猪柠檬酸脱氢酶基因IDH3β启动子的分离克隆和鉴定

摘要

本发明属于猪的动物生物技术与育种领域，具体涉及猪异柠檬酸脱氢酶基因IDH3β的启动子的克隆、活性分析和启动子区突变研究。本发明的步骤包括：从猪血液中提取基因组DNA，设计引物，采用TAIL-PCR技术经过两轮扩增获得猪IDH3β基因上游5’侧翼2447bp的基因组碱基序列，并进行序列比较分析和遗传变异检测；采用5’端缺失策略扩增IDH3β基因上游5’侧翼区，将获得的DNA序列构建荧光素酶报告基因载体，测定其启动子活性，鉴定IDH3β基因启动子。本发明克隆的猪异柠檬酸脱氢酶基因IDH3β的启动子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：4所示。本发明为猪的遗传改良应用提供了基因资源。

说明书

技术领域

本发明属于猪的育种和分子生物学技术领域，具体涉及一种猪柠檬酸脱氢酶基因IDH3β启动子的分离、克隆和鉴定。

背景技术

中国是世界第一养猪和猪肉消费大国。据联合国粮农组织(FAO)统计资料，2007年中国生猪存栏4.464亿头、出栏6.208亿头、猪肉总产量为0.472亿吨，分别占全世界47.43％、47.28％和45.75％，均居世界首位。目前我国规模化猪场饲养的猪种大多为外来瘦肉型品种，如杜洛克猪、大白猪、长白猪等，这些品种生长速度快，饲料报酬和瘦肉率高，满足了市场对瘦肉的迫切需求；但同时在追求高瘦肉率的情况下也导致了猪肉品质的下降。肌内脂肪(intramuscular fat，IMF)含量被认为是目前最重要的肌肉品质性状指标。国内外对猪肌内脂肪进行的相关研究结果表明，沉积在肌肉内的脂肪含量与肉的嫩度和风味有直接关系，2-3％的IMF含量可产生理想的口感，但目前对瘦肉率的选择已使上述商品猪肉中平均IMF含量下降到1-1.5％，低于最佳范围；同时PSE(pale，soft，exudative)和DFD(dry，firm，dark)猪肉的出现也使一些名牌瘦肉型猪声誉大减。随着人民生活水平的不断提高，人们对猪肉的消费由量转为了质，猪肉风味品质也越来越成为消费者追求的主要目标，再加上我国传统的饮食文化、烹饪习惯，对于猪肉品质有着更高的要求，风味品质优良、瘦肉率适度的优质猪肉必将成为消费者的首要选择，市场对优质猪肉的需求将会进一步扩大。

目前，常规育种技术在实现猪杂种优势利用、性能测定、遗传评估及优良品种培育方面取得了显著成就，不仅培育了目前现有的许多商业猪种，而且这些品种的遗传改良也获得了成功。但由于对复杂性状(如品质性状等)分析较难、选择效率较低、育种周期较长，已不能满足当前养殖业对优良品种的需求，培育突破性品种的难度越来越大，在品种改良上所获得的遗传增益日趋平缓，尤其在聚合高产、优质、抗逆等多个优良性状的品种选育方面进展不大。转基因技术的发展克服了常规育种方法周期长、预见性差、选择效率低的局限性，能够打破物种界限，克服生殖隔离困难，实现优良基因重组和聚合，定向选育优质、高抗动物新品种。例如：2006年4月，美国密苏里-哥伦比亚大学的赖良学等获得了转线虫fat-1基因(ω-3去饱和酶基因)的体细胞克隆猪。其体内表达的转基因可以将猪体内的ω-6系饱和脂肪酸转化为ω-3系不饱和脂肪酸，提高了ω-3系脂肪酸含量，降低了ω-6/ω-3的比例，大大提升了猪肉的营养价值。这充分说明了转基因育种技术与常规育种技术有机结合将成为取得猪育种水平新突破的重要途径。

我国是世界上猪种资源最丰富的国家，拥有48个地方品种，位居世界第一，约占世界猪种资源总量的1/3。我国的地方猪种不仅种类繁多，而且种质特性各异。经过长期驯养和选育，地方猪种大都具备肉质优良、繁殖力高、抗逆性强、耐粗饲等特点，但地方品种瘦肉率低、生长速度慢、饲料转化率低的缺点，限制了其规模化饲养。如何采用现代的动物分子与细胞育种技术，把地方猪种和外来品种两类优异基因资源聚合在一起，并缩短品种培育的进程，是急需解决的问题。

而解决这些问题的重要途径之一就是利用转基因技术生产转基因猪新品种(系)，尽快使我国优质转基因猪研究整体水平与国际同步，大幅度提高我国畜牧科技的自主创新和国际竞争能力，为我国猪种改良、优异种质资源高效利用和种质资源创新提供技术支撑，促进农业可持续发展。

生产转基因猪就势必涉及到与猪经济性状相关的具有重要育种价值的功能基因和调控元件的筛选和鉴定。目前，已确认的用于猪的主效基因有兰尼啶受体(Rynadine receptor 1，RYR1)基因和酸肉(Renderment Napole，RN)基因等。影响猪肌内脂肪含量的功能基因包括了心脏脂肪酸结合蛋白(Heart Fatty Acid Binding Protein，H-FABP)、脂肪组织脂肪酸结合蛋白(Adipocyte Fatty Acid-binding Protein，A-FABP)、钙蛋白酶抑制蛋白(calpastatin，CAST)、氟烷基因(Halothane Gene，Hal)、激素敏感脂肪酶(hormone-sensitive lipase，HSL)、肌肉生长抑制素基因(Myostatin)、甘油二酯酰转移酶(Diacylglyceral Acyltransferase，DGAT)、过氧化物酶体增殖因子活化受体γ(PPARγ)等。影响肌肉嫩度的因素主要有不同肌肉纤维类型组成以及MyoD家族成员MEF3和myf6、钙蛋白酶I(CAPN1)和钙蛋白酶II(CAPN2)、钙蛋白酶抑制蛋白(calpastatin，CAST)等基因。一般认为，提高I型肌纤维生成，可以明显提高红肌纤维比例，从而可以改善猪肉肉质。

与功能基因的研究相比，有关启动子的分离克隆和功能研究的报道要少得多。目前，克隆启动子的方法包括利用基因组文库筛选、利用启动子探针质粒载体筛选、利用启动子捕获方法分离和鉴别和利用PCR技术克隆启动子。本实验室采用Siebert等(1995)发明的基因组PCR步行(genome PCR walking)方法获得了猪骨骼肌特异表达基因MEF2C、Myf5和Myf6基因的启动子序列。该方法结合了Suppression PCR和利用接头的PCR的优点，具有简单高效、特异性强、无须筛选引物、一次性获得的未知序列较长等优点，已广泛应用于基因的启动子或其他上游调控序列的快速克隆(0ubrahim等，2005；Jura等，2005)。启动子结构和功能研究国内外通常采用生物信息学技术对获得的启动子序列进行初步预测和分析，了解启动子序列可能包含的调控元件，为功能验证奠定基础。采用顺序缺失法分析启动子的结构，采用瞬时转染和点突变等研究启动子活性和特异性，采用共转染技术、酵母单杂交和凝胶阻滞法等分析与调控元件作用的反式作用因子。本实验室采用顺序缺失、点突变和凝胶阻滞法等研究了MEF2C、Myf5、Myf6、ATGL和ADAMTS1基因的结构和功能。

目前，可用于转基因的启动子数量和种类非常有限，主要是来源于病毒的启动子，如巨细胞病毒(CMV)、肉瘤病毒40(SV40)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、人单纯疱疹病毒(HSV)和乙型肝炎病毒(HBV)等组成型启动子，他们可以在几乎所有组织和物种细胞中调控外源基因表达，也没有时空特异性。用这些启动子调控目标基因表达时，由于大量目标蛋白在不需要的细胞或不需要的阶段积累，往往容易造成动物形态和生理功能异常，以致早衰或死亡。在哺乳动物上虽然有少量特异性启动子分离克隆的报道，但主要涉及动物乳房组织中特异表达，即β-乳球蛋白(BLG)、酪蛋白基因调控序列、乳清酸蛋白(WAP)调控序列和乳清白蛋白基因调控序列等(樊宝良等，2005；崔奎青等，2005；Hennighausen等，1992；Whitelaw等，2000)，涉及肌肉和脂肪组织的种类和数量非常有限。能用于转基因猪制备的、拥有自主知识产权的高效表达载体和组织特异表达载体也很少。简清等(2004)通过改造斑马鱼MLC2启动子，构建了肌肉特异性表达红色荧光蛋白表达载体，获得了肌肉特异性高效表达红色荧光蛋白转基因斑马鱼。2000年，孟庆勇构建了含有牛骨骼肌α-actin启动子和人工合成的羊GRF序列的真核表达载体。2007年，章倩倩构建小鼠CMV-SP(肌肉特异启动子)双启动子高效特异表达载体。此外，人们对启动子上的顺式调控元件和反式作用因子的种类、结构和相互协调关系也不是十分清楚，限制了启动子利用。因此，很有必要开展猪重要调控元件的筛选、克隆和功能验证，获得具有自主知识产权的可供选择的启动子，构建高效、稳定、特异表达的载体，满足转基因猪制备的需求。

异柠檬酸脱氢酶(Isocitrate Dehydrogenase，IDH)是生物体三羧酸循环(Tricarboxylic Acid Cycle)中的重要的限速酶，负责催化异柠檬酸氧化脱羧成α-酮戊二酸，并将氧化型NAD或NADP还原成NADH或NADPH(Chen，1990)。IDH在生物体内有两种存在形式，即以NAD为电子受体的NAD-依赖型异柠檬酸脱氢酶(NAD-IDH)和以NADP为电子受体的异柠檬酸脱氢酶(NADP-IDH)。NADP-IDH广泛存在于真核生物的各种细胞器(如叶绿体、线粒体等)、胞质和原核细胞中(Camacho等，1995)。NAD-IDH则普遍被认为仅存在于真核生物线粒体中，但有研究者在嗜酸硫细菌中也发现了NAD-IDH，因此它的分布也似乎变得广泛起来(Inoue等，2002)。在哺乳动物中，主要有三种形式的IDH，即胞液型NADP-IDH(IDH1)、线粒体型NADP-IDH(IDH2)和线粒体型NAD-IDH(IDH3)。IDH3是由α、β、γ三个亚基以2∶1∶1的比例组成的异源四聚体，每个四聚体各有两个ADP、异柠檬酸、NAD、NADH以及Mn²⁺结合位点，但未发现其他金属离子结合位点。其中α亚基为催化亚基，并有一部分的异柠檬酸结合位点，而β、γ亚基可能与调节有关，上面有ADP结合位点(Kim等，1999)。

目前国内外对猪IDH3β启动子的克隆、启动子活性分析以及启动子区突变研究等还是空白。

发明内容

本发明的目的在于分离、克隆和鉴定猪柠檬酸脱氢酶基因IDH3β启动子，为猪的遗传改良提供基因资源。

本发明通过分离克隆方法，得到一种猪异柠檬酸脱氢酶基因IDH3β的启动子，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：4所示。

其中如序列表SEQ ID NO：1所示的启动子是位于猪IDH3β基因上游5’侧翼的基因组核苷酸序列，其长度为2447bp。

制备如序列表SEQ ID NO：1所述的猪IDH3β基因上游5’侧翼2447bp的基因组核苷酸序列的方法，按照如下步骤：

(1)以成年中国地方猪品种“梅山猪”的血液提取基因组DNA，作为TAIL-PCR模板，根据猪柠檬酸脱氢酶基因IDH3β基因第一外显子的核苷酸序列设计正向引物，所述引物编号及其核苷酸序列如下所示：

正向引物1：GTCAGGGGCGTGGGTAAGACAGAGCA；

正向引物2：ACACACACGCCTTTGAGGTCAGGTCTG；

正向引物3：TACTTCAGTGAGCCCGCCACAAACAG；

反向引物4：NGTCGASWGANAWGAA；

反向引物5：GTNCGASWCANAWGTT；

反向引物6：WGTGNAGWANCANAGA；

反向引物7：NCAGCTWSCTNTSCTT。

①将上述正向引物1分别与反向引物4、5、6以及7配对进行PCR扩增。

②以正向引物1和反向引物4扩增得到的PCR产物作为模板，用正向引物2与反向引物4配对再进行PCR扩增。以正向引物1和反向引物5扩增得到的PCR产物作为模板，用正向引物2与反向引物5配对再进行PCR扩增。以正向引物1和反向引物6扩增得到的PCR产物作为模板，用正向引物2与反向引物6配对再进行PCR扩增。以正向引物1和反向引物7扩增得到的PCR产物作为模板，用正向引物2与反向引物7配对再进行PCR扩增。

③以正向引物2和反向引物4扩增得到的PCR产物作为模板，用正向引物3与反向引物4配对再进行PCR扩增。以正向引物2和反向引物5扩增得到的PCR产物作为模板，用正向引物3与反向引物5配对再进行PCR扩增。以正向引物2和反向引物6扩增得到的PCR产物作为模板，用正向引物3与反向引物6配对再进行PCR扩增。以正向引物2和反向引物7扩增得到的PCR产物作为模板，用正向引物3与反向引物7配对再进行PCR扩增。

按上述操作，应用TAIL-PCR方法就能完成第一轮基因组步移，正向引物3分别与反向引物4/5/6和7配对进行PCR扩增的产物经纯化后克隆测序，并进行序列分析，获得如序列表SEQ ID NO：2所述的核苷酸序列。

(2)根据SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列再次设计如下所述的正向引物，实施TAIL-PCR第二轮基因组步移，所述引物编号及其核苷酸序列如下所示：

正向引物8：GTCAGGGGCGTGGGTAAGACAGAGCA；

正向引物9：ACACACACGCCTTTGAGGTCAGGTCTG；

正向引物10：TACTTCAGTGAGCCCGCCACAAACAG。

TAIL-PCR第二轮基因组步移的实施过程与第一轮相同，PCR扩增产物经纯化后克隆测序，并进行序列分析，获得如序列表SEQ ID NO：3所述的核苷酸序列。

(3)将获得的如序列表SEQ ID NO：2和3所示的核苷酸序列进行拼接，拼接后的序列中包含猪异柠檬酸脱氢酶基因IDH3β基因的第一外显子序列，除去拼接序列中的第一外显子序列，获得如序列表SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

本发明提供了猪柠檬酸脱氢酶基因IDH3β基因启动子的鉴定及其启动子活性测定方法，其步骤如下：

(1)设计引物：采用生物信息学的方法对如序列表SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列进行转录因子结合位点预测。

(2)根据上述预测结果，结合序列表SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列和猪柠檬酸脱氢酶基因IDH3β基因第一外显子核苷酸序列(GenBank登录号为：DQ507859)设计引物，所述引物编号及其核苷酸序列如下所示：

正向引物11：GCCACGCGTGAGAGAGACGCTTTCATA；

正向引物12：GACACGCGTGCAGCCTCTGAGAAACTG；

正向引物13：GACACGCGTTCCCCAAGATGAGAACCA；

正向引物14：GACACGCGTCGCCTTTAGCGTCGGACA；

正向引物15：GCCACGCGTACTTAGGTCCTCCTTTGA；

正向引物16：GACACGCGTACATAAACAGGGTGACCG；

正向引物17：GTAACGCGTGTTCTGTGCCGCATCAGC；

正向引物18：GTAACGCGTCGCATCAGCCTCCAGGGG；

正向引物19：GTAACGCGTCAGGGGAAGGGGTGCGTA；

正向引物20：GTAACGCGTGGGGTGCGTAGGAGTACC；

正向引物21：GCCACGCGTGGAGTACCTAACGCAGGA；

正向引物22：GCGACGCGTCGCAGGAGGATGAAAAGTA；

正向引物23：GCCACGCGTGGATGAAAAGTAAGCACGAG；

正向引物24：GCCACGCGTCACGAGCTTTGTGTTGGA；

正向引物25：GCCACGCGTGTGTTGGAGGAAAAGAGAGAG；

正向引物26：GCCACGCGTAAAAGAGAGAGCCACCCG；

正向引物27：GATACGCGTGTAGAGGCGCAGAGCCGC；

正向引物28：GATACGCGTGTAGAGGCGCAGAGCCGC；

正向引物29：GATACGCGTAGAGCCGCGCTGGATTCC；

反向引物30：GTACTCGAGTTCGCCGTAGGAAGTCGC。

以猪基因组DNA为模板，用上述正向引物11-29与反向引物30配对分别进行PCR扩增，PCR产物回收并纯化。

(3)将步骤(2)所获得的产物与pGL3-Basic载体连接(见图3)，经鉴定正确无误后转染猪肾细胞，测定其活性。其活性测定的结果如图4和图5所示。

本发明提供了序列表SEQ ID NO：1中包含的1处304bp的插入突变，其序列如序列表SEQ ID NO：4所示。

其制备步骤包括：根据如序列表SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列设计引物，其引物的编号及核苷酸序列如下：

正向引物31：TGGCTCTGTCCAAGGGTT；

反向引物32：AACTGGGATTTGTACTGC。

在猪基因组DNA中进行PCR扩增，PCR扩增片段经琼脂糖凝胶电泳检测。

本发明详细制备方法参见“具体实施方式”。

附图说明

序列表SEQ IDNO：1：是本发明克隆的猪柠檬酸脱氢酶基因IDH3β基因上游5’侧翼2447bp的启动子的核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO：2：是本发明实施第一轮TAIL-PCR克隆的猪柠檬酸脱氢酶基因IDH3β基因上游5’侧翼的部分启动子的核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO：3：是本发明实施第二轮TAIL-PCR克隆的猪柠檬酸脱氢酶基因IDH3β基因上游5’侧翼的部分启动子的核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO：4：是本发明克隆的猪柠檬酸脱氢酶基因IDH3β基因启动子区304bp插入突变的核苷酸序列。

图1：是猪柠檬酸脱氢酶基因IDH3β基因5’侧翼区插入突变分型结果。

图2：是荧光素酶报告基因表达载体pGL3-Basic的图谱，外源片段将插入Xho I和Mlu I内切酶将pGL3-Basic酶切后的多克隆位点。

图3：是部分重组质粒的酶切鉴定。图中1、3、5、7为pGL3-Basic空载体的双酶切，2、4、6、8分别为pGL-IB279、pGL-IB395、pGL-IB1254以及pGL-IB2282重组质粒的酶切结果。

图4：是猪柠檬酸脱氢酶基因IDH3β基因启动子区重组质粒荧光素酶相对活性的测定结果。图中：(A)pGL-IBs重组质粒构建示意图；(B)用直方图表示的荧光素酶相对活性，误差线用标准差标示，重复数为3。

图5：是pGL-IB395和pGL-IB395+304重组质粒荧光素酶相对活性的测定结果。用直方图表示的荧光素酶相对活性，误差线用标准差标示，重复数为3。

具体实施方式

实施例1：猪柠檬酸脱氢酶基因IDH3β基因上游5’侧翼序列的制备

采用TAIL-PCR方法(Liu等，1995)分离猪柠檬酸脱氢酶基因IDH3β的启动子序列，该方法每次步移须经二轮PCR扩增，PCR反应条件见表1。

表1.TAIL-PCR的三轮扩增条件

反应体系如下：(1)第一轮：100ng猪基因组DNA，0.2μM基因特异引物1(SE)，2μM随机引物R(R1、R2、R3和R4)，2.5μL 2mM dNTP，1U Taq DNA聚合酶，2.5μL 10×Taq DNA聚合酶缓冲液，加入至总体积25μL；(2)第二轮。将第一轮PCR产物稀释50倍，取1μL作为模板，0.2μM SE基因特异引物2(SF)，2μM随机引物R(R1、R2、R3和R4)，2.5μL 2mM dNTP，1U Taq DNA聚合酶，2.5μL 10×TaqDNA聚合酶，加入至总体积25μL；(2)第三轮：将第二轮PCR产物稀释10倍，取1μL作为模板，0.2μMSE基因特异引物3(SG)，0.2μM随机引物R(R1、R2、R3和R4)，2.5μL2mM dNTP，1U TaqDNA聚合酶，2.5μL 10×Taq DNA聚合酶缓冲液，加去离子水至总体积25μL，同时，设计两个对照：将基因特异引物SG分别换成基因特异引物4(SH)和R，其他不变。将第三轮PCR扩增产物回收、克隆和测序。序列分析后，以该序列为模板，设计基因特异引物，继续步移。本发明中猪异柠檬酸脱氢酶基因IDH3B启动子序列分离的引物，所述引物编号及其核苷酸序列如下所示：

正向引物1：GTCAGGGGCGTGGGTAAGACAGAGCA；

正向引物2：ACACACACGCCTTTGAGGTCAGGTCTG；

正向引物3：TACTTCAGTGAGCCCGCCACAAACAG；

正向引物8：GTCAGGGGCGTGGGTAAGACAGAGCA；

正向引物9：ACACACACGCCTTTGAGGTCAGGTCTG；

正向引物10：TACTTCAGTGAGCCCGCCACAAACAG；

反向引物4：NGTCGASWGANAWGAA；

反向引物5：GTNCGASWCANAWGTT；

反向引物6：WGTGNAGWANCANAGA；

反向引物7：NCAGCTWSCTNTSCTT。

①将上述正向引物1分别与反向引物4、5、6以及7配对进行PCR扩增。

②以正向引物1和反向引物4扩增得到的PCR产物作为模板，用正向引物2与反向引物4配对再进行PCR扩增。以正向引物1和反向引物5扩增得到的PCR产物作为模板，用正向引物2与反向引物5配对再进行PCR扩增。以正向引物1和反向引物6扩增得到的PGR产物作为模板，用正向引物2与反向引物6配对再进行PCR扩增。以正向引物1和反向引物7扩增得到的PCR产物作为模板，用正向引物2与反向引物7配对再进行PCR扩增。

③以正向引物2和反向引物4扩增得到的PCR产物作为模板，用正向引物3与反向引物4配对再进行PCR扩增。以正向引物2和反向引物5扩增得到的PCR产物作为模板，用正向引物3与反向引物5配对再进行PCR扩增。以正向引物2和反向引物6扩增得到的PCR产物作为模板，用正向引物3与反向引物6配对再进行PCR扩增。以正向引物2和反向引物7扩增得到的PCR产物作为模板，用正向引物3与反向引物7配对再进行PCR扩增；

④按上述操作，TAIL-PCR就完成第一轮基因组步移，正向引物3分别与反向引物4/5/6和7配对进行PCR扩增的产物经纯化后克隆测序，并进行序列分析，获得如序列表SEQ ID NO：2所述的核苷酸序列。

⑤根据SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列再次设计正向引物，实施TAIL-PCR第二轮基因组步移。TAIL-PCR第二轮基因组步移的实施过程与第一轮相同，PCR扩增产物经纯化后克隆测序，并进行序列分析，获得如序列表SEQ ID NO：3所述的核苷酸序列。

⑥将获得的如序列表SEQ ID NO：2和3所示的核苷酸序列进行拼接，拼接后的序列中包含IDH3β基因的第一外显子序列，除去拼接序列中的第一外显子序列，获得如序列表SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

实施例2：猪柠檬酸脱氢酶基因IDH3β上游5’侧翼序列突变的检测方法

选择2头国外血缘猪品种“大白猪”和2头中国地方猪品种“梅山猪”提取基因组DNA，根据实施例1获得的猪柠檬酸脱氢酶基因IDH3β的2447bp的5’侧翼序列为试验材料，设计以下引物，引物编号及核苷酸序列如下所示：

正向引物31：TGGCTCTGTCCAAGGGTT；

反向引物32：AACTGGGATTTGTACTGC。

用引物31和32在上述2头大白猪和2头梅山猪基因组DNA中进行PCR扩增，PCR反应体系为25μl，其中模板DNA为50ng，dNTPs浓度为200μmol/L，每条引物浓度为0.3μmol/L，1U的Taq DNA聚合酶(Biostar International，Canada)，加去离子水至总体积25μl；PCR反应程序：94℃预变性4min；然后94℃变性50s、58℃退火50s、72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸7min。

不同猪种的PCR产物经纯化(参见武汉生工公司UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒说明书)、克隆后，进行序列测定。扩增产物经克隆测序后，采用CLUSTALW分析发现，该区域存在一段304bp的插入突变，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：4所示。当个体存在该插入突变时，扩增产物是一条大小为369bp(即A等位基因)的片段；当个体没有该片段的插入时，扩增产物是一条大小为673bp(即B等位基因)的片段。猪柠檬酸脱氢酶基因IDH3β的分型结果如图1所示。

实施例3：含有猪柠檬酸脱氢酶基因IDH3β上游5’侧翼序列表达载体的构建

1.引物设计

根据pGL3-Basic载体(购自美国Promega公司)的多克隆位点和猪ACL基因启动子序列的特征，采用缺失的方法设计引物，在上下游引物5’端分别有XhoI和MluI酶切位点(酶切位点序列加下划线，如表3所示)，并在酶切位点识别序列上游分别加上3个保护碱基，保证酶切位点不丢失。以大白猪基因组DNA为模板进行PCR反应，PCR扩增的退火温度为58℃。引物编号及其核苷酸序列如下所示：

正向引物11：GCCACGCGTGAGAGAGACGCTTTCATA；

正向引物12：GACACGCGTGCAGCCTCTGAGAAACTG；

正向引物13：GACACGCGTTCCCCAAGATGAGAACCA；

正向引物14：GACACGCGTCGCCTTTAGCGTCGGACA；

正向引物15：GCCACGCGTACTTAGGTCCTCCTTTGA；

正向引物16：GACACGCGTACATAAACAGGGTGACCG；

正向引物17：GTAACGCGTGTTCTGTGCCGCATCAGC；

正向引物18：GTAACGCGTCGCATCAGCCTCCAGGGG；

正向引物19：GTAACGCGTCAGGGGAAGGGGTGCGTA；

正向引物20：GTAACGCGTGGGGTGCGTAGGAGTACC；

正向引物21：GCCACGCGTGGAGTACCTAACGCAGGA；

正向引物22：GCGACGCGTCGCAGGAGGATGAAAAGTA；

正向引物23：GCCACGCGTGGATGAAAAGTAAGCACGAG；

正向引物24：GCCACGCGTCACGAGCTTTGTGTTGGA；

正向引物25：GCCACGCGTGTGTTGGAGGAAAAGAGAGAG；

正向引物26：GCCACGCGTAAAAGAGAGAGCCACCCG；

正向引物27：GATACGCGTGTAGAGGCGCAGAGCCGC；

正向引物28：GATACGCGTGTAGAGGCGCAGAGCCGC；

正向引物29：GATACGCGTAGAGCCGCGCTGGATTCC；

反向引物30：GTACTCGAGTTCGCCGTAGGAAGTCGC。

以猪基因组DNA为模板，用正向引物11-29与反向引物30配对分别进行PCR扩增。

2.双酶切

将PCR产物回收纯化后进行双酶切，酶切体系如下：PCR纯化产物30μL，10H缓冲液4μL，20U XhoI和MluI内切酶(宝生物工程(大连)有限公司)，加水至总体积40μL。37℃酶切5h以上后电泳回收。同时，将pGL3-Basic载体也进行酶切(pGL3-Basic载体如图2所示，用Xho I和Mlu I内切酶进行双酶切，外源片段将插入该位点)，双酶切体系总体积为20μL，其中含有经过质粒提取获得的pGL3-Basic载体DNA 7μL(约5μg)，10H buffer2μL，10U Xho I和Mlu I内切酶，加水至总体积20μL。放入烘箱，37℃酶切5h以上后电泳回收。为防止载体的自身连接，回收后立即构建重组子，将其放置在-20℃冰箱保存，放置时间一般不超过2个月。

3.连接

连接反应体系中插入DNA与载体DNA按3∶1的摩尔数进行，反应总体积为10μL，其中，1μL 10 Ligasebuffer，T4DNA连接酶(购自美国Promega公司)1μL，各缺失分析的PCR双酶切纯化产物4.5μL，pGL3-Basic载体的酶切纯化产物1.5μL，双蒸水2μL。在4℃连接过夜。然后转化入大肠杆菌DH5α。

4.重组质粒的原核表达鉴定

挑取转化生长好的单菌落，接种于氨苄青霉素(Amp)抗性的液体LB培养基中(5～8mL，50ng/ml)，37℃于摇床上200r/min培养6h以上。吸取1μL大肠杆菌DH5α菌液，进行PCR鉴定。

5.质粒的抽提及酶切鉴定

质粒抽提用QIAprep Spin Miniprep Kit质粒抽提试剂盒(购自德国Qiagene公司)进行，主要操作步骤如下：

(1)第一次使用该质粒抽提试剂盒时，从-20℃取出RNA酶A(德国Qiagene公司的试剂盒自带)全部加入到缓冲液(Buffer)P1中，混匀后，做好标记置于4℃保存。将该试剂盒的其它试剂保存于室温；

(2)取PCR鉴定为阳性的菌液约1.5mL置于1.5mL离心管中，于室温下8000rpm离心1min；

(3)加入250μL Buffer P1，在旋涡振荡器上振荡直至打散细菌团块为止，加入Buffer P2250μL，轻轻上下混匀呈半透明状，将离心管室温下放置1min，加入350μL Buffer P3，上下颠倒数次混匀，可见有白色絮状物出现，于室温下13000rpm离心10min；

(4)从试剂盒中取出DNA结合柱，插入到2mL离心管中(上述德国Qiagene公司提供的试剂盒提供)，做好标记。取上清于DNA结合柱中，室温下13000rpm离心1min；

(5)弃流出液，加入750μL Buffer PE，室温下13000rpm离心1min；

(6)为进一步除去残留Buffer PE，室温下13000rpm再离心1min；

(7)将结合柱移入一新的1.5ml离心管中，加入50μLBufferEB于柱中心，室温下放置30min后，于室温13000rpm离心1min，为达到更好的抽提效果，可将离心管中的Buffer EB取出加入到结合柱里再洗涤一次。

质粒提取后进行浓度和纯度测定并进行双酶切鉴定。酶切结果如图3所示，酶切后琼脂糖电泳检测，结合PCR鉴定结果，送菌液测序以鉴定重组子中插入序列的正确性，测序结果表明插入序列是目的序列，且未发生突变。

实施例4：猪柠檬酸脱氢酶IDH3β基因上游5’侧翼序列转录活性检测方法的建立

1.细胞培养

将猪肾细胞(Porcine Kidney Cell，PK-15，2006年9月购于湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学内的中国典型培养物保藏中心，英文简称CCTCC)在10％新生牛血清的含双抗DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’sMedium)培养基(购自美国Gibico公司)中，其培养条件为37℃，浓度为5％的CO₂。当细胞处于指数生长期时，进行传代培养，操作如下：用洗涤液快速洗涤细胞一次，加入2mL胰酶，37℃消化约2min，在显微镜下观察到细胞已成球状后立即弃去胰酶，向培养基中加入细胞生长培养基，并用吸管吹打细胞使其尽量以单个细胞的形式存在。将获得的细胞悬液一部分留在细胞培养瓶中传代培养，另一部分等体积分装到24孔板中，置于培养箱中培养用于转染。

2.瞬时转染

当24孔板中细胞达到60％～70％的汇合率时准备转染。首先将重组质粒和pGL3-Basic载体(购自美国Promega公司)用Buffer EB(购自美国Promega公司)稀释成100ng/μL，将内参照质粒载体pRL-TK(购自美国Promega公司)稀释成20ng/μL，稀释后将两者按体积比50∶1的比例混合，取30μL混合质粒DNA和6μLLipofectamine^TM2000分别加入150μLopti-MEM培养基(购自美国Invitrigen公司)中，轻轻混匀，室温下静置5min后将两者混合均匀，再室温静置20min。取转染液100μL加A24孔板的其中一个孔中，这样每个重组质粒可保证3次重复。均匀混合后放入培养箱中温育，6h后弃净24孔板里液体，加入10％新生牛血清的无双抗DMEM培养基继续培养(美国Gibico公司)。24h后收集细胞。

3.荧光素酶相对活性测定与分析

使用双荧光素酶测定活性，测定前，准备以下试剂：(1)1×磷酸裂解缓冲液(PLB)，用购自美国Promega公司试剂盒提供的5×PLB与灭菌水按体积比1∶4比例混合，每次使用前配置；(2)LARII(Luciferase Assay ReagentII荧光分析剂)，将美国Promega公司试剂盒提供的冻干荧光分析底物重悬于10mL LARII中，混匀、分装后做上标记置于-70℃保存备用；(3)Stop&Reagent，每次使用前配置，将50×Stop &Substrate(终止剂)与Stop &Buffer(终止缓冲剂)按体积比为1∶50混合。试剂配置完毕后进行荧光素酶活性测定，操作步骤如下：

(1)将上述24孔板中转染有目的DNA的贴壁细胞用1×PBS洗涤一次，弃去残液，加入100μL新鲜配制的1×PLB，室温下，置于摇床上振荡15min以裂解细胞；

(2)将裂解液收集到1.5mL离心管，做好标记；

(3)取若干个1.5mL离心管，均加入100μLLARII溶液(-70℃取出，室温下融化)，备用；

(4)打开TD20/20照度计(购自美国Promega公司)电源开关，仪器自检300s后，进入“home”主菜单，按下“0”设定空白，按下“setup”(设置)设定各种参数，包括：Display(显示)：3s；integrate time(整合时间)：15s；repeat：(重复)3。灵敏度选用默认值，设定好后返回“home”；

(5)在“home”状态下，在含100μL LARII溶液的1.5mL离心管中加入上述样品20μL，用吸头混匀后，放入样品检测池中，按“go”，仪器自动处理，计算出萤火虫荧光素酶活力，显示“ready”，此时取出1.5mL离心管，再加入100μL新鲜配制的Stop &Reagent，混匀后，放回样品检测池中，按“go”，仪器便会再计算出海肾荧光素酶活力(内参照)，并计算出两种荧光素酶活力比值，即荧光素酶相对活力。记录结果，然后用同样方法检测下一个样品。待全部测定结束将结果输入Excel表格进行数据分析，绘制直方图。结果如图4所示。在所构建的猪柠檬酸脱氢酶IDH3β基因5’侧翼序列的19个重组子中，除pGL-IB58、pGL-IB44和pGL-IB34外，其它重组子的荧光素酶活性与阴性对照均达到显著(P＜0.05)或极显著水平(P＜0.01)，表明他们均具有启动子活性；与阳性对照相比，pGL-IB279活性高很多，表明该基因的启动子活性很高。从图4可以看出，启动子活性开始于pGL-IB82，然后虽然有些波动，但是活性一直下降直到-164bp处，之后活性又开始升高，直到-279bp处活性达到最高，这些表明维持该启动子的基本活性区域位于-82bp到+16bp之间，从-82bp到-279bp之间的179bp区域具有最高的启动子活性。

另外，申请人在猪柠檬酸脱氢酶IDH3β基因上游-217bp处发现一处304bp的插入突变(见图2)，根据此变异，申请人构建了pGL-IB395和pGL-IB395+304重组质粒，并根据同样方法测定了它们的荧光素酶相对活性(结果见图5)，结果表明，pGL-IB395质粒活性较pGL-IB395+304质粒低，且差异显著(P＜0.05)。

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