扩增红球菌的PCR引物及检测红球菌的方法

摘要

本发明涉及微生物领域，公开了一对用于扩增红球菌DNA的PCR引物，其上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物序列如SEQ ID No.2所示。本发明还提供用所述引物检测红球菌的方法。本发明所述引物适合于纯化红球菌扩增DNA，也适合于从混合菌群扩增红球菌DNA，可以安全、准确、快速、稳定地扩增出红球菌，特异性强，灵敏度高。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体涉及用于扩增红球菌的PCR引物及检测红球菌的方法。

背景技术

红球菌属细菌属于放线菌目棒杆菌亚目诺卡氏菌科，是一类好氧，不产生孢子的革兰氏阳性菌，少数可能致病。红球菌属中的主要成员包括：嗜粪红球菌、马红球菌、滕黄红球菌、红平红球菌等。红球菌具有一个相对快速和简单的生长周期，可作为实验系统进行科学研究。大多数红球菌能在广泛的环境中生长，比如沙漠，水体等。

红球菌具有重要的应用价值，红球菌的一个重要作用是生物转化。红球菌能利用自身的生物系统将原料进行生物转化，如能利用很多有机物生成类固醇、丙烯酰胺和丙烯酸等。另外红球菌能降解及利用一些环境污染物及有机物如烷烃，红球菌能够代谢有害的环境污染物，例如甲苯、萘等，并且与化石燃料的生物脱硫作用有关。同时它的一些种对人、动物或植物都有影响。因此，红球菌越来越为人们所关注。

现有技术中，有如下两种常用的对红球菌进行鉴定的方法：

1、生理生化指标鉴定。此方法是目前许多生化实验室常用的方法，此方法需要得到菌株的纯培养物，且实验周期长，实验结果受人为观察影响因素较大，准确性不高。

2、提取菌株DNA进行测序。目前是用16SrRNA基因引物进行PCR扩增，将扩增出的DNA片段进行测序。此方法结果比较准确。但仍需要得到菌株的纯培养物，无法从混合样品中快速鉴定是否含有红球菌。

因此本领域迫切需要开发出一种能够快速、准确判定红球菌的方法。

发明内容

本发明所需要解决的技术问题是针对现有技术鉴定红球菌试验周期长、适用范围窄的不足，提供一种能够快速、准确、方便，可对混合样品中是否含有红球菌进行快速判定的方法。

为实现上述目的，本申请的发明人设计了一对针对红球菌假想保守膜蛋白(conserved hypothetical membrane protein)基因片段的PCR引物，其上游引物：AATCCTCCTGAACGTGATCTG，其序列如SEQID No.1所示；

下游引物：CTATGCATAATTGACGCGGT，其序列如SEQ ID No.2所示。

本发明的术语“引物”指作为合成引物延伸产物的起始位点的单链寡核苷酸序列，其与待复制的核酸链互补，长度和序列必须适合于延伸产物的合成。引物是一段短的单链RNA或DNA片段，可结合在核酸链上与之互补的区域，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，核酸聚合酶可由其3′端开始合成新的核酸链。体外人工设计的引物被广泛用于聚合酶链反应、测序和探针合成等。

假想保守膜蛋白conserved hypothetical membrane protein基因是对红球菌基因组序列进行序列分析后根据生物信息学推断出的一个″假想″保守膜蛋白基因序列，该片段序列保守，在红球菌基因组中的位置为5076659-5077076，其序列为aa tcctcctgaa cgtgatctgg ctggtgttcggcggcttctg gctggcgttg ggttacttcg ccgcaggcat catctgctgc atcctcatca tcacgattcccttcggaatc gcggcattcc gcatcggcat ctacgcactg tggccgttcg gtaagaccgtcgtcgacaag ccgaccgctg gtgtcggttc gatgatcggc aatgtcatct gggtgatcatcgccggtatc tggttggcga tcggacacat cgtcaccgcc gtcgcgatgg cgatcacgatcatcggaatt ccgctcgcgg tcgcgaacct gaagatgatt ccgatctcgc tgatgccactcggcaaggag atcgtcgacg tggaccgcgt caattatgca tagccgtgga ccgcgtcaattacgcatagc cgtggaccgc gtcaattacg cgtaa(如SEQ ID No.3所示)

经过生物信息学研究发现，选择其它红球菌属的几乎所有小片段的模板设计出的引物都不具备特异性，比如推论的水解酶(putativehydrolase)，氧化还原酶(oxygenase reductase)等，而只有选择这段模板设计出的引物，具有较好的特异性。

本发明还提供一种检测红球菌的方法，包含以下步骤：

步骤1：按如下比例配制反应体系：

PCR buffer：10μL

dNTP：4μL

上游引物：1μL

下游引物：1μL

样品DNA：5μL

Taq：0.5μL

ddH₂O：28.5μL

其中，样品DNA浓度为100-200ng/μL，上游引物及下游引物浓度为10-20pmol/μL，所述上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物序列如SEQ ID No.2所示；

步骤2：94℃预变性10分钟进行30个PCR循环，循环完毕后72℃延伸10分钟；

步骤3：琼脂糖电泳检测扩增结果。

步骤2中所述PCR循环参数为：94℃变性1分钟，51℃复性5秒，72℃延伸25秒。

步骤3所述检测为检测是否有440bp及200bp的条带出现。

用这对引物对红球菌纯培养物提取的基因组DNA或者土壤样品的总DNA进行PCR扩增，可电泳检测根据能否扩增出440及200bp的目标条带，可判断出纯培养物或者土壤样品中是否为或是否含有红球菌。方法快速，鉴定结果稳定，特异性好，灵敏度高，在DNA模板含量为200×10^-2ng时，本发明所述引物仍可准确扩增出红球菌DNA，不仅适合于纯化红球菌扩增DNA，也适合于从混合菌群扩增红球菌DNA。

附图说明：

图1示本发明所述引物以红球菌DNA为模板的扩增产物凝胶电泳图；泳道M为marker，泳道1-3为土壤样品，泳道4为糖丝菌DNA样品，泳道5-6为红球菌DNA样品。

具体实施方式：

本发明公开了红球菌的PCR引物及检测红球菌的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例1：以纯培养物基因组DNA为模板用本发明所述引物进行PCR扩增

步骤1：选取红球菌，糖丝菌等不同的菌株纯培养物，提取其基因组DNA。提取方法参照TAKARA公司的细菌基因组DNA提取试剂盒。分别得到不同菌株的基因组DNA溶液。

步骤2：以步骤1得到的DNA为模板，配制为100-200ng/μL的DNA样品，与10-20pmol/μL的PCR引物配成如下50μL反应体系，进行PCR扩增反应：

PCR buffer：10μL

dNTP：4μL

Primer F上游引物：1μL

Primer R下游引物：1μL

DNA：5μL

Taq：0.5μL

ddH₂O：28.5μL

步骤3：按照上述体系混合之后，将PCR管放入PCR仪器进行扩增。PCR程序如下：

1预变性  94℃ 10分钟

2变性  94℃ 1分钟

3复性  50.5℃ 5秒

4延伸  72℃ 25秒

2至4循环 30次

5延伸  72℃ 10分钟

PCR酶采用的是PrimeSTAR^TM HS DNA Polymerase(TAKARA)

步骤4：电泳观察。取出PCR终产物5μL与上样缓冲液混合，100V，1％琼脂糖凝胶电泳30分钟，在凝胶电泳成像仪下紫外观察。结果见图1所示，其中，泳道M为marker，泳道4为糖丝菌DNA样品，泳道5-6为红球菌DNA样品，可见泳道5-6特异性扩增出440及200bp的条带，泳道4未有目标条带出现。将扩增出的条带回收后进行测序。测序结果表明，所扩增的440bp条带即为引物设计时红球菌属的目标基因片段，其序列如SEQ ID No.3所示；200bp条带为目标基因片段的一部分，其序列在红球菌基因组中的位置为5076659-5076864。

实施例2：以土壤细菌基因组DNA为模板进行PCR扩增

步骤1：取1至2克土壤样品，提取其微生物总DNA。提取方法参照DNA Recovery from Soils of Diverse Composition(JIZHONGZHOU，1996)，得到土壤总DNA溶液。

步骤2：以步骤1得到的DNA为模板，配制为100-200ng/μL的DNA样品，与10-20pmol/μL的PCR引物配成如下50μL反应体系，进行PCR扩增反应：

PCR buffer：10μL

dNTP：4μL

Primer F上游引物：1μL

Primer R下游引物：1μL

DNA：5μL

Taq：0.5μL

ddH₂O：28.5μL

步骤3：按照上述体系混合之后，将PCR管放入PCR仪器进行扩增。PCR程序如下：

1预变性  94℃ 10分钟

2变性  94℃ 1分钟

3复性  50.5℃ 5秒

4延伸  72℃  25秒

2至4循环 30次

5延伸  72℃  10分钟

PCR酶采用的是PrimeSTAR^TM HS DNA Polymerase(TAKARA)

步骤4：电泳观察。取出PCR终产物5μL与上样缓冲液混合，100V，2％琼脂糖凝胶电泳30分钟，在凝胶电泳成像仪下紫外观察，结果见图1所示，其中，泳道M为marker，泳道1-3为土壤样品。可见泳道1也可特异性扩增出440及200bp的条带，泳道2-3未有目标条带出现。将扩增出的条带回收后进行测序。测序结果表明，所扩增的440bp条带即为引物设计时红球菌属的目标基因片段，其序列如SEQID No.3所示，为红球菌DNA扩增产物；200bp条带为目标基因片段的一部分，其序列在红球菌基因组中的位置为5076659-5076864。则据此判定泳道1土壤样品含有红球菌，泳道2-3土壤样品则不含有红球菌。

对泳道1-3的样品进行培养鉴定，与用本发明所述引物进行PCR扩增的鉴定结果一致。

实施例3：本发明所述引物扩增红球菌DNA的稳定性试验

参照实施例1和实施例2，选取红球菌、糖丝菌等不同的菌株纯培养物，提取其基因组DNA。或取1至2克土壤样品，提取其微生物总DNA。

步骤2：以步骤1得到的DNA为模板，配制为100-200ng/μL的DNA样品，与10-20pmol/μL的PCR引物配成如下50μL反应体系，进行PCR扩增反应：

PCR buffer：10μL

dNTP：4μL

Primer F上游引物：1μL

Primer R下游引物：1μL

DNA：5μL

Taq：0.5μL

ddH₂O：28.5μL

步骤3：按照上述体系混合之后，将PCR管放入PCR仪器进行扩增。PCR程序如下：

1预变性  94℃ 10分钟

2变性  94℃ 1分钟

3复性  50.5℃ 5秒

4延伸  72℃ 25秒

2至4循环 30次

5延伸  72℃ 10分钟

PCR酶采用的是PrimeSTAR^TM HS DNA Polymerase(TAKARA)

步骤4：电泳观察。取出PCR终产物5μL与上样缓冲液混合，100V，1％琼脂糖凝胶电泳30分钟，在凝胶电泳成像仪下紫外观察。将扩增出的440bp和200bp条带回收后进行测序。测序结果表明，所扩增的440bp条带为引物设计时红球菌属的目标基因片段，其序列如SEQ ID No.3所示，为红球菌DNA扩增产物；200bp条带为目标基因片段的一部分，其序列在红球菌基因组中的位置为5076659-5076864。对样品进行培养鉴定，与用本发明所述引物进行PCR扩增的鉴定结果一致。说明本发明所述引物扩增红球菌DNA重复性好，结果稳定。

实施例4：本发明所述引物扩增红球菌DNA的灵敏度试验

取纯化的红球菌基因组DNA配制梯度浓度的DNA溶液，原液所含DNA为200ng，依次稀释为DNA浓度为10^-1ng、10^-2ng、10^-3ng、10^-4ng、10^-5ng，参照实施例1所述方法进行PCR扩增，取扩增产物进行凝胶电泳，结果可见在DNA含量在10^-2处，仍可扩增出440bp目的条带和200bp条带，而DNA含量在10^-3处，无任何条带出现，说明在DNA模板含量为200×10^-2ng时，引物仍可准确扩增出红球菌DNA，灵敏度高。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。