CO₂Water-Jacketed Incubator) 

超净工作台(上海博迅实业有限公司医疗设备厂) 

Nikon eclipses TS100 

TS-2型脱色摇床(海门市其林贝尔仪器制造有限公司) 

DG5032型酶联免疫检测仪(南京华东电子集团医疗装备有限责任公司) 

试剂：新生牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司) 

RPMI-1640(美国Gibco公司) 

胰蛋白酶、噻唑蓝(MTT)、Trypan Blue(Amresco公司) 

5-氟脲嘧啶(5-Fu)和顺铂(DDP)(购于长春市吉林大学中日联谊医院) 

二甲基亚砜(DMSO)(天津市北联精细化学品开发有限公司) 

1.2细胞株 

人肺腺癌SPC-A-1细胞株 

1.3受试药物 

从鹿药中分离得到的新化合物26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(25R)-呋甾-5-烯-3β，12，17α，22ξ，26-五醇-12-O-乙酰基-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷。样品用DMSO溶解配制为2mg·mL^-1的母液备用。用时加培养液稀释至所需浓度。 

1.4操作步骤 

(1)单细胞悬液的制备：将人肺腺癌SPC-A-1细胞株用含10％新生牛血清的RPMI1640培养液，在含5％CO₂、37℃饱和湿度的培养箱中培养，0.25％胰蛋白酶消化传代，调整细胞浓度为1×10⁴个/mL，制成细胞悬液。 

(2)接种与培养：取细胞悬液接种于96孔板上，100μL/孔，将培养板转入恒温CO₂培养箱中，培养24h。 

(3)加药：吸去培养板中的培养液，加入含有药物的培养液200μL，药物设6个不同终浓度组(1.25、2.5、5.0、10、20、40μg·mL^-1)，同时设阳性对照组(抗癌药顺铂、5-氟脲嘧啶，各设10μg·mL^-1和40μg·mL^-1两个终浓度组)，阴性对照组(含溶媒DMSO的培养液)，另设调零组(只加培养液)，每组设6复孔，加药后置37℃、5％CO₂培养箱中，继续培养48h。 

(4)染色：将含药培养液吸去，加入体积比为4∶1的无血清培养液和MTT(终浓度5mg·mL^-1)共100μL，继续孵育4h，小心吸去上清液后每孔加入150μLDMSO，放于震荡器上震荡使结晶完全溶解(5min)。 

(5)比色：用酶标仪在570nm主波长，630nm副波长下检测各孔的吸光度(OD值)，计算细胞生长抑制率。 

1.5数据处理 

细胞生长抑制率的计算： 

细胞生长抑制率(％)＝(1-OD值均数_加药孔/OD值_阴性对照)×100％ 

2.实验结果与分析 

MTT法是一种检测细胞生长的方法。药物对细胞生长的抑制作用以IC₅₀表示，判断标准：IC₅₀＞100μg·mL^-1(无效)；100μg·mL^-1＞IC₅₀＞30μg·mL^-1(弱效)；30μg·mL^-1＞IC₅₀＞10μg·mL^-1＜(有效)； IC₅₀＜10μg·mL^-1(强效)。 

新化合物对人肺腺癌SPC-A-1细胞生长的影响见表2，结果表明，从鹿药中提取分离得到的新化合物对人肺腺癌SPC-A-1细胞生长具有抑制作用，且呈良好的量效线性关系，抑制作用随样品浓度增加而增强，样品浓度为10μg·mL^-1时对细胞生长的抑制率达到86％，与同浓度的阳性对照物顺铂的抑制作用接近，比5-氟脲嘧啶的抑制率高，IC₅₀为7.67μg·mL^-1，说明此新化合物具有强效抗人肺腺癌SPC-A-1细胞生长的活性。 

表2  新化合物对人肺腺癌SPC-A-1细胞生长的影响 

Table 2 Effect of new compound on SPC-A-1 cell 

注：[小写字母表示5％显著水平，大写字母表示1％极显著水平]