一种不动杆菌及其在重金属离子生物处置中的应用

摘要

本发明公开一种鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii R9)CGMCC No.3947及其在重金属离子吸附中的应用。该菌对Hg

说明书

技术领域

本发明属于微生物菌种资源及其在生物处置中应用的技术领域。具体说，涉及一种不动杆菌及其在重金属离子吸附中应用的技术领域。

背景技术

重金属是指比重大于4或5g/cm³的金属，约有45种，如铜、锌、铅、钴、锰、镉、汞等。由于人类对重金属的开采、冶炼、加工及商业制造活动日益增多，造成多种重金属进入大气、水、土壤中。这些有毒有害重金属元素的污染会引起一系列的重金属超标、中毒事件，即使在低浓度时，也很容易被水生动植物吸附，近而进入食物链，从而对人类产生较高的健康风险。

目前，常用的方法有传统的物理化学处理和生物吸附法，生物吸附因与传统的吸附剂相比，具有适应性广，能在不同pH、温度及加工过程下操作；金属离子浓度影响小，在低浓度(＜10mg/L)和高浓度(＞100mg/L)下都有良好的金属吸附能力；再生能力强、步骤简单，再生后吸附能力无明显降低等优点，成为相关领域研究的热点[张建梅等，重金属废水的生物处理技术，环境污染治理技术与设备，2003年，4：75-78]。

研究表明，一些微生物如细菌、真菌、藻类等对金属有很强的吸附能力，因此微生物菌体是重金属生物吸附剂的首选材料。国内外已对多种微生物吸附进行了研究，如白腐真菌[李清彪等，白腐真菌菌丝球形成的物化条件及其对铅的吸附，环境科学，1999，20(1)：33-38]、酿酒酵母[宋安东等，酿酒酵母220菌株对铅的生物吸附研究，微生物学报，2004，31(3)：6-10]、类产碱假单胞菌和腾黄微球菌[王亚雄等，微生物吸附剂对重金属的吸附特性，环境科学，2001，22(6)：72-75]、球衣菌[余晨兴等，球衣菌对重金属离子的耐受性及其吸附能力，应用与环境生物学报，2004，11(1)：90-92]，均收到较好结果。

就目前而言，相对为数众多的微生物来说，现有吸附重金属的微生物数量和研究仍显的极少。不动杆菌一般作为条件致病菌，近年研究为微生物耐辐射研究及抗逆性增添了新的材料，但相关重金属吸附研究尚未见报道。因此筛选出新型的重金属吸附微生物菌种和研究基吸附重金属特性，具有重要的科学研究和应用价值。

发明内容

本发明的目的在于通过耐重金属菌株及其在重金属离子中应用具有良好的吸附作用，具有较好的应用前景。

本发明提供了一种鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii R9)及该菌进行重金属离子生物处理中的应用技术方案。

本发明具体提供的鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii R9)从新疆干旱荒漠环境中分离筛选，经分离筛选获得多株菌，经过多级筛选，确定一株编号为R9菌株，该菌对多种重金属离子具有耐受性，其中对铅离子的最大耐受性为2200mg/L。目前，该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏日期为2010年6月25日，保藏号为CGMCC No.3947。

本发明提供的微生物菌株，R9，为革兰氏阴性、无芽孢杆菌；好氧、无运动性；在MM固体培养基(胰蛋白胨5g，牛肉膏1.5g，酵母膏5g，NaCl 5g，磷酸氢二钾3g，KNO₃ 1g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，FeSO₄·7H₂O 0.01g，蒸馏水1L，琼脂18～20g，pH7.3)上，菌落呈白色、较小、圆形、边缘整齐、表面光滑、不透明。利用Biolog GN2检测卡进行生理生化特性的检测，结果表明，菌株R9可以吐温40，吐温80，L-阿拉伯糖，D-半乳糖，龙胆二糖(β16葡二糖)，α-D-葡萄糖，D-甘露糖，甲基丙酮酸，单甲基琥珀酸，乙酸，顺-乌头酸(丙烯三羧酸)，柠檬酸，甲酸，α-羟基丁酸，β-羟基丁酸，α-酮丁酸，α-酮戊二酸，α-酮戊酸，D，L-乳酸，丙二酸，葡糖醛酰胺，D-丙氨酸，L-丙氨酸，L-天冬酰胺酸，L-天门冬氨酸，L-亮氨酸，L-苯丙氨酸，L-脯氨酸，L-焦谷氨酸，L-丝氨酸，L-苏氨酸，γ-氨基丁酸，尿刊酸，丁二胺，2，3-丁二醇为唯一碳源进行生长，参照《伯杰氏细菌鉴定手册》及《常见细菌鉴定手册》对R9菌株进行分类鉴定，再结合16S rDNA序列比对及进化分析确定该菌为隶属Acinetobacter菌属，与该属标准模式菌Acinetobacter baumannii DSM3007T同源性98.9％，因此建议的生物学命名为Acinetobacter baumannii，暂定菌株名称为Acinetobacter baumannii R9，确定该菌株名称为鲍氏不动杆菌(Acinetobacterbaumannii R9)。

进一步。本发明提供了鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii R9)CGMCCNo.3947在重金属离子生物处理中应用技术方案。同时，本发明提拱了菌株鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii R9)CGMCC No.3947对水相重金属离子，尤其是在Pb²⁺生物吸附去除方面的实验数据。

R9菌株可用适宜菌株生长的培养基进行增殖培养，在本发明中选择MM为基础培养基进行菌体的增殖培养及耐重金属离子的特性测定。经检测，30℃恒温条件下菌株R9可在分别含有2200mg/L的Pb²⁺、1200mg/L的Zn²⁺、800mg/L的Cu²⁺、400mg/L的Hg²⁺、300mg/L的Co²⁺的MM培养基表面生长；具有吸附重金属Pb²⁺离子的作用，在溶液中具有良好的吸附Pb²⁺的功能。

将新鲜培养的菌株接种于细菌培养基中，本研究选用TGY液体培养基，于180rpm、30℃、培养48h；发酵培养所获得的培养物经4000rpm离心收集菌体。将0.2g湿菌体加入pH5.0、浓度200mg/L的铅离子溶液中，适当搅拌，20℃吸附50min，可以达到吸附溶液中铅的目的，最大吸附率达到78.1％，最大单位吸附量为15.6mg/g。

通过实施本发明具体的发明内容，可以达到以下有益效果：

1、定向筛选到鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii R9)CGMCC No.3947。

2、本发明提供的鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii R9)CGMCCNo.3947在重金属离子吸附中的应用，对Hg²⁺、Cu²⁺、Co²⁺、Pb²⁺、Zn²⁺五种离子均具有耐受特性，其中对Pb²⁺、Zn²⁺的耐受浓度最大，分别可达2200mg/L和1500mg/L；对Cu²⁺、Hg²⁺的耐受性分别达到800mg/L和400mg/L；对Co²⁺的耐受性为300mg/L。通过本法可以利用菌体的生长吸附铅离子，也可以直接使用湿菌体吸附，最大吸附能力可达39.56mg/g湿菌体。

附图说明：

图1显示为菌株对不同金属离子的耐受性。

图2显示为菌体用量对菌体吸附Pb²⁺效果的影响。

图3显示为菌龄对菌体吸附Pb²⁺效果的影响。

图4显示为温度对菌体吸附Pb²⁺能力的影响。

图5显示为pH对菌体吸附Pb²⁺能力的影响。

图6显示为吸附时间对菌体吸附Pb²⁺效果的影响。

图7显示为Pb²⁺初始浓度对菌体吸附效果的影响。

具体实施方式

以下是本发明提供的菌株仅在环境工程领域水相颗粒物絮凝、染色剂及重金属离子吸附方面的应用试验实例，本发明提供的菌株的应用领域与实施方法并不限定于此。

发明如无特别说明，在以下实施例中采用如下基础培养基。

PDA培养基：称取200g马铃薯，洗净去皮切成小块，加水1000ml煮沸半个小时，纱布过滤，加20g葡萄糖，121℃灭菌20min左右。

察氏培养基：NaNO₃ 3g，K₂HPO₄ 1g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，KCl 0.5g，FeSO₄·7H₂O0.01g，蔗糖30g，H₂O 1000ml，加热溶解，分装后121℃灭菌20min。

实施例一：鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii R9)CGMCC No.3947的培养、鉴定

本发明具体提供了一株从新疆干旱荒漠环境中分离筛选得到的株菌，编号为R9，该菌对多种重金属离子具有耐受性，其中对铅离子的最大耐受性为2200mg/L，目前暂命名为Acinetobacter baumannii R9。本发明提供的菌株菌体生长与繁殖对营养物质无特殊要求，在常见的细菌培养基上均可以生长。可采用斜面传代法、冷冻干燥法、甘油管等常规微生物保藏技术与方法进行保藏及存活性检测。目前，该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏日期为2010年3月26日，保藏号为CGMCC No.3699。

本发明具体提供的耐重金属细菌R9为革兰氏阴性、无芽孢杆菌；好氧、无运动性；在MM固体培养基(胰蛋白胨5g，牛肉膏1.5g，酵母膏5g，NaCl 5g，磷酸氢二钾3g，KNO₃ 1g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，FeSO₄·7H₂O 0.01g，蒸馏水1L，琼脂18～20g，pH7.3)上，菌落呈白色、较小、圆形、边缘整齐、表面光滑、不透明。使用Biolog菌种鉴定仪GN2测试板鉴定(阳性结果见表1)归属为Acinetobacter属成员。再结合16S rDNA序列比对及进化分析确定该菌为隶属Acinetobacter菌属，与该属标准模式菌Acinetobacter baumannii同源性98.9％，建议的生物学命名为Acinetobacter baumannii，暂定菌株名称为Acinetobacter baumannii R9。

表1Biolog Microstation System GN2检测卡测试结果

实施例二：鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii R9)CGMCC No.3947对重金属离子的耐受性

将分离纯化得到的菌株分别接种于含Cu²⁺浓度200mg/L-1000mg/L(每100mg/L为一个梯度)、Zn²⁺浓度100mg/L-1200mg/L(每200mg/L为一个梯度)、Pb²⁺浓度200mg/L-2200mg/L(每200mg/L为一个梯度)、Hg²⁺浓度20mg/L-500mg/L(每20mg/L为一个梯度)、Co²⁺浓度50mg/L-400mg/L(每50mg/L为一个梯度)的固体MM培养基上，30℃恒温培养2天，观察菌株生长情况，检测菌株在各金属离子不同浓度下的生长情况。菌株对各金属离子的最高耐受情况检测结果参见附图1所示。

从检测结果上看，本发明所用的菌株对所检测的五种离子均具有一定的耐受特性，其中对Pb²⁺、Zn²⁺的耐受浓度最大，分别可达2200mg/L和1200mg/L；对Cu²⁺、Hg²⁺的耐受性次之，分别达到800mg/L和400mg/L；对Co²⁺的耐受性最低，为300mg/L。

实施例三：菌体用量对菌体吸附Pb²⁺效果的影响

挑取一环新鲜菌体接种至装有50mL液体MM培养基的500mL三角瓶中，30℃恒温180r/min震荡培养1天，上述培养物经离心(4000r/min，20min)收集菌体，用去离子水反复三次洗涤后收集菌体备用。

精确量取浓度为200mg/L Pb²⁺水溶液20mL，分别称取0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4g的湿菌体加入到上述Pb²⁺水溶液中打散混匀，室温振荡吸附30min后，于13000r/min离心5min，取上清液测定Pb²⁺离子的浓度，并计算其吸附率，结果参见附图2所示。

测定结果表明随着菌体用量增加，Pb²⁺吸附率也随之上升，但在本实验设定的条件下，当菌体用量超过0.2g时，吸附曲线趋于平缓。因此，考虑到最佳吸附效果和节约成本的原因，在本实验限定条件下最适的菌体用量为0.2g。

实施例四：菌龄对菌体吸附Pb²⁺能力的影响

如实施例3所可计数的方法进行菌体的培养、收集及吸附Pb²⁺特性的测定，其中菌体的培养时间分别计定为1d、2d、3d、4天，菌体的用量为0.2g。测定经不同菌龄的菌体吸附、离心处理后上清液中Pb²⁺的残余浓度并计算各菌体对Pb²⁺的吸附去除率。测试结果参见附图3所示。

测试结果表明，菌体培养时间对菌体的吸附Pb²⁺的能力有一定的影响，其中以培养2-3天的菌体吸附能力最大，在本实验测定限定条件下，选择培养2天。

实施例五：温度对菌体吸附Pb²⁺能力的影响

如实施例3中所述的方法进行菌体的培养、收集并进行菌体对特性的测定，其中菌体用量为0.2g、吸附温度分别控制为10℃、20℃、30℃、40℃、50℃；测定各吸附处理温度下经0.1g菌体吸附、离心处理后上清液中的Pb²⁺残余浓度并计算各温度下菌体对Pb²⁺的吸附去除率。结果参见附图4所示。

测定结果显示，在本实验限定的条件下温度对菌体对Pb²⁺吸收能力具有较大的影响作用，在10-40℃的范围内，随温度的上升，菌体的吸收能力逐步升高，40℃后其吸收能力下降。

实施例六：pH对菌体吸附的影响

如实施例3所述的方法进行菌体的培养、收集以及菌体对吸附特性的测定，其中菌体用量为0.1g、吸附温度40℃、Pb²⁺溶液的pH分别以HCl、NaOH调节至2.0、3.5、5.0、6.0、7.0；测定各pH条件下经菌体吸附、离心处理后上清液中Pb²⁺的残余浓度并计算各pH下菌体对Pb²⁺的吸收去除率。结果参见附图5所示。

测定结果表明pH对菌体对Pb²⁺的吸附影响较大。在实验设定的条件下，在pH2-5的范围内随pH增高菌体对Pb²⁺的吸附去除率也随着增加，因此，本研究选用pH5.0为吸附最适pH。

实施例七：吸附处理时间对菌体吸附Pb²⁺效果的影响

如实施例3所述方法进行菌体的培养、收集及菌体对Pb²⁺的吸附特性测定，其中菌体用量为0.1g、Pb²⁺溶液pH为5.0、吸附处理温度40℃、吸附处理时间分别控制为10min、20min、30min、40mi n、50min、60min；测定不同吸附处理时间后离心上清液中Pb²⁺的残余浓度并计算菌体在不同吸附时间下对Pb²⁺的吸附去除率。结果参见附图6所示。

测定结果显示，菌体对Pb²⁺的吸附速度较快。在本实验限定条件下，处理吸附在前10min，菌体吸附率快速上升，随后增加缓慢，至50min时吸附率达到最大(78.1％)。

实施例八：Pb²⁺初始浓度对菌体吸附效果的影响

如实施例3所述方法进行菌体的培养、收集及其对Pb²⁺的吸附特性测定，其中菌体用量为0.2g、Pb²⁺的溶液pH为5.0、吸附处理温度40℃、吸附处理时间50min、Pb²⁺溶液浓度为50-250mg/L；测定各Pb²⁺浓度下经菌体吸附、离心处理后上清液中Pb²⁺的残余浓度并计算各Pb²⁺浓度下菌体对Pb²⁺的吸附去除率及单位菌体吸附量。测定结果参见附图7所示。

测定计算结果显示，溶液中Pb²⁺的浓度对菌体吸附去除效果有较大的影响作用。在本实验限定条件下，0.2g湿菌体对150mg/L以下的Pb²⁺溶液中的Pb²⁺具有较高的吸附去除效果，在98％以上；当Pb²⁺浓度高于150mg/L时，菌体对Pb²⁺的吸附去除率下降，而单位湿菌体对Pb²⁺的单位吸附量开始趋于平稳，吸说明在150mg/L时菌体对Pb²⁺的吸附接近饱合；在本实验中Pb²⁺浓度为200时单位菌体吸附量最大，为15.6mg/g。实验结果同时也说明本发明的菌株可适用于Pb²⁺浓度较低的含Pb²⁺浓度较低的污水或废水的生物处治。

实施例九：菌体对其它金属离子的咐附效果

如实施例3所述方法对进行菌体培养、收集及其对金属离子的吸附实验，其中菌体用量为0.1g、pH 6.0、吸附温度20℃、吸附处理时间40min，测试金属离子溶液分别为100mg/L的Cu²⁺溶液、800mg/L的Zn²⁺溶液、40mg/L的Hg²⁺溶液、50mg/L的Co²⁺溶液，测定菌体在实验条件下对不同金属离子的吸附效果。结果如表2所示。

如表2所示的测定结果表明，在实验设定的条件下菌体对所测定的Cu²⁺、Zn²⁺、Hg²⁺、Co²⁺均具有一定的吸附特性；对Co²⁺吸附效最高，可达97％；对Zn²⁺的单位菌体吸附量最大，可达34.72mg/g，说明菌体具有较高的单位吸附量，对低浓度的Zn²⁺具有良好的吸附效果。

表2菌体对其它金属离子的咐附效果