恩诺沙星半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用

摘要

本发明提供了一种恩诺沙星半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法和应用。本发明以恩诺沙星为原料，与氨基丁酸或氨基己酸反应生成含4个或6个碳原子手臂的半抗原；通过活泼脂法将半抗原与蛋白质偶联制备得到人工抗原；将人工抗原免疫小鼠，采用细胞融合技术制得对恩诺沙星高特异性的单克隆抗体。采用本发明单克隆抗体建立免疫检测可用于恩诺沙星现场快速检测，对实现畜禽水产品中恩诺沙星残留的快速检测具有重要现实意义。

说明书

技术领域

本发明属于食品安全技术领域。具体涉及恩诺沙星半抗原、人工抗原和抗体的制备方法及应用。

背景技术

恩诺沙星(Enrofloxacin，EF)，其分子式为C₁₉H₂₂FN₃O₃，分子量为359.40，微黄色或淡橙黄色结晶性粉末，无臭，味微苦；遇光色渐变为橙红色，其结构式为式(1)所示：

恩诺沙星为第三代喹诺酮类(FQs)的典型代表之一，具有抗菌谱广、毒副作用小、血药浓度高、半衰期长、制剂形式多样、药效价格比高等特点，对各种革兰氏阴性和阳性菌均具有强大的抑菌作用，与青霉素、头孢菌素和氨基类药物均无交叉耐药性等特点，对于治疗炭疽热病症具有特效作用。

FQs药物因其能抑制细菌DNA螺旋酶、抗菌谱广、高效、低毒、组织穿透力强，抗菌作用是磺胺类药的近千倍，加之系化学合成药物，价格低廉，故在医学和兽医学中很快取得广泛应用，尤其在水产养殖中成为最重要的抗感染药物之一。FQs药物对动物体以及人体的绝大部分器官和组织都有不同程度的不良反应：由于FQs药物呈脂溶性，可通过血脑屏障进入脑组织，抑制γ-氨基丁酸(GABA)与其受体结合而产生神经系统反应。故以神经系统的损伤最为常见，其次是皮肤及其附件的损伤。多数不良反应症状较轻，且可逆，但也有较重甚至危及生命的。动物实验表明，FQs药物可引起幼畜关节炎、跟键炎，也能引起过敏性休克，恶心、呕吐，静脉炎等症状以及某些潜在的致癌性质，同时由于致病菌产生耐药性，恩诺沙星药物的残留问题已引起广泛关注。美国和欧盟规定在禽食用组织中方的最高残留限量为恩诺沙星和恩诺沙星为30μg/Kg；我国农业部标准NY5070-2001《无公害食品水产品中渔药残留限量》规定恩诺沙星残留限量为50μg/Kg。

目前，对畜禽水产品中恩诺沙星残留的检测主要采用高效液相色谱法(HPLC)、气相等仪器检测方法。然而应用仪器方法时，其灵敏度受样品的净化、浓缩等步骤的影响很大，测定方法存在复杂、繁琐、检测通量小、需要专业人员和专业技能、检测成本昂贵等缺陷，不能实现大批量样品的快速检测分析。因此，有必要研制更加简单快捷方便的检测方法。

免疫检测方法，是目前食品安全快速检测的重要方法之一，检测成本很低，使用简单，适合大量样品的筛选检测，已经在食品安全检测中发挥了重要作用。人工抗原的合成是半抗原物质免疫分析方法建立的的关键，对于恩诺沙星，因为其本身含有羧基，不需要衍生，因此目前都是直接利用该羧基和蛋白质连接。譬如，蔡勤仁等发表了论文“恩诺沙星单克隆抗体的制备及鉴定”(中国农业科学，2004)，采用碳二亚胺法，直接偶联羧基和蛋白质的氨基合成了恩诺沙星人工抗原；唐宏等公开了一种专利“恩诺沙星单克隆抗体及应用(申请号200910027793.5)”，采用碳二亚胺法将恩诺沙星和载体蛋白BSA、HSA及OVA偶联。

但是，现有技术获得的恩诺沙星抗体的特异性和识别力不够。

发明内容

本发明的一个目的是填补恩诺沙星现有检测技术的不足，提供一种恩诺沙星人工半抗原、人工抗原和特异性单克隆抗体。

本发明的另一个目的是提供所述恩诺沙星人工半抗原、人工抗原和特异性单克隆抗体的制备方法。

本发明还有一个目的是提供所述恩诺沙星人工半抗原、人工抗原和特异性单克隆抗体的应用。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

提供一种恩诺沙星人工半抗原、人工抗原和特异性单克隆抗体，所述恩诺沙星人工半抗原具有式(II)所示分子结构：

其中，n为-CH₂基团数目，n＝4或6，优选n＝4。

所述恩诺沙星人工抗原，具有式(III)所示分子结构：

其中，n为-CH₂基团数目，n＝4或6，优选n＝4。

本发明提供了所述恩诺沙星半抗原的制备方法，是以恩诺沙星与氨基丁酸(H₂NCH₂CH₂CH₂COOH)或氨基己酸(H₂NCH₂(CH₂)₄COOH)在NHS、DDC和DMF存在条件下反应生成含4个或6个碳原子手臂的半抗原。

恩诺沙星半抗原合成路线(以生成结构式中n取值为4为例)：

本发明所述恩诺沙星半抗原的制备包括以下步骤：

(1)按投料摩尔比为1∶1∶1将恩诺沙星、氮羟基琥珀酰亚胺(NHS)和脂溶性碳二亚胺(DDC)置于烧杯中，并将上述混合物用少量的DMF溶解，室温下避光搅拌过夜；

(2)将经步骤(1)得到的反应物离心取上清得A液；所述离心操作优选10000r/min离心10min；

取与恩诺沙星等摩尔量的氨基丁酸或氨基己酸，溶于少量蒸馏水中，得B液；

(3)将B液缓慢加到A液中，室温搅拌过夜，离心取上清液，调上清液pH值，将析出的沉淀过滤，收集上清液；

步骤(3)所述离心操作优选10000r/min离心10min；

步骤(3)优选采用饱和NaHCO₃调节上清液的pH值，优选调pH值为8.0～8.5；

(4)将步骤(3)制得的上清液调pH值，收集沉淀，得到恩诺沙星半抗原(CPFX-ABA)。

步骤(4)优选采用1mol/L的稀盐酸将上清液调pH值为5.0～6.0。

本发明所述人工抗原的制备可采用活泼脂法，根据本领域设计思想，也可以采用本领域其他常规方法制备。采用活泼脂法制备本发明所述抗原的具体步骤如下：

(1)将等摩尔的权利要求1所述的恩诺沙星半抗原、DDC、NHS溶解于DMF中，室温避光反应过夜；

(2)将步骤(1)所得反应物离心取上清液，将上清液加入到含有载体蛋白的硼酸缓冲液中，将混合物在4℃下反应过夜；

(3)待步骤(2)反应完成后，将反应后混合液装入透析袋，透析得到所述人工抗原。

本发明所述恩诺沙星特异性单克隆抗体制备，其具体步骤如下：

1)实验选用8周龄左右的健康雌性Balb/c小鼠作为免疫对象，基础免疫剂量为0.1～0.2mg/只，加强免疫剂量为03～0.5mg/只。人工抗原与等量佐剂充分混匀，采用背部皮下多点注射，每隔15d加强免疫一次，第3次免疫后7～10天内，尾部采血，测定抗血清效价和特异性，待其抗血清效价和特异性合格后，进行一次不含佐剂的加强免疫，免疫后第3天进行细胞融合；用小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，获得杂交瘤细胞，将杂交瘤细胞置于雌性Balb/c小鼠体内培养，获得含高浓度单克隆抗体的腹水，并对腹水纯化得到高特异性抗恩诺沙星单克隆抗体。

2)纯化抗体采用辛酸-硫酸铵法或Protein G/A亲和层析纯化。

恩诺沙星特异性单克隆抗体可应用于恩诺沙星残留的免疫检测方面，尤其是畜禽水产品中恩诺沙星残留的现场快速检测方面。

本发明的有益效果是：

本发明以恩诺沙星为原料，恩诺沙星与氨基丁酸或氨基己酸反应生成含4个或6个碳原子手臂的半抗原，本发明半抗原更充分的暴露给动物免疫系统，增强抗体的特异性和识别力；将本发明半抗原与蛋白质偶联制备人工抗原，采用本领域常规技术将本发明人工抗原免疫小鼠，采用细胞融合技术制得对恩诺沙星高特异性的单克隆抗体，使用所述单克隆抗体建立免疫检测可应用于恩诺沙星现场快速检测，而且灵敏度更高，检测限达到了0.05ng/mL，对实现畜禽水产品中恩诺沙星残留的快速检测具有重要现实意义。

附图说明

图1恩诺沙星标准曲线

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。实施例中恩诺沙星等药剂除非特别说明，都是常规市购实验室用试剂。

实施例1：半抗原合成

称取恩诺沙星38.6mg(约0.1mmoL)，NHS 11.5mg(约0.1mmoL)和DDC 20.3mg(约0.1mmoL)置于圆底烧瓶中，并将上述混合物用少量的DMF溶解，室温下避光搅拌过夜得反应物；

将反应物10000r/min离心10min，取上清，得A液；取氨基丁酸10.3mg(0.1mmoL)，溶于1mL蒸馏水中，为B液；将B液缓慢加到A液中，室温搅拌过夜，10000r/min离心10min，取上清液，用饱和NaHCO₃调pH值至8.0～8.5，有沉淀析出，将沉淀过滤，收集上清液。用稀盐酸(1mol/L)将上清液调至酸性(pH值5.0～6.0)，收集沉淀，即为恩诺沙星-氨基丁酸半抗原。

实施例2：半抗原合成

称取恩诺沙星38.6mg(约0.1mmoL)，NHS 11.5mg(约0.1mmoL)和DDC 20.3mg(约0.1mmoL)置于圆底烧瓶中，并将上述混合物用少量的DMF溶解，室温下避光搅拌过夜得反应物；

将反应物10000r/min离心10min，取上清，得A液；取氨基丁酸10.3mg(0.1mmoL)，溶于1mL蒸馏水中，为B液；将B液缓慢加到A液中，室温搅拌过夜，10000r/min离心10min，取上清液，用饱和NaHCO₃调pH值至8.0，有沉淀析出，将沉淀过滤，收集上清液。用稀盐酸(1mol/L)将上清液调至酸性(pH值6.0)，收集沉淀，即为恩诺沙星-氨基丁酸半抗原。

实施例3：半抗原合成

称取恩诺沙星38.6mg(约0.1mmoL)，NHS 11.5mg(约0.1mmoL)和DDC 20.3mg(约0.1mmoL)置于圆底烧瓶中，并将上述混合物用少量的DMF溶解，室温下避光搅拌过夜得反应物；

将反应物10000r/min离心10min，取上清，得A液；取氨基己酸0.1mmoL，溶于1mL蒸馏水中，为B液；将B液缓慢加到A液中，室温搅拌过夜，10000r/min离心10min，取上清液，用饱和NaHCO₃调pH值至8.5，有沉淀析出，将沉淀过滤，收集上清液。用稀盐酸(1ol/L)将上清液调至酸性(pH值6.0)，收集沉淀，即为恩诺沙星-氨基丁酸半抗原。

实施例4：人工抗原的合成

任选称取实施例1～3制备得到的恩诺沙星半抗原、DDC、NHS各0.1mmoL溶解于2mL的DMF(N，N-二甲基甲酰胺)中，室温避光反应过夜。将反应物10000r/min离心10min，取上清，并将其缓慢加入到5mL0.1moL/L pH9.0的硼酸缓冲液中，其缓冲液含有载体蛋白BSA或OVA，其中载体蛋白的浓度在20～30mg/mL，将混合物在4℃下反应过夜，待反应完成后，装入透析袋，然后用0.9％的生理盐水透析3d，每天换透析液3～5次，得到透析好的溶液即为人工抗原(EF-ABA-BSA或EF-ABA-OVA)。

恩诺沙星-氨基丁酸包被抗原制备方法同上，仅将BSA换成等质量的OVA。

恩诺沙星-氨基己酸人工抗原的合成方法同恩诺沙星-氨基丁酸人工抗原方法，仅将恩诺沙星-氨基丁酸换成等摩尔的恩诺沙星-氨基己酸。

实施例5：人工抗原的鉴定：

以恩诺沙星-氨基丁酸人工半抗原为例，按照分光光度法测定半抗原、载体蛋白以及偶联物的最大吸收值，计算偶联物的偶联比。在200～400nm之间分别对原料、BSA、OVA及偶联物紫外吸收光谱进行扫描，鉴定半抗原与载体蛋白是否发生偶联。同时估算半抗原和载体蛋白偶联比：

经计算结果如下：

EF-ABA-BSA    22∶1         EF-ABA-OVA      19∶1

实施例6：免疫动物及多克隆抗体制备

6.1免疫动物制备抗血清

实验选用实验室常规使用的8周龄左右的健康雌性洁净级Balb/c实验小鼠作为免疫对象，基础免疫剂量为0.2mg/只，加强免疫剂量为0.4mg/只。将人工抗原与等量福氏佐剂充分混匀，采用背部皮下多点注射，每隔15d加强免疫一次，第3次免疫后7～10天内，尾部采血，测定抗血清效价和特异性，待其抗血清效价和特异性合格后，进行一次不含佐剂的加强免疫，免疫后第3天进行细胞融合；用小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，获得杂交瘤细胞，将杂交瘤细胞置于雌性Balb/c小鼠体内培养，获得含高浓度单克隆抗体的腹水，并对腹水纯化得到高特异性抗恩诺沙星单克隆抗体。

6.2抗体的纯化

纯化抗体可以采用辛酸-硫酸铵盐析法，也可以采用Protein G/A亲和层析纯化。

实施例7：恩诺沙星酶联免疫方法建立

7.1包被：采用分装的EF-ABA-OVA进行包被，包被浓度为1μg/mL包被抗原。在96孔酶标板上每孔加入100μL含有包被抗原的包被液，4℃过夜。

7.2封闭：取出包被好的酶标板，使用洗液洗板两次，每孔加入120μL封闭液，与37℃温箱中温育3h。后将封闭液甩干，置烘箱1h。

7.3点板：在封闭好的半条中每孔加入经系列稀释制备的恩诺沙星各浓度标准液50μL，再加入抗体稀释液稀释20000倍的酶标抗体50μL。在37℃恒温箱里反应30min。使用洗液洗板6次。

7.4加酶标二抗每孔加入经1∶5000稀释的羊抗鼠辣根过氧化物酶稀释液100μL，放在37℃恒温箱里反应20min。使用洗液洗板6次。

7.5显色：每孔加入底物TMB-过氧化氢溶液100μL，37℃显色10min后用50μL的10％的H₂SO₄终止反应。在酶标仪上测定450nm波长下的吸光值。根据抑制率与恩诺沙星浓度之间的半对数关系作图即得到标准曲线，见附图1所示。

所述抑制率的计算式为：

抑制率(％)＝1-B/B₀

其中，B为标准溶液的平均吸光值，B₀为0浓度标准溶液的平均吸光度值。分析得到恩诺沙星的检测限(IC₁₀)为0.05ng/mL，线性范围(IC₂₀～IC₈₀)为0.1～8.1ng/mL。

添加回收率实验：

称量4份鸡肉，每份2g，置于15mL离心管中，分别向4个离心管中添加0、20、100、600μL浓度为100ng/mL的EF标准品，则4个离心管中鸡肉含EF浓度分别为0、1、5、30ng/g，振荡2min。再向离心管中加入少量PBS，旋涡振荡5min，避光静置15min，加入4mL PBS充分振荡5min，沸水中煮10min，6000r/min离心10min，收集上清液。向提取的上清液中加入适量正己烷，萃取脱脂3次，收集下层液；定容至6mL。定容至6mL。用本发明恩诺沙星人工抗原和抗体进行检测。

实验结果见表1和表2所示：

表1恩诺沙星ELISA基本参数

表2直接竞争ELISA检测实际样品添加回收率

由表1和表2可知，本发明方法制备得到的恩诺沙星人工半抗原、抗原和抗体灵敏度更高，检测范围0.1～8.1ng/mL，检测限达到了0.05ng/mL，回收率达到103～122％，变异系数在3.8～13.2，产生了很好的效果。