瘦肉型淮猪品系生长性状多基因聚合育种方法

摘要

本发明涉及瘦肉型淮猪品系生长性状多基因聚合育种方法。该方法包括以下操作步骤1、猪的基因组DNA提取；2、引物设计：根据胰岛素样生长因子-I(IGF-I)、垂体特异性转录因子-I(PIT-I)、肝X受体α(LXRα)和黑皮质素受体-4(MC4R)基因序列设计聚合酶链式反应(PCR)扩增引物；3、聚合酶链式反应(PCR)；4、限制性内切酶酶切反应(RFLP)；5、各基因多态性与生长性状相关分析。确定聚合基因型为AADDGGFF的个体生长速度最快，在选择留种后，其他后代不会产生基因分离现象，使后代的生长性能在四个基因型效应上具有最佳效果，而且稳定遗传，使生长性能基因在1个世代内即可达到纯合，加速瘦肉型淮猪快生长品系的培育。

说明书

技术领域

本发明属于动物的繁育技术领域，具体涉及瘦肉型淮猪品系的育种方法。

背景技术

传统生猪的育种方法和单基因标记辅助选择的缺点如下：(1)在猪的育种中，个体遗传评定是基于表型信息和系谱信息进行的，虽然传统育种方法为我们提供利用这种信息进行育种值估计的最佳手段，但在有的情况下这种基于传统育种方法的选择仍不能取得理想的效果，例如低遗传力的性状和阈性状，由于在表型信息中所包含的遗传信息很有限，除非有大量的各类亲属信息，很难对个体作出准确的遗传评定；再如限性性状，对不能表达性状的个体一般只能根据其同胞和后裔的成绩来对其进行评定，如果仅利用同胞信息，则由于同胞数有限，评定的准确性一般较低；如果利用后裔信息，而且后裔信息数量很多，评定的准确性可以达到很高，但世代间隔延长，遗传进展相对较低。(2)单基因选择效率低。猪的生长性状是由微效多基因控制的，而单基因标记辅助选择只根据一个基因进行选择，在选择过程中就会造成影响生长性状的其他优良基因的丢失，造成顾此失彼，如只选择胰岛素样生长因子-I(IGF-I)基因优良个体，则其它基因如黑皮质素受体-4(MC4R)、肝X受体α(LXR α)、PIT-I基因会因选择胰岛素样生长因子-I(IGF-I)基因而丢失，那么这三个基因对生长的下面效应会丢失，从而影响选择效果和进展。

猪生长性状与以下基因相关：胰岛素样生长因子-I(insulin-like growth factor-I，IGF-I)、垂体特异性转录因子-I(pituitary specific transcription factor-1，PIT-I)、肝X受体α(Liver X Receptorα，LXRα)和黑皮质素受体-4(Melanocortin-4 Receptor，MC4R)基因是猪生长性状的微效侯选基因，均可作为标记基因来开展标记辅助选择工作，各基因的多态性在不同品种之间存在差异性。

胰岛素样生长因子-I(IGF-I)是调控机体生长、发育和代谢的一个重要因子，是胰岛素样生长因子(IGFs)家族的重要成员。胰岛素样生长因子-I(IGF-I)主要存在于血液中，大部分由肝脏合成，生长激素与肝细胞表面的生长激素受体结合，使肝细胞以内分泌的方式分泌胰岛素样生长因子-I(IGF-I)进入血液，通过血液循环到达肾，在肾中降解。胰岛素样生长因子-I(IGF-I)主要介导生长激素(GH)发挥促生长作用。另外，胰岛素样生长因子-I(IGF-I)基因在促使体脂的合成，促使乳腺、卵巢等组织的发育，以及促进某些性腺分泌性激素等作用均有重要作用。在猪胰岛素样生长因子-I(IGF-I)基因位点上，不同品种间存在着差异性。王文君等(2002年)用PCR-RFLP方法对南昌白猪和大约克夏猪的胰岛素样生长因子-I(IGF-I)基因的HhaI酶切位点多态性进行研究，并分析了不同基因型对部分生产性状的影响，结果BB型猪在2、4、6月龄的平均重高于AB和AA型猪，而BB和AB型猪背膘厚低于AA型猪，认为选择带有等位基因B的个体，将有可能提高猪个体重和胴体瘦肉率。但李加琪等(2003年)在长白×蓝塘猪资源群的F2代中，应用PCR-RFLP方法检测胰岛素样生长因子-I(IGF-I)基因的多态性，研究发现胰岛素样生长因子-I(IGF-I)基因型对猪断奶后日增重有显著的影响，其中AA型显著高于AB型猪，并且胰岛素样生长因子-I(IGF-I)基因对部分胴体组成性状也有显著的影响。肖书奇等(2008年)采用PCR-SSCP技术在松辽黑猪群体中检测了胰岛素样生长因子-I(IGF-I)基因的5’UTR、外显子4的遗传多态性，扩增的5’UTR片段没有发现多态，而第4外显子中有多态并产生3种基因型，其中AA型断奶后日增重和平均背膘厚显著高于AB型和BB型，AA型瘦肉率显著低于AB型和BB型。可见，胰岛素样生长因子-I(IGF-I)基因在不同品种猪大都有多态性，但基因效应却不大一致。

垂体特异性转录因子-I(PIT-I)也称为POU1F1，参与调节机体的生长与发育，对垂体激素分泌细胞的基因转录起重要调节作用。猪的垂体特异性转录因子-I(PIT-I)基因已被定位在13号染色体上的q46区域，其cDNA序列全长876bp，编码292个氨基酸，由调控区、6个外显子和5个内含子组成。在猪垂体特异性转录因子-I(PIT-I)基因位点上，不同品种间存在着不同的多态性。Tuggle(1993年)等对垂体特异性转录因子-I(PIT-I)基因多态性与猪生长和胴体性状的相关性研究中，在中国的梅山猪中发现了1个垂体特异性转录因子-I(PIT-I)基因的BamHI的多态位点，但在5个美国猪种中并没有发现相同的多态位点。Yu(1995年)等发现，垂体特异性转录因子-I(PIT-I)基因经RsaI酶切产生的EE型日增重和眼肌面积高于EF、FF型。Franco(2005年)等采用PCR-RFLP技术分析长白公猪PIT-1基因，经RsaI酶切产生2个等位基因(A：710、774、153、108bp；B：388/322、774、153、108bp)，发现AB型比AA型有较低的背膘厚。宋成义等(2005年)对杜洛克猪×姜曲海猪F1代杂交猪的垂体特异性转录因子-I(PIT-I)基因内含子3进行PCR-RFLP分析，经MspI酶切产生2个等位基因(C：1680、420bp；D：850/830、420bp)，DD型猪180日龄重和日增重显著高于CD、CC型猪，DD型猪45日龄重和70日龄重显著高于CC型。另外，宋成义等(2007年)研究了11个中国地方猪种和4个国外猪种垂体特异性转录因子-I(PIT-I)基因内含子1的多态性，检测发现国外瘦肉型猪有较高的等位基因A(1926bp)，而除了姜曲海猪外中国地方猪有较高的等位基因B(2239bp)，并且认为AA型显著与初生重相关。俞沛初等(2004年)认为香猪这两处突变可能会造成垂体特异性转录因子-I(PIT-I)基因表达量下降，最终可能导致香猪的生长受到影响。可见，垂体特异性转录因子-I(PIT-I)基因在不同品种猪大都有多态性，但基因效应却不大一致。

肝X受体α(LXRα)典型的分子结构是N末端含一个高度保守的DNA结合区(DNA binding domain，DBD)和一个激活功能区(Activation function domain，AF-1)，C末端含一个相对保守的配体结合区(Ligand binding domain，LBD)和另一个激活功能区(AF-2)。猪肝X受体α(LXRα)基因全长1711bp，位于猪的第2号染色体(SSC2)上，肝X受体α(LXRα)基因主要是在肝脏中表达，在其它与脂代谢密切相关的组织如脂肪组织、肾脏、小肠、肺、肾上腺和巨噬细胞也有大量表达。根据LXRs在人和鼠上对脂肪和肌肉的生成的重要生理作用以及肝X受体α(LXRα)在猪基因组上的定位，M.Yu(2006)为了研究LXRs(α、β)基因是否对猪瘦肉率和脂肪生长有调控作用，利用PCR-RLFP技术发现肝X受体α(LXRα)的两个内切酶(Bsl在第二外显子，HpyCH4Ⅲ在第8内含子)和LXRβ(AciⅠ在第5外显子)存在多态性。还发现猪肝X受体α(LXRα)的BslⅠ多态性与瘦肉率有显著相关；同时与大理石纹有显著相关。因此，肝X受体α(LXRα)基因可能是瘦肉生长的潜在基因。

黑皮质素受体-4(MC4R)是5种已发现的黑皮质受体(MC1R-MC5R)之一。是下丘脑腹内侧核分泌的一类肽类物质，它由332个氨基酸残基组成，是跨膜G蛋白祸联受体的成员之一。区别于MCR家族其他成员的是黑皮质素受体-4(MC4R)不存在于肾上腺皮质、毛囊及胎盘内，而是大量存在于中枢神经系统的各个区域中，包括：大脑皮质、丘脑、下丘脑、脑干和脊索。猪黑皮质素受体-4(MC4R)基因定位于1号染色体q^22～27处，其第7跨膜功能域发生一个错义突变(G→A，D298N)，由此产生了TaqI酶切位点的改变，导致黑皮质素受体-4(MC4R)蛋白第298位氨基酸由天冬氨酸代替天冬酰胺。猪黑皮质素受体-4(MC4R)基因被认为是影响生长肥育性状的主效基因之一，猪黑皮质素受体-4(MC4R)在该突变位点的基因型与一些品系的背膘厚和生长率以及所有品系的采食量呈强相关。

瘦肉型淮猪新品系是以安徽省优良地方品种淮猪为杂交母本，以两个国外优质瘦肉型品种猪为杂交父本，通过群体继代选育法并结合标记辅助选择方法，经过多年闭锁培育形成的新品系猪。利用中国地方猪种与国外猪种的显著差异，通过杂交方法，可以获得明显的互补效应和杂种优势，杂交后代大多兼具双方的优点。生长速度、瘦肉率、饲料转化率均高于地方品种淮猪。由于淮猪新品系是由三个品种合成系，所以存在着丰富的基因多态性。

发明内容

鉴于胰岛素样生长因子-I(IGF-I)、垂体特异性转录因子-I(PIT-I)、肝X受体α(LXRα)和黑皮质素受体-4(MC4R)基因在生长性状上的重要作用，而且，目前国内外在不同品种猪的基因效应看法不尽一致，同时在这四个基因同时进行多态性聚合分析及与生长性状之间的关系均未进行研究。为此，本申请人承担的国家863计划“猪快生长、高繁殖和优质瘦肉性状多基因聚合技术研究”(NO.2007AA10Z171)和国家支撑计划子课题“淮猪高繁殖优质瘦肉型配套系选育”(NO.2006BAD01A08-09)对这四个对生长性状有关的基因进行了研究，并进行了基因聚合分析，研究出了在瘦肉型淮猪品系中的多基因聚合方法，即本发明提供一种瘦肉型淮猪品系生长性状多基因聚合育种方法。

实现上述目的的技术解决方案如下：

瘦肉型淮猪品系生长性状多基因聚合育种方法包括以下操作步骤：

(1)、猪的基因组DNA提取

在仔猪出生当天，取猪的耳缘组织，从猪的耳缘组织中提取猪的基因组DNA；

(2)、引物设计

根据胰岛素样生长因子-I(IGF-I)、垂体特异性转录因子-I(PIT-I)、肝X受体α(LXRα)和黑皮质素受体-4(MC4R)基因序列设计聚合酶链式反应(PCR)扩增引物如下表，胰岛素样生长因子-I(IGF-I)扩增片段长度为179bp，扩增片段位于胰岛素样生长因子-I(IGF-I)基因编码序列的374bp至552bp，突变位点位于扩增片段的第116bp处；垂体特异性转录因子-I(PIT-I)基因扩增片段长度为638bp，扩增片段位于垂体特异性转录因子-I(PIT-I)基因从第5外显子第4bp至第6外显子第5bp处，突变位点位于垂体特异性转录因子-I(PIT-I)基因第5内含子第262bp处，即扩增片段的第322bp处；肝X受体α(LXRα)基因扩增片段长度为173bp，扩增片段位于从第2外显子38bp至第2内含子的第33bp处，突变位点位于肝X受体α(LXRα)基因第2外显子处的第155bp处，即扩增片段的第117bp处；黑皮质素受体-4(MC4R)基因扩增片段长度为226bp，扩增片段位从黑皮质素受体-4(MC4R)基因序列的1269bp至1494bp处，突变位点位于黑皮质素受体-4基因1424bp处，即扩增片段的第156bp处；

 基因  上游引物 下游引物 IGF-I  5’-AGCCCACAGGGT ACG GCT C-3’ 5’-CTTCTAGGAGCCTTGGGCAT-3’ PIT-I  5’-ATACAATGAGAAAGTGGGAGC-3’ 5’-CAATACTGGGAGGTGAGATGG-3’ LXRα  5’-AGTCTCTGGGAAGCTCCAG-3’ 5’-CCCTACCTCCTCCAAAGGC-3’ MC4R  5’-TACGTGACCATATTGATTG-3’ 5’-ATAACAGATGATCTCTTATG-3’

(3)、聚合酶链式反应(PCR)

分别制备胰岛素样生长因子-I(IGF-I)的聚合酶链式反应体系25μl、垂体特异性转录因子-I(PIT-I)的聚合酶链式反应体系25μl、肝X受体α(LXRα)的聚合酶链式反应体系25μl和黑皮质素受体-4(MC4R)基因的聚合酶链式反应体系25μl；每个聚合酶链式反应体系包括浓度为2.5mmol/l的脱氧核苷三磷酸2μl，四种聚合酶链式反应体系每种体系分别单独加入上表中相对应基因的浓度为10mmol/ml的上游引物和浓度为10mmol/ml的下游引物各0.5μl，浓度为10U/μl聚合酶(Taq)0.4μl，浓度为50ng/ul的DNA基因组模板2μl，含氯化镁浓度为20mmol/l的10×聚合酶链式反应缓冲液2μl，加水至终体积25μl，并混合均匀；

聚合酶链式反应条件如下：

将上述胰岛素样生长因子-I(IGF-I)的聚合酶链式反应体系、垂体特异性转录因子-I(PIT-I)的聚合酶链式反应体系、肝X受体α(LXRα)的聚合酶链式反应体系和黑皮质素受体-4(MC4R)基因的聚合酶链式反应体系分别在以下条件下反应：

①温度94℃预变性5分钟；

②温度94℃变性：胰岛素样生长因子-I为30秒、垂体特异性转录因子-I为35秒、肝X受体α为30秒、黑皮质素受体-4为30秒；

③退火温度：胰岛素样生长因子-I为58℃30秒、垂体特异性转录因子-I为61℃35秒、肝X受体α为58℃30秒、黑皮质素受体-4为58℃30秒；

④温度72℃延伸：胰岛素样生长因子-I(IGF-I)为30秒、垂体特异性转录因子-I(PIT-I)为35秒、肝X受体α为30秒、黑皮质素受体-4为30秒；

⑤重复第②～④步骤30个循环；

⑥温度72℃延伸7分钟，最后降温至4℃保存；

得到四种基因的聚合酶链式反应扩增产物，即胰岛素样生长因子-I基因的PCR扩增产物、垂体特异性转录因子-I基因的PCR扩增产物、肝X受体α基因的PCR扩增产物和黑皮质素受体-4基因的PCR扩增产物；其中胰岛素样生长因子-I(IGF-I)基因扩增片段长度为179bp；垂体特异性转录因子-I(PIT-I)基因扩增片段长度为638bp；肝X受体α(LXRα)基因扩增片段长度为173bp；黑皮质素受体-4(MC4R)基因扩增片段长度为226bp；

(4)、限制性内切酶酶切反应(RFLP)

取胰岛素样生长因子-I(IGF-I)基因的PCR扩增产物10ul于聚合酶链式反应管中，加入浓度为10U/μl的限制性内切酶(Hha I)0.5μl，限制性内切酶的缓冲液2μl，加水至终体积20ul，并混匀；在37℃恒温下酶切反应4小时，酶切产物经2.5％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统中观察并记录酶切结果，胰岛素样生长因子-I(IGF-I)基因的扩增产物具有2个酶切位点，其中1个酶切位点，即第4外显子处116bp位点有一多态，产生2个等位基因：其中116bp处无切点的为等位基因A(151bp+28bp)，116bp处切开的为B等位基因(116bp+35bp+28bp)；含有151bp+28bp条带的命名为AA型；含有151bp+28bp+116bp+35bp条带的命名为AB型；含有116bp+35bp+28bp条带的命名为BB型；

取垂体特异性转录因子-I(PIT-I)基因的PCR扩增产物10ul于聚合酶链式反应管中，加入浓度为10U/μl的限制性内切酶(RsaI)0.5μl，限制性内切酶的缓冲液2μl，加水至终体积20ul，混匀；在37℃恒温下酶切反应4小时，酶切产物经2.0％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统中观察并记录酶切结果，垂体特异性转录因子-I(PIT-I)基因扩增产物具有2个酶切位点，产生2个等位基因：其中322bp处切不开的为D等位基因(469bp+168bp)，322bp处可切开的为E等位基因(322bp+147bp+168bp)；含有469bp+168bp两条带的命名为DD型；含有469bp+322bp+147bp+168bp条带的命名为DE型；含有322bp+147bp+168bp条带的命名为EE型；

取肝X受体α(LXRα)基因的PCR扩增产物10ul于聚合酶链式反应管中，加入浓度为10U/ul限制性内切酶(Bsl I)0.5ul，内切酶的缓冲液2μl，加水至终体积20ul，混匀；在37℃恒温下酶切反应4小时，酶切产物经2.5％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统中观察并记录酶切结果，肝X受体α(LXRα)基因扩增产物具有2个酶切位点，其中1个位点被切开，该位点位于117bp处，产生2个等位基因：其中117bp处切不开的为C等位基因(141bp+32bp)，117bp可以切开的为G等位基因(117bp+32bp+24bp)；含有141bp+32bp条带的命名为CC型；含有141bp+117bp+32bp+24bp条带的命名为CG型；含有117bp+32bp+24bp条带的命名为GG型；

取黑皮质素受体-4(MC4R)基因的PCR扩增产物10ul于聚合酶链式反应管中，加入浓度为10U/ul限制性内切酶(TaqI)0.5ul，限制性内切酶的缓冲液2μl，加水至终体积20ul，混匀；在37℃恒温下酶切反应4小时，酶切产物经2.5％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统中观察并记录酶切结果，黑皮质素受体-4(MC4R)基因扩增产物具有1个酶切位点，其中156bp位点可被切开，产生2个等位基因：其中切不开的为F等位基因(226bp)，可被切开的为H等位基因(156bp+70bp)；含有226bp条带的命名为FF型；含有226bp+156bp+70bp条带的命名为FH型；含有156bp+70bp条带的命名为HH型；

(5)、各基因多态性与生长性状相关分析

对生长有利的单个基因的基因型分别是：胰岛素样生长因子-I(IGF-I)基因为BB型；垂体特异性转录因子-I(PIT-I)基因为EE型；肝X受体α(LXRα)基因为GG型；黑皮质素受体-4(MC4R)基因为FF型；但是，由于基因间可产生互作效应，只根据单基因对生长性能的影响而进行选择的话，会产生负面影响，对四种基因的81种基因型进行了聚合基因效应分析，分析结果显示，胰岛素样生长因子-I(IGF-I)、垂体特异性转录因子-I(PIT-I)、肝X受体α(LXRα)和黑皮质素受体-4(MC4R)基因的聚合基因型为AADDGGFF的个体生长速度最快，达90kg日龄最小；因此在大群体世代选育中，只经过1个世代的选育使优良基因达到纯合，加速瘦肉型淮猪快生长品系的培育。

本发明的有益技术效果体现在以下方面

1、多基因聚合的分子标记技术对生长性状进行辅助选择，不受性状度量的限制和环境的影响，提高了选择的准确性。

2、运用多基因聚合的分子标记技术可以进行早期选择，甚至在猪刚出生时就可准确地进行选留，运用该基因聚合方法可以经过一个世代就可以将各基因的优良基因型稳定下来，即经一个世代的选育即将该品系的生长性状的优良基因达到纯合，而常规育种方法要经过大量的生产性能测定和后裔测定，并且要继代选育5个世代以上才能达到需要的效果，大大缩短了世代间隔，加快选择进程。

3、在群体继代选育过程中，由于每世代猪只较多，逐头进行称重测定，其工作量十分庞大，实际育种过程中要花费大量的人力、物力和财力，从猪初生时测定到6月龄，测定100头的群体需要花15万元左右费用，而且称猪过程中会对猪只产生应激，不利于猪的生长；而运用多基因聚合标记技术对猪只从基因型上进行选留，测定100头的群体，只需1周的时间(提取DNA需1天，基因型分析只需4-6天)，需要花费1500元左右，节省了大量的人力、物力和财力，根据测定结果进行限制选配，使后代均产生优良基因型个体。

4、多基因聚合技术优于单基因标记选择，由于生长性状受多个基因的调控，各个相关基因对生长速度起到或多或少的作用，若只根据某一基因标记进行选择，势必会丢失生长性状相关的其它有利基因效应，造成顾此失彼，影响选择效果，所以多基因聚合技术比单基因标记更准确，效果更佳。

5、该方法操作简便，聚合酶链式反应过程中条件要求不高，退火温度范围大，胰岛素样生长因子-I(IGF-I)基因、肝X受体α(LXRα)和黑皮质素受体-4(MC4R)三个基因可以相同的条件进行扩增，不影响扩增结果。根据垂体特异性转录因子-I(PIT-I)基因序列特点，自行设计了引物，将扩增片段长度由1700bp缩小到638bp，使扩增变得更容易，每次扩增时间也缩短了1个小时左右，提高了扩增效率及判断基因型的准确性。

6、由于该基因聚合方法选择的四个基因均对生长性能产生显著的影响，聚合基因效应较强的四个基因的纯合基因型为AADDGGFF，所以在选择留种后，其他后代均产生AADDGGFF基因型，不会产生基因分离现象，使后代的生长性能在四个基因型效应上具有最佳效果，而且稳定遗传，使生长性能基因在1个世代内即可达到纯合。

附图说明

图1为胰岛素样生长因子-I(IGF-I)基因PCR扩增图，

图2为垂体特异性转录因子-I(PIT-I)基因PCR扩增图，

图3为肝X受体α(LXRα)基因PCR扩增图，

图4为黑皮质素受体-4(MC4R)基因PCR扩增图，

图5为IGF-I基因Hha I酶切图，

图6为PIT-I基因RsaI酶切图，

图7为LXRα基因BslI酶切图，

图8为MC4R基因TaqI酶切图。

具体实施方式

下面结合附图，通过实施例对本发明作进一步地描述。

实施例：

瘦肉型淮猪品系生长性状多基因聚合育种方法包括以下操作步骤：

(1)、猪的基因组DNA提取

在仔猪出生当天，用猪耳号钳采取猪的耳缘组织0.2克左右，放入1.5ml的离心管中，倒入75％的酒精1ml左右，然后放入-20℃冰箱保存待用。

从冰箱中取出耳缘组织，用剪刀将其剪碎，倒入DAN组织提取液600ul，其DNA组织提取液配方见表1，提取液现用现配。然后放入55℃温浴12小时，然后加入Tris饱和酚600ul，上下摇动混匀15分钟，用低温高速离心机离心10分钟，离心机转速要求12000转/分钟；用1ml移液器取出上清液至已灭菌的1.5ml离心管中，再加入等体积的Tris饱和酚，再上下摇动混匀15分钟，再离心10分钟(12000转/分钟)；取上清液，加入等体积的Tris饱和酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混匀10分钟，离心10分钟(12000转/分钟)。取上清液加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，混匀10分钟，离心10分钟(12000转/分钟)。取上清液加入2倍体积的冰乙醇(约1ml)，再加1/10体积的约60μl的NaAc(醋酸钠)水平摇动，可见絮状、白色DNA样品出现。将样品置于-20℃冷冻30分钟，取出或挑出DNA或离心(12000转/分钟)10分钟，DNA沉于管底。用75％乙醇洗涤DNA，摇动洗涤后，离心5-10(12000转/分钟)。弃去75％的乙醇，自然干燥后，加入适量(约50μl)TE溶解，放-20℃冰箱中保存。

表1 DNA组织提取液配方(总体积200ml)

  试剂名称  用量(ml)  0.5M EDTA  40  1M Tris·Cl  10  5M NaCl  4  10％SDS  20  蛋白酶K(10mg/ml)  30  ddH₂O  126  合计  200

(2)、引物设计

根据胰岛素样生长因子-I(IGF-I)、垂体特异性转录因子-I(PIT-I)、肝X受体α(LXRα)和黑皮质素受体-4(MC4R)基因序列设计聚合酶链式反应(PCR)扩增引物如下表，胰岛素样生长因子-I(IGF-I)扩增片段长度为179bp，扩增片段位于胰岛素样生长因子-I(IGF-I)基因编码序列的374bp至552bp，突变位点位于扩增片段的第116bp处；垂体特异性转录因子-I(PIT-I)基因扩增片段长度为638bp，扩增片段位于垂体特异性转录因子-I(PIT-I)基因从第5外显子第4bp至第6外显子第5bp处，突变位点位于垂体特异性转录因子-I(PIT-I)基因第5内含子第262bp处，即扩增片段的第322bp处；肝X受体α(LXRα)基因扩增片段长度为173bp，扩增片段位于从第2外显子38bp至第2内含子的第33bp处，突变位点位于肝X受体α(LXRα)基因第2外显子处的第155bp处，即扩增片段的第117bp处；黑皮质素受体-4(MC4R)基因扩增片段长度为226bp，扩增片段位从黑皮质素受体-4(MC4R)基因序列的1269bp至1494bp处，突变位点位于黑皮质素受体-4基因1424bp处，即扩增片段的第156bp处。

 基因  上游引物 下游引物 IGF-I  5’-AGCCCACAGGGT ACG GCT C-3’ 5’-CTTCTAGGAGCCTTGGGCAT-3’ PIT-I  5’-ATACAATGAGAAAGTGGGAGC-3’ 5’-CAATACTGGGAGGTGAGATGG-3’ LXRα  5’-AGTCTCTGGGAAGCTCCAG-3’ 5’-CCCTACCTCCTCCAAAGGC-3’ MC4R  5’-TACGTGACCATATTGATTG-3’ 5’-ATAACAGATGATCTCTTATG-3’

(3)、聚合酶链式反应(PCR)

分别制备胰岛素样生长因子-I(IGF-I)的聚合酶链式反应体系25μl、垂体特异性转录因子-I(PIT-I)的聚合酶链式反应体系25μl、肝X受体α(LXRα)的聚合酶链式反应体系25μl和黑皮质素受体-4(MC4R)基因的聚合酶链式反应体系25μl。

胰岛素样生长因子-I(IGF-I)的聚合酶链式反应体系包括浓度为2.5mmol/l的脱氧核苷三磷酸2μl，胰岛素样生长因子-I的浓度为10mmol/ml的上游引物5’-AGCCCACAGGGTACG GCT C-3’和浓度为10mmol/ml的下游引物5’-CTTCTAGGAGCCTTGGGCAT-3’各0.5μl，浓度为10U/μl聚合酶(Taq)0.4μl，浓度为50ng/ul的DNA基因组模板2μl，含氯化镁浓度为20mmol/l的10×聚合酶链式反应缓冲液2μl，加水至终体积25μl，并混合均匀。

垂体特异性转录因子-I(PIT-I)的聚合酶链式反应体系包括浓度为2.5mmol/l的脱氧核苷三磷酸2μl，垂体特异性转录因子-I的浓度为10mmol/ml的上游引物5’-ATACAATGAGAAAGTGGGAGC-3’和浓度为10mmol/ml的下游引物5’-CAATACTGGGAGGTGAGATGG-3’各0.5μl，浓度为10U/μl聚合酶(Taq)0.4μl，浓度为50ng/ul的DNA基因组模板2μl，含氯化镁浓度为20mmol/l的10×聚合酶链式反应缓冲液2μl，加水至终体积25μl，并混合均匀。

肝X受体α(LXRα)的聚合酶链式反应体系包括浓度为2.5mmol/l的脱氧核苷三磷酸2μl，肝X受体α的浓度为10mmol/ml的上游引物5’-AGTCTCTGGGAAGCTCCAG-3’和浓度为10mmol/ml的下游引物5’-CCCTACCTCCTCCAAAGGC-3’各0.5μl，浓度为10U/μl聚合酶(Taq)0.4μl，浓度为50ng/ul的DNA基因组模板2μl，含氯化镁浓度为20mmol/l的10×聚合酶链式反应缓冲液2μl，加水至终体积25μl，并混合均匀。

黑皮质素受体-4(MC4R)基因的聚合酶链式反应体系包括浓度为2.5mmol/l的脱氧核苷三磷酸2μl，黑皮质素受体-4的浓度为10mmol/ml的上游引物5’-TACGTGACCATATTGATTG-3’和浓度为10mmol/ml的下游引物5’-ATAACAGATGATCTCTTATG-3’各0.5μl，浓度为10U/μl聚合酶(Taq)0.4μl，浓度为50ng/ul的DNA基因组模板2μl，含氯化镁浓度为20mmol/l的10×聚合酶链式反应缓冲液2μl，加水至终体积25μl，并混合均匀。

聚合酶链式反应条件如下：

将上述胰岛素样生长因子-I(IGF-I)的聚合酶链式反应体系、垂体特异性转录因子-I(PIT-I)的聚合酶链式反应体系、肝X受体α(LXRα)的聚合酶链式反应体系和黑皮质素受体-4(MC4R)基因的聚合酶链式反应体系分别在以下条件下反应：

①温度94℃预变性5分钟；

②温度94℃变性：胰岛素样生长因子-I为30秒、垂体特异性转录因子-I为35秒、肝X受体α为30秒、黑皮质素受体-4为30秒；

③退火温度：胰岛素样生长因子-I为58℃30秒、垂体特异性转录因子-I为61℃35秒、肝X受体α为58℃30秒、黑皮质素受体-4为58℃30秒；

④温度72℃延伸：胰岛素样生长因子-I(IGF-I)为30秒、垂体特异性转录因子-I(PIT-I)为35秒、肝X受体α为30秒、黑皮质素受体-4为30秒；

⑤重复第②～④步骤30个循环；

⑥温度72℃延伸7分钟，最后降温至4℃保存；

得到四种基因的聚合酶链式反应扩增产物，即胰岛素样生长因子-I基因的PCR扩增产物、垂体特异性转录因子-I基因的PCR扩增产物、肝X受体α基因的PCR扩增产物和黑皮质素受体-4基因的PCR扩增产物；其中胰岛素样生长因子-I(IGF-I)基因扩增片段长度为179bp；垂体特异性转录因子-I(PIT-I)基因扩增片段长度为638bp；肝X受体α(LXRα)基因扩增片段长度为173bp；黑皮质素受体-4(MC4R)基因扩增片段长度为226bp，见图1、图2、图3和图4。

(4)、限制性内切酶酶切反应(RFLP)

取胰岛素样生长因子-I(IGF-I)基因的PCR扩增产物10ul于聚合酶链式反应管中，加入浓度为10U/μl的限制性内切酶(HhaI)0.5μl，限制性内切酶的缓冲液2μl，加水至终体积20ul，并混匀；在37℃恒温下酶切反应4小时，酶切产物经2.5％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统中观察并记录酶切结果，胰岛素样生长因子-I(IGF-I)基因的扩增产物具有2个酶切位点，其中1个酶切位点，即第4外显子处116bp位点有一多态，产生2个等位基因：其中116bp处无切点的为等位基因A(151bp+28bp)，116bp处切开的为B等位基因(116bp+35bp+28bp)；含有151bp+28bp条带的命名为AA型；含有151bp+28bp+116bp+35bp条带的命名为AB型；含有116bp+35bp+28bp条带的命名为BB型。如图5，第1条带为AA型；第2、3条带为AB型；第4、5、6、7、8条带均为BB型；第8条带为Marker。

取垂体特异性转录因子-I(PIT-I)基因的PCR扩增产物10ul于聚合酶链式反应管中，加入浓度为10U/μl的限制性内切酶(RsaI)0.5μl，限制性内切酶的缓冲液2μl，加水至终体积20ul，混匀；在37℃恒温下酶切反应4小时，酶切产物经2.0％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统中观察并记录酶切结果，垂体特异性转录因子-I(PIT-I)基因扩增产物具有2个酶切位点，产生2个等位基因：其中322bp处切不开的为D等位基因(469bp+168bp)，322bp处可切开的为E等位基因(322bp+147bp+168bp)；含有469bp+168bp两条带的命名为DD型；含有469bp+322bp+147bp+168bp条带的命名为DE型；含有322bp+147bp+168bp条带的命名为EE型。如图6，第1、3、5、7、10条带为DD型；第2、6、9条带为DE型；第4、8条带为EE型；最后1条带为Marker。

取肝X受体α(LXRα)基因的PCR扩增产物10ul于聚合酶链式反应管中，加入浓度为10U/ul限制性内切酶(Bsl I)0.5ul，内切酶的缓冲液2μl，加水至终体积20ul，混匀；在37℃恒温下酶切反应4小时，酶切产物经2.5％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统中观察并记录酶切结果，肝X受体α(LXRα)基因扩增产物具有2个酶切位点，其中1个位点被切开，该位点位于117bp处，产生2个等位基因：其中117bp处切不开的为C等位基因(141bp+32bp)，117bp可以切开的为G等位基因(117bp+32bp+24bp)；含有141bp+32bp条带的命名为CC型；含有141bp+117bp+32bp+24bp条带的命名为CG型；含有117bp+32bp+24bp条带的命名为GG型。如图7中第8、10条带为CC型；第3、6条带为CG型；第1、2、4、5、7、9条带为GG型，最左侧条带为Marker。

取黑皮质素受体-4(MC4R)基因的PCR扩增产物10ul于聚合酶链式反应管中，加入浓度为10U/ul限制性内切酶(TaqI)0.5ul，限制性内切酶的缓冲液2μl，加水至终体积20ul，混匀；在37℃恒温下酶切反应4小时，酶切产物经2.5％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统中观察并记录酶切结果，黑皮质素受体-4(MC4R)基因扩增产物具有1个酶切位点，其中156bp位点可被切开，产生2个等位基因：其中切不开的为F等位基因(226bp)，可被切开的为H等位基因(156bp+70bp)；含有226bp条带的命名为FF型；含有226bp+156bp+70bp条带的命名为FH型；含有156bp+70bp条带的命名为HH型。如图8，第1、2、4、5、8、9、10、11、12条带为FH型；第6、7条带为HH型。

(5)、各基因多态性与生长性状相关分析

根据测定的每头猪的胰岛素样生长因子-I(IGF-I)、垂体特异性转录因子-I(PIT-I)、肝X受体α(LXRα)、黑皮质素受体-4(MC4R)基因型和每头猪的30-90kg阶段日增重、达90kg日龄等数据，经统计，分析出该猪群中各基因的有利基因型，并做显著性检验，经过大量的基因型检测和对瘦肉型淮猪品系一世代的生长性能测定，研究分析出各基因对生长有利的基因型分别是：胰岛素样生长因子-I(IGF-I)基因为AA型；垂体特异性转录因子-I(PIT-I)基因为DD型；肝X受体α(LXRα)基因为GG型；黑皮质素受体-4(MC4R)基因为FF型；但是，由于基因间可产生互作效应，只根据单基因对生长性能的影响而进行选择的话，会产生负面影响，所以应对四种基因型进行聚合基因效应分析，应用SPSS 13.0统计分析软件的GLM程序对淮猪新品系II系的四个基因进行聚合效应分析，建立模型为：

Y＝μ+I+P+L+M+E

其中Y为性状观察值(日增重和达90kg日龄)，μ为群体均值，I为IGF-I基因效应，P为PIT-I基因效应，L为LXRα基因效应，M为MC4R基因效应，E为随机残差效应，由于是四种基因是同一个体的数据，所以此式中E为0。运用SPSS 13.0分析软件的GLM程序对日增重和达90kg日龄进行最小二乘分析，经分析在瘦肉型淮猪品系II系中生长性状四基因存在40种聚合基因型，其中有统计学意义的有7种基因型，分别为AADDGGFF、BBDDGGFF、BBDEGGFF、AADDGGFH、BBDDGGFH、BBDEGGFH和BBDDGGHH，其中日增重高和达90kg日龄最小的基因型只有AADDGGFF(0.734kg/d、177.8天)、AADDGGFH(0.720kg/d、176.1天)，但由于杂合子在继代选育过程中会产生分离现象，无法稳定遗传给下一代，因此在淮猪新品系选育过程中选择四种基因公母猪均为纯合基因型的个体进行留种，即肝X受体α(LXRα)、黑皮质素受体-4(MC4R)、胰岛素样生长因子-I(IGF-I)和垂体特异性转录因子-I(PIT-I)四种基因的聚合基因型为AADDGGFF(0.734kg/d、177.8天)的个体，其后代中均产生AADDGGFF优良基因型个体，不会产生分离，从基因型上最大限度地提高后代的生长性能，在大群体世代选育中，只经过1个世代的选育即可使优良基因达到纯合，加速瘦肉型淮猪新品系II快生长品系的培育。

对瘦肉型淮猪品系II系猪群的生长进行了测定实验，并检测了四个基因的基因型，分析了基因与生长性状间的相关性，具体实验情况分析如下：

判断各基因的有利基因型

(1)胰岛素样生长因子-I(IGF-I)基因多态性及有利基因型

由表3可知，胰岛素样生长因子-I(IGF-I)基因在瘦肉型淮猪品系中存在着丰富的多态性，B(116+35+28bp)等位基因频率为62.95％，占有优势；而基因型分布中以BB型频率最高为48.7％。30-90kg阶段日增重以AA型个体最高，显著高于AB型(P＜0.05)和BB型(P＜0.05)个体；达90kg体重日龄以AA型个体最小为173.4天，显著小于AB和BB型(P＜0.01)个体，其它两种基因型AB和BB之间差异不显著(P＞0.05)，选留BB型的猪比选留AA型的猪生长速度快，AA型比BB型的猪达90kg体重的日龄可以缩短22天左右。因此，胰岛素样生长因子-I(IGF-I)基因在瘦肉型淮猪品系中对生长性状有利基因型为AA型。

表3瘦肉型淮猪品系一世代IGF-I多态性分布及与生长性状的关系

注：肩标有**和*表示差异显著(P＜0.05)，肩标有***和*表示组间差异极显著(P＜0.01)

(2)垂体特异性转录因子-I(PIT-I)基因多态性及有利基因型

由表4可知，垂体特异性转录因子-I(PIT-I)基因D等位基因(469+168bp)占优势，基因频率为77.11％，E等位基因占22.89％，其DD基因型点59.9％，高于其它两个基因型频率。30-90kg阶段日增重以EE型个体最高为0.744kg/d，显著高于其它两种基因型(P＜0.05)；达90kg体重日龄以EE型个体最小为166.2天，极显著低于DD型和DE型(P＜0.01)个体，其它两种基因型DD和DE之间差异不显著(P＞0.05)，选留EE型的猪比选留DD型的猪生长速度快，EE型比DD型达90kg体重时的日龄可以缩短29天左右。因此，垂体特异性转录因子-I(PIT-I)基因在瘦肉型淮猪品系中对生长性状有利基因型为EE型。

表4瘦肉型淮猪品系一世代PIT-I多态性分布及与生长性状的关系

注：肩标有**和*表示差异显著(P＜0.05)，肩标有***和*表示组间差异极显著(P＜0.01)

(3)肝X受体α(LXRα)基因多态性及有利基因型

由表5可知，肝X受体α(LXRα)基因G等位基因频率占85.86％，为优势等位基因，GG基因型频率为76.26％，高于其它两种基因型。根据生长性状数据统计分析，GG基因型个体30-90kg阶段日增重以GG型个体最高为0.694kg/d，极显著高于CC型(P＜0.01)，显著高于CG型(P＜0.05)，CG型显著高于CC型个体(P＜0.05)；达90kg体重日龄以GG型最小为181.8天，显著低于CC型个体(P＜0.01)，同时低于CG型个体，但差异不显著(P＞0.05)，选留GG型的猪比选留CC型的猪生长速度快，达90kg体重时可以缩短50天左右。因此，肝X受体α(LXRα)基因在瘦肉型淮猪品系中对生长性状有利基因型为GG型。

表5瘦肉型淮猪品系一世代LXRα多态性分布及与生长性状的关系

注：肩标有***和*表示差异极显著(P＜0.01)

(4)黑皮质素受体-4(MC4R)基因多态性及有利基因型

由表6可知，黑皮质素受体-4(MC4R)基因两个等位基因F和H的频率基本相等，基因型频率两个纯合子FF和HH相近，分别为24.86％和26.52％，以杂合子FH基因型频率最高为48.62％。30-90kg阶段日增重以FF型个体最高为0.676kg/d，显著高于HH型个体(P＜0.05)，同时也高于FH杂合子，但差异不显著(P＞0.05)；达90kg体重日龄以FF型个体最小为184.4天，低于HH型个体的197.6天(P＞0.05)，也低于FH型个体，但差异都不显著(P＞0.05)，FH和HH型之间差异也不显著(P＞0.05)。即选择FF型的猪留种比选留HH型猪生长速度快，达到90kg体重可以缩短13天左右。因此，黑皮质素受体-4(MC4R)基因在瘦肉型淮猪品系中有利基因型为FF型。

表6瘦肉型淮猪品系一世代MC4R多态性分布及与生长性状的关系

  30-90kg阶段日增重(kg/d)  0.693^**  0.667  0.651^*  达90kg体重日龄(d)  184.4  185.0  197.6

注：肩标有**和*表示差异显著(P＜0.05)，未标者表示与其它组间差异不显著(P＞0.05)

多基因聚合方法

(1)日增重及90kg体重日龄聚合效应

四个基因产生81种基因型，要对81种基因型进行效应分析，必须建立动物模型，根据一般动物模型建立日增重多基因聚合模型，用于检验多基因聚合效应，其模型为：

Y＝μ+I+P+L+M+E

其中Y为性状观察值(日增重和达90kg日龄)，μ为群体均值，I为IGF-I基因效应，P为PIT-I基因效应，L为LXRα基因效应，M为MC4R基因效应，E为随机残差效应，此式中为0。运用SPSS 13.0分析软件的GLM程序对日增重和达90kg日龄进行最小二乘分析，分析结果见表7。

由表7可看出，日增重最高的聚合基因型为ABEEGGHH(IGF-I、PIG-I、LXRα、MC4R下同)，其日增重为1.053kg/d，但有效个体数仅有1头；其次为ABDDGGFF基因型，日增重为0.825kg/d，有效个体数也仅有2头；根据统计分析本试验的有效样本含量为10及10头以上，有效样本含量在10头以上的基因型有7种，分别是AADDGGFF、BBDDGGFF、BBDEGGFF、AADDGGFH、BBDDGGFH、BBDEGGFH和BBDDGGHH，其日增重分别为0.734kg/d、0.707kg/d、0.646kg/d、0.720kg/d、0.661kg/d、0.663kg/d、0.581kg/d，所以，以AADDGGFF聚合基因型的日增重为最大，7种基因型经两两进行检验分析，AADDGGFF(0.734kg/d)与BBDDGGHH(0.581kg/d)、BBDE GGFF(0.646kg/d)差异极显著(P＜0.01)，与其他基因型BBDDGGFH(0.661kg/d)、BBDEGGFH(0.663kg/d)差异显著(P＜0.05)，与BBDDGGFF(0.707kg/d)、AADDGGFH(0.720kg/d)差异不显著(P＞0.05)。说明AADDGGFF聚合基因日增重最大，其次为AADDGGFH(0.720kg/d)、BBDDGGFF(0.707kg/d)型个体，这三种聚合基因型的日增重均显著高于其他基因型，选择这三种基因型(尤其是AADDGGFF型)的个体进行留种，可获得较大的遗传进展，培育出生长速度快(即日增重最大)的新品种。

同样，达90kg体重日龄的有效样本含量在10头以上的有7种基因型，分别是AADDGGFF、BBDDGGFF、BBDEGGFF、AADDGGFH、BBDDGGFH、BBDEGGFH和BBDDGGHH，其达90kg体重日龄分别为177.8天、189.7天、187.0天、176.1天、178.8天、195.5天和208.5天，经两两检验分析，以AADDGGFH聚合基因型个体的日龄最小，即达90kg体重时的日龄最小为176.1天，与AADDGGFF(177.8天)、BBDDGGFH(178.8天)之间差异不显著，而且非常接近，所以这三种基因型(AADDGGFF、AADDGGFH、BBDDGGFH)对达90kg日龄影响较为显著。

表7日增重多基因聚合效应分析(平均数±标准误)

注：同列数据肩标有*和***表示差异极显著(P＜0.01)，标有*和**以及**和***表示差异显著(P＜0.05)，标有相同个数的*表示差异不显著(P＞0.05)

(2)两性状基因聚合

根据实验结果及单基因效应分析结果，胰岛素样生长因子-I(IGF-I)、垂体特异性转录因子-I(PIT-I)、肝X受体α(LXRα)和黑皮质素受体-4(MC4R)基因对瘦肉型淮猪品系生长性状有利基因型分别是AA、EE、GG和FF型，均显著优于其他基因型个体。

由于四个基因的聚合会产生81种不同的聚合基因型，而在淮猪新品系群体中，共检测出40种聚合基因型，经过单因素基因聚合效应分析，日增重较高的聚合基因型为：AADDGGFF(0.734kg/d)、AADDGGFH(0.720kg/d)、BBDDGGFF(0.707kg/d)，均显著高于其它基因型；达90kg体重日龄影响较大的聚合基因型为AADDGGFH(176.1天)、AADDGGFF(177.8天)、BBDDGGFH(178.8天)，考虑到两性状的选择，只有两种基因型可达到双重目的，即在选择日增重高的个体时而不会增加达90kg体重时的日龄，所以只有AADDGGFF(0.734kg/d、177.8天)、AADDGGFH(0.720kg/d、176.1天)符合要求，但由于杂合子在继代选育过程中会产生分离现象，无法稳定遗传给下一代，只有纯合子基因型才能稳定遗传，因此在淮猪新品系选育过程中选择四种基因公母猪均为纯合基因型的个体进行留种，即胰岛素样生长因子-I(IGF-I)、垂体特异性转录因子-I(PIT-I)、肝X受体α(LXRα)和黑皮质素受体-4(MC4R)四种基因的聚合基因型为AADDGGFF(0.734kg/d、177.8天)的个体，其后代中均产生AADDGGFF优良基因型个体，不会产生分离，从基因型上最大限度地提高后代的生长性能，以加快对瘦肉型淮猪品系生长性状的选育进展，提高对生长性状的选择准确性。