新型水溶性壳聚糖衍生物及其制备和应用

摘要

本发明公开了一种新型水溶性壳聚糖衍生物及其制备和应用，所述水溶性壳聚糖衍生物是在壳聚糖的结构单元的2位氨基上分别引入果糖和N，N-二乙基乙胺基，所述壳聚糖的分子量在0.5万到100万之间，所述水溶性壳聚糖衍生物的结构通式如下所示，n1、n2、n3、n4分别代表各自结构单元的数目，其中n1≥0，n2≥0，并且n3/(n1+n3+n4)＝0.1％-70％，n4/(n1+n3+n4)＝30％-99.9％。所述水溶性壳聚糖衍生物在水溶液中具有良好的溶解性，提高了抑菌活性的同时还具有良好的DPPH自由基清除能力。

说明书

发明领域

本发明涉及一种新型水溶性壳聚糖衍生物，以及这种衍生物的制备方法。本发明还涉及这种衍生物作为抑菌剂、抗氧化剂和保湿剂的应用。

背景技术

壳聚糖是甲克素脱乙酰化后的一种天然的生物高分子多糖，来源丰富，仅次于木质素。它含有大量的游离氨基，这一特性使之成为自然界中位数不多的带正电荷的生物高分子，也赋予了它独特的生物活性。壳聚糖无毒性，具有良好的生物相容性，抑菌性，可降解性、促进伤口愈合能力等等。在医疗保健、农业、化工等行业具有很大的价值。但是强烈的分子内氢键导致分子量大于5000的壳聚糖难以溶于水，只能溶于稀酸溶液中，这大大限制了壳聚糖的应用。

然而在壳聚糖的骨架上存在着2位氨基和3位、6位羟基三种可反应的活性位点，可以进行化学修饰，通过在重复单元中引入基团，就可以大大削弱壳聚糖分子内的氢键作用，增加它的溶解性，从而拓宽其应用范围并赋予其新的功能。业界公认的能较好地修饰得到水溶性壳聚糖的方法有以下几种：酰化，羧甲基化，磺化，季胺化，醚化等等。

水溶性壳聚糖是壳聚糖衍生物中一种非常重要的衍生物，除了赋予壳聚糖良好的溶解性之外，还可以作为一种重要的中间体。目前水溶性壳聚糖作为一种非常具有应用价值的生物材料，已经在食品、化工及医药行业作为辅料直接使用：

(1)羧甲基壳聚糖：具有较好的抑菌性和保湿性等特点，主要应用于医药和化妆品领域中。但是它的DPPH自由基的清除能力不佳。

(2)季胺化壳聚糖：修饰率0.45以上的衍生物都具有良好的水溶性，还具有良好的抑菌性和螯合金属的能力，主要用于环境保护和日用品中。但是它的DPPH自由基的清除能力不佳。

(3)磺化壳聚糖：低分子量的磺化壳聚糖具有凝血作用，现已应用于医药行业，但是磺化壳聚糖不具有清除DPPH自由基的能力。

(4)酰化壳聚糖：乙酰化50％左右的壳聚糖具有良好的水溶性，此类物质的应用领域现在开发的比较少，主要作为农业土壤改良剂或者作为食品领域中的增稠剂，但是与原料壳聚糖相比，其抗DPPH自由基的能力更弱。

(5)还原糖修饰壳聚糖：特定修饰率下能使壳聚糖具有比较好的水溶性，但是制备时间较长，水溶性改善有限。

修饰壳聚糖以改善壳聚糖的方法有不少，但是现有的方法多多少少都存在一些缺陷，比如-NH₂的取代导致抗氧化活性和抗菌活性的降低，过程太长导致分子量下降明显，溶剂的大量使用等等。所以本发明的初衷在于找到一条安全、绿色的反应路线，同时具备能够低成本、大规模地生产水溶性壳聚糖能力。同时，我们考虑到影响人类身体健康的主要因素之一是从体内和环境中的有害自由基的增加开始的，所以研究开发同时具有抗氧化活性和抗菌活性等能力的安全无毒的水溶性壳聚糖衍生物，对于减缓衰老、增进人类健康具有重要的现实意义。

西弗碱是通过两个等当量的醛和胺的缩合反应形成的，反应机理是由含羰基的醛、酮类化合物与一级胺类化合物进行亲和加成反应，亲和试剂为胺类化合物，带有孤对电子的氮原子进攻羰基基团上带有真电荷的碳原子，完成亲核加成反应，进一步脱水形成西弗碱。西弗碱化合物具有独特的抗菌性能，具有特殊的颜色。果糖是一种还原性己酮糖，可以和壳聚糖上的氨基发生Maillard反应，果糖是一种安全的单糖，常用于作为食物、营养剂和防腐剂。

发明内容

本发明要解决的首要技术问题在于提供一种新型的水溶性壳聚糖衍生物，其在水溶液中具有良好的溶解性，提高了抑菌活性的同时还具有良好的DPPH自由基清除能力。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种水溶性壳聚糖衍生物，是在壳聚糖的结构单元的2位氨基上分别引入果糖和N，N-二乙基乙胺基，所述壳聚糖的分子量在0.5万到100万之间，所述水溶性壳聚糖衍生物的结构通式如下所示：

上述结构通式中，n1、n2、n3、n4分别代表各自结构单元的数目，其中n1≥0，n2≥0，并且果糖的修饰率在0.1％到70％之间，即n3/(n1+n3+n4)＝0.1％-70％；N，N-二乙基乙胺基的修饰率在30％到99.9％之间，即n4/(n1+n3+n4)＝30％-99.9％。需要说明的是，上述结构通式旨在说明水溶性壳聚糖衍生物分子链中含有的结构单元以及结构单元数目，并不代表结构单元的真实排序。

进一步，本发明使用的壳聚糖的脱乙酰度优选在50％到100％之间，即优选(n1+n3+n4/(n1+n2+n3+n4)＝50％-100％。

进一步，果糖的修饰率优选在25％到60％之间。

进一步，N，N-二乙基乙胺基的修饰率优选在40％到75％之间。

本发明要解决的第二个技术问题是提供一种所述的水溶性壳聚糖衍生物的制备方法，具体技术方案如下：

一种水溶性壳聚糖衍生物的制备方法，包括如下步骤：

(1)使壳聚糖和果糖以质量比1∶0.1-100的投料比溶解在质量百分比0.5-20.0％的酸溶液中，在20-120℃下充分搅拌反应，充分反应后所得反应液经透析除杂、冷冻干燥得到中间产物；

(2)中间产物与N，N-二乙胺基氯乙烷(即C1CH₂CH₂N(CH₂CH₃)₂)以质量比1∶0.1-100的投料比置于pH 7-14的水中，加热20-100℃进行反应，反应结束后产物透析除去杂质，冷冻干燥或者真空干燥即得到所述的水溶性壳聚糖衍生物。

进一步，步骤(1)所述的酸溶液可以是甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、盐酸、硝酸、硫酸或磷酸溶液。

进一步，步骤(1)中壳聚糖和果糖的投料质量比优选1∶1～4。

进一步，步骤(1)中所述壳聚糖和果糖的反应温度优选50～120℃。所述壳聚糖和果糖的反应时间一般在1-240小时，在反应过程中，可在420nm波长下紫外分光光度计测定反应程度，用酸碱滴定法测定果糖的接枝率。

进一步，步骤(2)中中间产物和N，N-二乙胺基氯乙烷的投料质量比优选1∶1～3。

进一步，步骤(2)中所述中间产物和N，N-二乙胺基氯乙烷的反应温度优选50～80℃。所述中间产物和N，N-二乙胺基氯乙烷的反应时间一般在0.5-24小时，产物用¹H NMR和IR表征并测定其接枝率。

本发明所述的水溶性壳聚糖衍生物作为抑菌剂的应用。

本发明所述的水溶性壳聚糖衍生物作为抗氧化剂的应用。

本发明所述的水溶性壳聚糖衍生物作为保湿剂的应用。

与现有技术相比，本发明制得的水溶性壳聚糖衍生物是一种重要的衍生物，在pH1-13的水溶液中具有良好的溶解性，提高了抑菌活性的同时还具有DPPH自由基清除能力，可以作为食品保鲜剂、抑菌剂，也可以作为化妆品和护肤品的具有抗氧化活性的添加剂、保湿剂以及天然的色素，用途广泛。

附图说明

图1为红外图谱，从上至下分别为壳聚糖、对比例5制得的壳聚糖果糖西弗碱衍生物、本发明实施例1制得的水溶性壳聚糖衍生物。

图2为本发明实施例1制得的水溶性壳聚糖衍生物的¹H NMR。

具体实施方式

下面以具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明的保护范围不限于此：

实施例1：

取脱乙酰度为90％，分子量为10万的壳聚糖2g溶于2％(质量体积比，下同)的醋酸水溶液，加入2.24g果糖，于70℃充分搅拌反应72小时，在420nm波长下测定其反应程度，之后在纯水中透析4天，冷冻干燥得到中间产物。得到的中间产物与N，N-二乙胺基氯乙烷以1∶2(质量比)的投料比置于pH7的水中，加热60℃，反应4小时。反应结束后产物透析除去杂质，冷冻干燥或者真空干燥即得到所需的壳聚糖衍生物。

得到的水溶性壳聚糖衍生物的结构用¹H NMR和IR表征，修饰率用¹H NMR测定。果糖修饰率为50％，N，N-二乙胺基氯乙烷的修饰率为50％。衍生物的抑菌圈直径列于表1中，DPPH自由基的清除能力列于表2中，吸湿保湿性列于表3中，在纯水中的最大的溶解度列于表4中。

实施例2：

取脱乙酰度为95％，分子量为20万的壳聚糖10g溶于2％(质量体积比，下同)的盐酸中，加入37.33g果糖，于70℃充分搅拌反应48小时，在420nm波长下测定其反应程度，之后在纯水中透析4天，冷冻干燥得到中间产物。得到的衍生物与N，N-二乙胺基氯乙烷以1∶3(质量比)的投料比置于pH 10的水中，加热60℃，反应2小时。反应结束后产物透析除去杂质，冷冻干燥或者真空干燥即得到所需的壳聚糖衍生物。

得到的水溶性壳聚糖衍生物的结构用¹H NMR和IR表征，修饰率用¹H NMR测定。果糖修饰率为42％，N，N-二乙胺基氯乙烷的修饰率为58％。衍生物的抑菌圈直径列于表1中，DPPH自由基的清除能力列于表2中，吸湿保湿性列于表3中，最大的溶解度列于表4中。

实施例3：

取脱乙酰度为90％，分子量为10万的壳聚糖1g溶于1.145％(质量体积比，下同)的醋酸中，加入1.12g果糖，于70℃充分搅拌反应48小时，在420nm波长下测定其反应程度，之后在纯水中透析4天，冷冻干燥得到中间产物。得到的衍生物与N，N-二乙胺基氯乙烷以1∶2(质量比)的投料比置于pH 7的水中，加热60℃，反应2小时。反应结束后产物透析除去杂质，冷冻干燥或者真空干燥即得到所需的壳聚糖衍生物。

得到的水溶性壳聚糖衍生物的结构用¹H NMR和IR表征，修饰率用¹H NMR测定。果糖修饰率为36％，N，N-二乙胺基氯乙烷的修饰率为64％。衍生物的抑菌圈直径列于表1中，DPPH自由基的清除能力列于表2中，吸湿保湿性列于表3中，最大的溶解度列于表4中。

实施例4：

取脱乙酰度为90％，分子量为10万的壳聚糖1g溶于1.145％(质量体积比，下同)的醋酸中，加入1.12g果糖，于70℃充分搅拌反应24小时，在420nm波长下测定其反应程度，之后在纯水中透析4天，冷冻干燥得到中间产物。得到的衍生物以1∶2(质量比)的投料比置于pH 7的水中，加热60℃，反应2小时。反应结束后产物透析除去杂质，冷冻干燥或者真空干燥即得到所需的壳聚糖衍生物。

得到的水溶性壳聚糖衍生物的结构用¹H NMR和IR表征，修饰率用¹H NMR测定。果糖修饰率为26％，N，N-二乙胺基氯乙烷的修饰率为74％。衍生物的抑菌圈直径列于表1中，DPPH自由基的清除能力列于表2中，吸湿保湿性列于表3中，最大的溶解度列于表4中。

实施列5：

我们对实施例1～4制得的壳聚糖衍生物进行了体外对二苯代苦味酰基自由基(DPPH·)清除能力的测定实验。

试剂：二苯代苦味酰基自由基(DPPH·)购自上海百灵威公司，其余试剂均为国产分析纯。

方法：称取一定量水溶性壳聚糖衍生物样品放入试管中，分别加入一定体积的水溶液溶解，配得药物母液浓度为2mg/ml，以此溶液配成药物浓度为0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.5，2.0mg/ml的溶液。加各浓度的样品溶液100μl和0.1mmol/1DPPH溶液100μl于96孔板中(样品实际反应浓度为50μg/ml、16.7μg/ml、5.6μg/ml)，每份设5个平行。样品加入后中速振荡30s，在室温(25℃)和517nm波长下测定其吸光值(A_p)；室温下放置20min后再测定依次；同时测定不加DPPH的样品空白吸收光(A_c：100μl样品+100μl甲醇)和加DPPH但不加样品的吸光值(A_max：100μl DPPH+100μl甲醇)。以100μg/ml V_C作为对照测定抑制率(IR％)。

部分结果列于表2中。

原理：二苯代苦味酰基自由基(DPPH·)是一种很稳定的以氮为中心的自由基，其醇溶液呈深紫色，在517nm处有一吸收峰。当反应系统中存在自由基清除剂时，它可以和DPPH·的单电子配对而使517nm处的吸收峰渐渐消退，而且这种颜色变浅的程度与配对电子数成化学计量关系。因此根据消退速度和峰值改变程度可以用来检测自由基的清除情况，从而评价试验样品的抗氧化能力。与其它方法相比用DPPH·筛选自由基清除剂具有简便、快速的优点。

实施列6：

我们对实施列1～4制得的水溶性壳聚糖衍生物进行了抑菌能力的测定实验。

试验菌：大肠杆菌(Escherichi a coli，E.coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，S.aureus)，由本系微生物实验室提供。

菌种的活化：将受试菌接种于50mL液体培养基(LB培养基)中，37℃100r/min摇床培养过夜。用稀释平板计数法计数，制得CFU为10⁷个/mL的菌悬液备用。

取0.1mL CFU为10⁷个/mL的菌悬液涂布于LB培养皿上，取Φ10mm的牛沣杯放置于培养皿上，在牛沣杯中加入0.2ml的衍生物的0.6％乙酸溶液，每板2个牛沣杯，37℃培养24h。培养结束后测抑菌圈直径。数据列于表1中。

实施例7：

我们对实施列1～4制得的水溶性壳聚糖衍生物进行了吸湿保湿性能的测定实验。

将样品置于烘箱中，在105℃下烘干3h，然后再放入硅胶干燥器中冷却至室温，准确称取1.0g，分别置于用饱和硫酸铵水溶液维持相对湿度(RH)为81％，饱和氯化钙水溶液维持RH为32％的干燥器内吸湿24h，后称各试样的质量。

吸湿率(Ra)＝(W_n-W₀)/W₀×100％

W₀为放置前样品质量，W_n为放置后的样品质量。

在干燥恒重后的样品中加入质量分数为10％的水，然后将其置于RH为81％、32％及硅胶干燥器内，24h后称各试样的质量。

保湿率(Rr)＝H_n/H₀×100％

H₀为放置前水分质量，H_n为放置后水分质量。

对比例1：取抗坏血酸进行比较，实验条件同实施例5，DPPH半清除浓度列于表2中。

对比例2：取原料壳聚糖(脱乙酰度为90％，分子量为10万)进行比较，实验条件同实施例5，DPPH半清除浓度列于表2中，溶解度列于表4中。

对比例3：取透明质酸钠与实施列1-4制得的水溶性壳聚糖衍生物比较它们的吸湿保湿率，实验条件同实施例7，结果列于表3中。

对比例4：取壳聚糖的N，N-二乙氨基季铵盐进行比较，实验条件同实施例5，DPPH半清除浓度列于表2中。

壳聚糖的N，N-二乙氨基季铵盐的制备方法：取脱乙酰度为90％，分子量为10万的壳聚糖1g，分散于20mL纯水中，加入5.34g N，N-二乙氨基氯乙烷，60℃加热1小时之后，将溶解1.24g氢氧化钠的水溶液慢慢滴入反应液中。60℃搅拌反应4小时。反应结束后在纯水里透析4天，冷冻干燥后得到壳聚糖的N，N-二乙氨基季铵盐。

对比例5：与修饰率为51％的壳聚糖果糖西弗碱衍生物进行DPPH半清除浓度的比较，实验条件同实施例5，列于表2中。

壳聚糖果糖西弗碱衍生物的制备方法：取脱乙酰度为90％，分子量为10万的壳聚糖1g溶于1.145％(质量体积比，下同)的醋酸中，加入3.36g果糖，于70℃充分搅拌反应72小时，在420nm波长下测定其反应程度。用¹H NMR和酸碱滴定法测定其修饰率为51％。

表1：抑菌圈直径

  实施例1  实施例2  实施例3  实施例4  大肠杆菌抑菌圈直径(mm)  40.00±0.25  50.50±0.50  58.00±0.30  62.00±0.25  金黄葡萄球菌抑菌圈直径(mm)  45.00±0.35  53.75±0.35  61.00±0.35  64.00±0.25

表2：DPPH自由基的清除能力

 实施列1 实施列2 实施列3 实施列4 对比例1 对比例2 对比例4 对比例5  半清除浓度(mg/mL)  0.9  1.5  1.55  3.85  0.005  6.0  10.0  2.25

表3：吸湿保湿率

表4：溶解度

 实施例1 实施例2 实施例3 实施例4 对比例2  溶解度(g/l)  10.0  10.5  15.0  20.0  0.0