油菜素类固醇信号传导的抑制剂

摘要

本发明描述了具有式(I)的化合物，其中X是F、Cl、Br或I；R

说明书

本发明涉及油菜素类固醇信号传导的抑制剂。

油菜素类固醇是涉及许多过程的植物类固醇激素，这些过程包括细胞膨大和分裂、花粉管伸长、维管组织生长、衰老和应激响应的调制。油菜素类固醇由甾醇前体形成。许多涉及油菜素类固醇生物合成的酶通过分析拟南芥突变体例如dwf1、cbb1、dwf4、cpd、det2和ste1/dwf7而被识别。近来，对于番茄dx突变的分析导致一种在油菜素类固醇生物合成最后一步所涉及的酶被识别，该最后一步是油菜素甾酮(castasterone)转换为油菜素内酯——一种最具活性的油菜素类固醇。两种拟南芥同系物可以通过候选基因法进行识别。这些酶和DWF4以及CPD属于细胞色素P450单加氧酶家族。

油菜素内酯被受体激酶BRI1及其共同受体BAK1所感知，这些受体不同于类固醇受体，而位于细胞膜中。通过仍未知的机制，信号被转导至细胞核，并调控油菜素类固醇信号传导中所涉及的类GSK-3/Shaggy激酶：BIN2/UCU1、ASKι、ASKζ和ASKθ(Vert和Chory，2006)。这些激酶在由8个相邻的重复序列SXXXS构成的保守基序处磷酸化属于BES1/BZR1家族的转录因子。这些转录因子的活性因此被阻碍，因为只有其未磷酸化的变体可以与DNA结合并调控基因表达。脱磷酸作用由核蛋白磷酸酶BSU1及其同系物BSL1到3促成。而且，14-3-3蛋白质能结合磷酸化BZR1和BES1，这可能促进其重新定位到细胞质中。

尽管已知许多涉及油菜素类固醇生物合成和信号传导的酶，但是可用的抑制剂却很少。最初知道的选择性油菜素类固醇合成抑制剂是KM-01(Kim等人，1998)。因为其效能低，其应用极为有限。观察到赤霉酸生物合成抑制剂烯效唑(uniconazol)对于油菜素类固醇生物合成具有轻微的抑制作用，这导致油菜素内酯合成抑制剂(brassinazole)(Min等人，1999)和Brz2001(Sekimata等人，2001)的开发。同样地，通过丙环唑(propiconazole)的修饰，鉴定了其他油菜素类固醇抑制剂(Sekimata等人，2002)。油菜素内酯合成抑制剂(brassinazole)作用的靶标是细胞色素P450单加氧酶DWF4的血红素铁。油菜素内酯合成抑制剂(brassinazole)已被广泛用来研究油菜素类固醇的生物合成和作用。此外，油菜素内酯合成抑制剂(brassinazole)被用于遗传筛选，以分离不对该化合物应答的突变体。这导致了转录因子BZR1的识别。

4-[(5-溴-2-吡啶基)氨基]-4-氧代丁酸是琥珀酸与2-氨基-5-溴吡啶的一种单酰胺。在吡啶环的5位上的溴和羧酸基团被认为是其活性的重要特征。最近，通过化学遗传学方法，4-[(5-溴-2-吡啶基)氨基]-4-氧代丁酸被鉴定为油菜素类固醇信号传导抑制剂。4-[(5-溴-2-吡啶基)氨基]-4-氧代丁酸是一种非类固醇化合物，其通过抑制大部分类GSK-3/Shaggy激酶来诱导植物中组成性油菜素类固醇应答。拟南芥具有10种ASKs(拟南芥类GSK-3/Shaggy激酶)，其可以被分成4组。组I激酶(ASKα、ASKγ和ASKε)和组II激酶(BIN2、ASKζ和ASKι)对于4-[(5-溴-2-吡啶基)氨基]-4-氧代丁酸最为敏感。组III激酶ASKθ被适度抑制，而第二组III激酶ASKβ并不被抑制。ASKδ，组IV激酶，对于4-[(5-溴-2-吡啶基)氨基]-4-氧代丁酸也不敏感。这种特异性的原因还不了解。

丁酸4-[(5-溴-2-吡啶基)氨基]-4-氧代-甲酯的CAS登记号为697231-46-2。Burdulene等人(Pharm.Chem.J.，30(1996)：680-682)描述了i.a.2-氨基-5-溴吡啶与琥珀酸酐反应生成bikinin。GB1162 727A公开了N-取代酰胺酸，其促进植物生长。

Asami等人(“Pesticide Chemistry”第19章，(2007)，WILEY-VCH)报导了杀虫剂科学中关于小分子的常识。Ostaszewski等人(J.Molec.Struct.，474(1999)：197-206)公开了对单取代和双取代的吡啶酰胺酯的分子构象的研究。Roma等人(Bioo.Med.Chem.，8(2000)：751-768)报导了关于取代的嘧啶-4-酮-WO 2008/049729A1公开了非类固醇的油菜素类固醇模拟型。

本发明的一个目的是提供油菜素类固醇信号传导的另外抑制剂，其与4-[(5-溴-2-吡啶基)氨基]-4-氧代丁酸相似。优选地，该新的抑制剂的体内抑制活性应当比4-[(5-溴-2-吡啶基)氨基]-4-氧代丁酸的抑制活性高。

因此，本发明提供了具有式(I)的化合物在处理植物，特别是增进植物生长、增加作物产率和/或提供对应激的抗性的用途。

其中X是F、Cl、Br或I；

R¹是CH₃、C₂H₅、C₂H₄R³、C₂H₃R³R⁴、C₃H₇、C₃H₆R³或C₃H₅R³R⁴；

R²是H、CH₃、C₂H₅、C₂H₄R³或C₂H₃R³R⁴；和

R³和R⁴独立地是X、OH或NH₂。

在R¹是丙基残基的该化合物中(即其中所述化合物是丙酯)，C₃H₇、C₃H₆R³或C₃H₅R³R⁴可以通过外部的C原子(正丙基)或通过中间的C原子(异丙基)被连接到羰基的O原子上。

本发明提供了4-[(5-溴-2-吡啶基)氨基]-4-氧代丁酸与小分子的脂肪醇的酯变型，优选用卤素、OH或NH₂取代。本发明的这些4-[(5-溴-2-吡啶基)氨基]-4-氧代丁酸(R¹＝H)的酯变型的成员具有改进的物理化学性质，以便给予植物(被植物或植物细胞处理和体内摄取)。根据本发明可以看出，与4-[(5-溴-2-吡啶基)氨基]-4-氧代丁酸相比，这一组中至少一些成员出乎意外地显示出表现了提高的对于油菜素类固醇信号传导所涉及的激酶的体内(即在给予植物或植物细胞的过程中)抑制活性。

特别地，具有式(II)的化合物

即4-[(5-碘代吡啶-2-基)氨基]-4-氧代丁酸甲酯，与4-[(5-溴-2-吡啶基)氨基]-4-氧代丁酸相比，显示出显著提高的体内作用。式(II)的Cl和Br变型也是特别优选的。另一种优选的化合物是式(I)的乙醇盐形式，即化合物中R¹是C₂H₅并且R²是H。在这种乙醇盐形式中，优选I-、Br-和Cl-化合物。

本发明的化合物是油菜素类固醇模拟型，其可被用于植物技术，例如，促进植物生长、增强对于生物性和/或非生物性应激的抗性或提高作物产率。采用本发明，有可能提高生物质产率。

本发明的另一方面涉及一种增进植物生长和/或提高作物产率的组合物，其包含有效量的式(I)或(II)的化合物。通过将实验室规模设置应用到野外处理，本领域技术人员能够容易调节该“有效量”。本发明的化合物可以根据相应野外的情况，合适的话，施以有效浓度。适合的浓度可以在低到中的μmol/l范围，例如，从1到500μmol/l，优选从5到100μmol/l。本发明的化合物可以溶于植物技术和农业中合适且允许的有机溶剂中，优选DMSO或乙醇，并且用水或缓冲剂的水溶液和/或促进植物生长的化合物和/或植物保护剂稀释至期望浓度。

根据本发明，本发明的组合物被用于处理植物。根据一个特别优选的实施方式，式(I)或(II)的化合物被用作除草剂。尽管用来促进植物生长通常在1到10微摩尔浓度范围或甚至更低有效，但用作除草剂优选在浓度为50微摩尔或更高如50和500微摩尔之间进行。

本发明还涉及一种制备式(II)化合物的方法，其中2-氨基-5-碘-吡啶与甲基琥珀酰卤化物反应，优选甲基琥珀酰氯。将2-氨基-5-碘-吡啶溶于适当的溶剂中，优选四氢呋喃，还包括叔胺，优选三乙胺(优选比2-氨基-5-碘-吡啶为摩尔过量(尤其是10％到40％))。然后加入甲基琥珀酰卤化物(优选在与2-氨基-5-碘-吡啶相同的溶剂中)(优选略微摩尔过量(尤其是2％到10％)，以确保温度不高于50℃，优选不高于45℃，特别地不高于40℃。之后，在20到40℃之间的温度下，特别是在室温(25℃)下，进一步搅拌反应5到60分钟。然后加入水，将pH降低到6.5以下(优选通过加入盐酸)，特别是降低到约6以下。然后用适当的萃取溶剂萃取产物，例如乙醚，并进行洗涤(例如，用稀弱酸，如1％的醋酸)。在减压下将醚挥发之前，可以通过吸湿物质去除残留的水，例如无水硫酸钠。可以进行重结晶，例如从95％的乙醇或甲苯中得到近乎白色的产物。

本发明还涉及一种制备式(III)化合物并随后对其酯化或烷基化以获得式(II)化合物(X是I并且R²是H)的方法。

本发明的这一方法的特征在于2-氨基-5-碘-吡啶与琥珀酸酐反应，获得具有式(III)的化合物。该化合物的羧基随后可以被酯化或烷基化，获得具有式(II)的化合物。

更具体而言，为了制备式(III)的化合物，2-氨基-5-碘-吡啶被溶于合适的溶剂中，优选四氢呋喃。然后加入琥珀酸酐(优选在与2-氨基-5-碘-吡啶相同的溶剂中)(优选与2-氨基-5-碘-吡啶相比是摩尔过量的(尤其是过量10％到40％))，并将混合物回流适当的时间以使反应进行预期程度，优选30min到5h，更优选1到4h，尤其是2h。通过将反应冷却例如到4℃数小时(如1到10小时)，得到粗产物。粗产物可以重结晶，如从95％乙醇中。

式(III)的游离酸随后可以用卤代甲烷、硫酸二甲基酯或重氮甲烷进行烷基化或用CH₃-OH酯化，得到式(II)的物质。

在本发明优选的实施方式中，2-氨基-5-碘代吡啶与甲基琥珀酰氯反应。

通过下述实施例和附图来进一步阐明本发明。

图1：几种吡啶基氨基衍生物在体外抑制ASKs。在不同的衍生物(编号与表1相对应)存在或不存在(-)的情况下，GST-ASK融合蛋白与作为底物的MBP和作为共底物的γ-[32P]-ATP一起温育。化合物1到9(左侧栏)的脂肪族侧链各不相同。用化合物3和11测试杂环氮位置的影响(中间栏；所示的分子结构代表化合物11)。右侧栏显示的是吡啶环中卤素取代基的影响。所使用的化合物浓度为10μM。通过SDS-PAGE分离蛋白质，并用储磷成像屏(storage phosphor imager screen)检测合并的放射性磷酸盐。

图2：化合物15显示出最高的效能。在化合物3、14和15存在浓度为10μM或不存在的情况下，GST-BIN2与MBP和γ-[32P]-ATP一起温育。用SDS-PAGE将蛋白质分离，并且用磷成像屏(phospho imager screen)量化MBP的磷酸化。剩余的活性用对照的％表达。从4个独立测试中计算平均值和标准偏差。

图3：对油菜素类固醇变体表型的影响。油菜素类固醇生物合成突变体cpd和信号传导变体bril-1的7天大的秧苗被转移入含有1μM表油菜素内酯(Epi-BL)或浓度为30μM的化合物10和15的1/2MS介质中，并在长昼条件下温育7天。所有照片都以同样的放大倍数获取。条表示1mm。

图4：化合物10和15在体内是有效的抑制剂。拟南芥原生质体被BZR1-CFP和Myc标记的ASKζ的表达构建体共转化，并用浓度增加的化合物10和15处理。通过蛋白质印迹分析，分别使用多克隆的反-GFP和单克隆的反-Myc抗体，检测BES1-CFP和ASKζ-Myc。Coomassie R250色斑被显示作为负载对照。取决于ASKζ激酶活度，BZR1-CFP可以呈现磷酸化或未磷酸化的形式(由箭头表示)。表明该蛋白质翻译后和修饰的两个ASKζ-Myc带之比未受施加抑制剂的影响。

图5：酯化化合物在植物(planta)中快速水解。拟南芥秧苗被用含有50μM化合物10的1/2MS介质渗透。在过滤之前取对照样品并用HPLC进行分析(A)。15min后可以观察到化合物10的生物转化产物(标记为P)(B)。化合物10、15和17(分别标记为C10、C15和C17)的混合物的色谱被显示，进行比较(C)。插入色谱中的小图框显示的是范围为220到360nm的峰的UV光谱。mAU，在250nm处记录的毫吸收单位。

图6：甲基化增加了组织渗透性。拟南芥秧苗被培育在化合物10和15在1/2MS介质中的50μM溶液中。在所指时间后取出试样，通过HPLC分析化合物15的原位水平。实线表示的是用化合物10培育植物的结果而虚线表示的是用化合物15的结果。从3个独立的实验计算均值和标准偏差。

实施例

通过合成多个具有与4-[(5-溴-2-吡啶基)氨基]-4-氧代丁酸类似结构的衍生物，并且从2个碳原子到6个碳原子改变脂肪族侧链的长度，阐明脂肪族侧链长度和空间构型以及杂环氮位置的重要性。此外，通过引入双键，改变其空间结构。为获得更具活性的抑制剂，制备了在吡啶环的位置5具有氟、氯、溴和碘取代基的衍生物。对该合成的化合物进行体外和体内测试。而且，测定所选化合物的细胞渗透性。

原料和方法

化学药品

合成化合物所用的化学药品购自Fluka(Bucks，瑞士)或Aldrich(Steinheim，德国)。

HPLC和TLC用溶剂来自Roth(卡尔斯鲁厄，德国)。

合成

反应化合物和产物的产率列在表1中。

表1：合成并用于生物活性测试的化合物

^a单位为分钟的保留时间。

^b单位为nm的吸收最大值(在pH4.8)。

^c羧酸基团的pK_a(离解常数的10为底对数的负值)是在50％(v/v)的甲醇中测定的。

^d化合物10、14、和15也分别被称作4-[(5-碘吡啶-2-基)氨基]-4-氧代丁酸甲酯、4-[(5-溴吡啶-2-基)氨基]-4-氧代丁酸和4-[(5-碘吡啶-2-基)氨基]-4-氧代丁酸。

方法A：将溶于15ml四氢呋喃(对于邻苯二甲酸酐为10ml)的25mM二羧酸酐的溶液置于装有回流冷凝器的圆底烧瓶中，并加入20mM溶于10ml四氢呋喃的胺。将混合物回流2h。在反应的最后，产物开始结晶。冷却到4℃数小时后完成结晶。粗产物被抽滤并从95％的乙醇中重结晶，不过邻苯二甲酸衍生物除外，其是从80％的乙腈中重结晶。

方法B：将溶于30ml四氢呋喃的20mM 2-氨基-5-硝基吡啶的溶液置于圆底烧瓶中并加入25mM固体琥珀酸酐。将回流冷凝器安装在烧瓶上并将混合物加热到轻微沸腾，保持2h。随后将反应混合物冷却到-20℃数天。粗产物被抽滤并从热水中重结晶。

方法C：将20mM胺溶解至40ml四氢呋喃和3.5ml(25mM)三乙胺的混合物中，并放入装有回流冷凝器、滴液漏斗和温度计的三口圆底烧瓶中。用磁力搅拌对反应混合物进行搅拌。通过滴液漏斗以温度不超过40℃的速度缓慢加入溶于10ml四氢呋喃的21mM酰基氯溶液。当氯化物被完全加入后，在室温下继续搅拌反应15min。随后将混合物加入到200ml冷水中，并用稀盐酸将pH值调至6。每次用50ml乙醚将产物萃取三次，将结合的醚萃取物用50ml的1％醋酸洗涤。在减压挥发醚之前，用无水硫酸钠除去残留的水份。将淡黄色残留物从95％的乙醇(氯代衍生物)或甲苯(碘代衍生物)中重结晶以得到几乎为白色的产物。

方法D：21mM酰基氯被溶于10ml四氢呋喃中，并加入到如方法C中所述的20mM 2-氨基-5-氯吡啶、3.5ml(25mM)三乙胺和40ml四氢呋喃的混合物中。将混合物搅拌15min后，过滤除去三乙胺氢氯化物。将固体用10ml四氢呋喃清洗，并将混合的滤液进行减压蒸发。

在草酰衍生物的情况，将残留物溶于90ml热的95％乙醇中，并在溶液仍然热的时候进行过滤。将混合物进行搅拌，并在温度不高于40℃的速度下加入溶解于10ml水中的40mM KOH。继续搅拌10min完成反应。分离出的产物是白色的钾盐，其通过抽吸收集。将沉淀物溶于100ml(碘代衍生物：250ml)热水中并过滤。在热的滤液中加入盐酸直到pH为2。通过在4℃培育过夜，分离出的产物是游离酸。将产物通过从95％的乙醇中重结晶来进一步提纯。

在丙二酰和己二酰衍生物的情况，将残留物溶于200ml MeOH中并过滤。将溶液置于装有回流冷凝器、滴液漏斗和温度计的三口圆底烧瓶中并加热到50℃。在搅拌混合物的同时，用滴液漏斗将溶于40ml水中的40mM KOH迅速加入，并将温度维持在50℃。在同样的温度下继续搅拌10min完成反应。通过加入溶解在10ml水中的40mM NH₄Cl来中和剩余的KOH。通过减压将大多数溶剂除去，将残留物溶于水(约200ml)并过滤。加入甲酸至澄清的滤液直到pH为3。通过在4℃培育过夜，分离出的产物是白色晶体。丙二酰和己二酰衍生物分别通过从95％或50％乙醇中重结晶来进一步提纯。

合成的化合物的纯度分析

薄层色谱法(TLC)：将化合物溶于乙醇并置于硅胶60F254预涂层(Merck，Darmstadt，德国)。将平板(plates)放入醋酸乙酯/石油醚/醋酸/水＝100/60/1/1的混合物中显影。通过用短波UV(254nm)辐射平板，观察荧光猝灭。一些化合物在中波UV(302nm)下显示出自体荧光。

高效液相色谱法(HPLC)：HPLC系统包括一个Dionex P680泵、一个ASI-100自动取样器和一个PDA-100光电二极管探测器。该系统装有Macherey-Nagel 250mm×4mm Nucleosil 100-5 C18色谱柱，其前面装有Valco的2μm在线过滤器。用梯度的溶剂A(在15％乙腈中用NaOH将20mM醋酸调至pH4.8)和溶剂B(在60％乙腈中用NaOH将20mM醋酸调至pH4.8)维持1ml/min的恒定流量。用溶剂A的等梯度流开始洗脱1min。然后将溶剂B的浓度在19min内线性升高至100％并保持等梯度另外2min，然后在1min内降低到0％。在注入下一个试样之前，用溶剂A维持色谱柱平衡5min。从220到400nm每隔1nm记录UV光谱。使用10nm的带宽量化250nm时的吸光度。

测定pK_a值

称量50到100mg化合物并溶于50ml 50％(v/v)甲醇中。用50mM NaOH作为标准溶液，用Greisinger electonics GPHR 1400A pH计测定滴定曲线。通过不同的差商方法(ΔpH/ΔV_NaOH)测定等值点并从滴定曲线的50％中和处读取pK_a。

体外和体内激酶测定

ASKs被表达为大肠杆菌(E.coli)BL21中的GST-融合蛋白。通过在25℃下培育50ng GST-融合蛋白30min测定体外激酶，10μg髓磷脂碱性蛋白(MBP；Sigma，St Louis，MO)作为底物和0.15MBqγ-[32P]-ATP作为共底物。反应缓冲液由20mM HEPES pH7.4、15mMMgCl₂、5mM EGTA和1mM DTT组成。对于最初的试验，冷的ATP的浓度高达3μM。用SDS-PAGE分离反应产物并使用Amersham储磷成像屏和Biorad分子成像仪(Molecular Imager)FX量化并入MBP中的放射性的量。用磷酸化带移测定，检测体内激酶活性，其用BZR1-CFP作为底物。

生理学测试

在长昼条件下(16h 50μE·m^-2·s-¹的光照，8h黑夜)，拟南芥Co10或bril-1秧苗在生长箱内(growth camber)、在含有1％蔗糖的1/2MS平板上进行体外生长7天。随后将其转移到补充有不同浓度的抑制剂的平板上，7天之后观察对表型的影响。

植物提取物的HPLC分析

将两周大的拟南芥Co10秧苗用1/2MS或含有100μM的前述化合物10(Rozhon等人，2005)的1/2MS进行真空渗透。15min后和48h后进行取样，用水冲洗并在液氮中研磨成细粉末。称取100mg粉末至反应管中并加入1ml提取缓冲液(20mM TRIS/HCl pH6.8溶于20％的乙腈)。在转速为800rpM的振荡器中培育30min后，将混合物离心，并将上清液用0.2μm过滤器进行过滤。用上述相同设置的HPLC分析提取物。

细胞渗透性测定

将两周大的拟南芥Co10秧苗转移至含有50μM抑制剂的1/2MS介质中。在所指时间点将试样取出，用水冲洗，用滤纸干燥并在液氮中冷冻。为了进行分析，将植物材料在液氮预冷却的研钵中研磨成细粉末。称取约100mg粉末放入1.5ml反应管中并加入1ml20mM pH为9.0的TRIS/HCl。加入50μl的200μM化合物4储液作为内标。80℃下在转速设为800rpm的Eppendorf热型混合器中萃取30min。在15,000g下将萃取物离心5min并收集清澈的上清液。通过加入25μl4M磷酸将清澈的溶液酸化，并在15,000g下离心2min。立即将上清液装入用1ml乙腈和2次1ml 100mM磷酸处理过的PH 100mg固相萃取筒(Varian，Lake Forest，CA)中。用1ml100mM磷酸冲洗柱并真空干燥1min。随后用含有5％乙腈的1ml100mM TRIS/HCl pH 9.0进行洗脱。通过加入15μl 4M磷酸将洗出液酸化，然后如上所述地将其用于HPLC。

结果

合成

通过从取代的氨基吡啶和环羧酸酐或二羧酸一甲酯的氯化物(表1)形成酰胺，制备4-[(5-溴-2-吡啶基)氨基]-4-氧代丁酸和其他衍生物。如有必要，在后一情况，随后通过加碱水解将甲基去掉。其纯度由TLC和HPLC检验。在显影的TLC板上只能观察到一个斑点，期望化合物的峰占HPLC色谱所有峰总面积的至少95％。

ASKs的体外抑制

4-[(5-溴-2-吡啶基)氨基]-4-氧代丁酸是组I和组II ASKs的有效抑制剂。ASKθ，组III ASK，被适度抑制。这一组的第二激酶ASKβ和组IV激酶ASKδ不被抑制。所有组的代表都在大肠杆菌中被表达为重组GST融合蛋白。通过体外激酶测定，该合成的化合物对于所选的ASKS的效能被测试，其用MBP(髓磷脂碱性蛋白)作为底物，γ-[32P]-ATP作为共底物(图1)。

合成了化合物1到5，以研究脂肪族侧链长度变化的影响。最具活性的3号化合物具有由4个碳原子构成的链(图1)。戊二酰(4号；5个碳原子)和己二酰(5号；4个碳原子)衍生物的效能明显较低，而更短的衍生物(1号和2号；分别为2或3个碳原子)则几乎没有作用。在最佳长度的侧链中引入双键使效能完全消失(图1，化合物6)。这表明空间构型极为重要。为了测定脂肪链的羧基对于活性是否是至关重要的或者氧基是否足够，化合物9和10被包括，其分别是化合物3和15的甲基化变型。此外，还检测了化合物8，其是化合物3的结构异构体。如图1中所示，甲基化变型显示出急剧降低的抑制作用，这表明羧基端基是必不可少的。

在确认了最佳侧链后，接下来详细地研究杂环。化合物3和11都具有一个酰氨基琥珀酰侧链，但区别在于杂环氮位置的不同。体外激酶测定显示化合物3更具效能(图1)，这表明杂环氮必须挨着带有酰氨基琥珀酸取代基的位置。先前的数据表明在吡啶环的位置5上的溴取代基对于4-[(5-溴-2-吡啶基)氨基]-4-氧代丁酸的生物活性至为关键。为了测定其他取代基的影响，合成了化合物12到16。如图1中所示，氯、溴、特别是碘代衍生物活性极高。这一效能的顺序可以通过BIN2的残留激酶活性的量化来印证(图2)。相比之下，氟化合物显示极低的效能，并且未被取代的以及硝基衍生物不具备活性。

所有被测试的化合物对于ASKs具有相似的特异性。具有活性的衍生物强烈抑制ASKα、BIN2和ASKζ，而ASKθ仅仅被适度地抑制。被测物质对ASKβ和ASKδ的影响可忽略不计。

ASKs的体内抑制

在油菜素类固醇信号传导中下调ASK活性是至关重要的。ASKs对cpd和bril-1突变体是组成性地活性的，这两种突变体分别在油菜素类固醇生物合成或信号传导中具有缺陷。这导致植物非常矮小，并且具有深绿色向下卷曲的叶子和缩短的胚轴。使用表油菜素内酯——一种油菜素类固醇——能够补救cpd，但对于bril-1却无能为力，而4-[(5-溴-2-吡啶基)氨基]-4-氧代丁酸则能同时补救这两种突变体。为了筛选体内效能，cpd和bril-1突变体被转移到含有浓度为30μM的4-[(5-溴-2-吡啶基)氨基]-4-氧代丁酸衍生物的介质中。用活性化合物处理过的秧苗具有舒展的叶片、伸长的胚轴，并且是淡绿色的。补救表型的效能与体外测试的结果相关。然而，有趣的是，化合物10在体内是高效能的但其体外效能却很低(图3)。

由于这一预料不到的结果，通过一直接的方法来分析对体内ASK活性的抑制作用。已显示一些ASKs在体内将转录因子BZR1、BES1和BEH2磷酸化。这导致这些转录因子的电泳迁移位移，从而检测体内激酶的活性。拟南芥原生质体与CFP-标记的BZR1和Myc-标记的ASKζ的构建物一起发生共转化。之所以选择这两种蛋白是因为它们在原生质体系内恰当的表达。将发生转化的原生质体与不同浓度的化合物10和15以及BZR1-CFP和ASKζ-Myc一起培育，随后用蛋白质印迹法进行分析。根据表型测试，与其游离酸对应物15相似，酯化的化合物10具有很高的活性(图4)。3和9这一对也得到了类似的结果。

为了研究这些相互冲突的结果，对化合物10在体内的表现进行了研究。将化合物10渗透入秧苗，随后用HPLC分析植物提取物。只观察到痕量的化合物10，但是有一个新的峰，标记为P(图5A和5B)。根据其10.7min的保留时间和其UV光谱的最大吸收在252和292nm，可以确认该峰为化合物15(图5B和5C)。因此化合物10在体内是不稳定的，而是快速转化为高活性10，这解释了化合物10在体内和体外效能的差异。3和9这一对也得到了类似的结果。

组织渗透性

物质的细胞渗透性是影响其体内效能的一个重要特性。植物对化合物10和15的摄取通过用这些化合物的溶液处理秧苗以及随后量化内部的(internalised)抑制剂浓度而测定(图6)。由于化合物10快速转化成15，只测到15的原位浓度。两种化合物的原位浓度在最初的3h内上升，然后达到稳定。值得注意的是，植物内部的浓度超过了介质中的浓度。当介质中为50μM时，测得化合物15的原位浓度为约90μM，而当使用化合物10时该浓度可高达190μM。因此，甲基化的化合物显示了更高的组织渗透性并在植物中达到更高的浓度。

近年来，通过分析突变体，对于拟南芥中油菜素类固醇信号传导的认识取得了巨大的进步。近来，知道了三种油菜素类固醇受体和一种共同受体。似乎至少四种ASKs涉及六种类BES1/BZR1转录因子的磷酸化，并且有四种磷酸酶能够将其转化回未磷酸化的形式。这些蛋白质都是抑制剂的潜在目标。与突变体相比，抑制剂的一个显著优势在于其对于不同遗传背景和种类的直接适用性。此外，由于其功能冗余，单个突变体经常显示出没有表型或弱的表型。由于同源蛋白经常成为同一化合物的靶标，因此通过抑制剂研究可以克服功能冗余。

对于ASKs的人类同系物GSK-3α和GSK-3β，一些抑制剂是有效的。然而，将这些化合物用于植物类GSK-3/Shaggy激酶的尝试却不成功。在化学遗传学筛选中，4-[(5-溴-2-吡啶基)氨基]-4-氧代丁酸最近被认定为第一种特定干涉油菜素类固醇信号传导的物质。遗传和生化方法表明，4-[(5-溴-2-吡啶基)氨基]-4-氧代丁酸在油菜素类固醇信号传导中通过抑制ASKs发挥作用。类GSK3/Shaggy激酶是激素信号传导的关键调节剂并且调整应激耐受性，迫切需要更好理解4-[(5-溴-2-吡啶基)氨基]-4-氧代丁酸的作用。

为了解决该问题并识别出具有提高的效能的抑制剂，合成了一些具有和4-[(5-溴-2-吡啶基)氨基]-4-氧代丁酸相似结构的化合物，并研究了其在体内外对于类GSK-3/Shaggy激酶的抑制效能。此外，还研究了植物对这些化合物的表型反应。首先，分析了含有羧基基团的脂族侧链长度的影响。由于初步的结果表明氯代衍生物在一定程度上比溴代衍生物更具效能，因此使用2-氨基-5-氯吡啶来合成一系列区别仅在于脂族侧链长度的化合物。体外激酶测定表明，具有4个碳原子的侧链的这些化合物抑制效能最好。另外，空间构型非常重要。在由最佳数目4个碳原子组成的侧链中引入顺式双键，得到不具活性的化合物(6号)。顺式双键使脂族链产生了朝向另一羧基端基位的弯曲。具有不同侧链长度化合物产生的这种现象和结果表明，考虑到用于与ASKs相互作用的杂环，羧基必须具有精确的几何构型。

羧基端基重要性的证据最初来源于具有未被取代侧链的衍生物。然而，这并不排除仍可能参与氢相互作用的酯化羧基可能就已足够。因此，引入了化合物8、9和10，其分别是化合物2、3和15的甲基化变型。这三种物质在体内对于被检测的ASKs表现出微弱的活性或没有活性，表明脂族链中必须存在羧基端基。化合物9和10在体内具有活性是因为甲基基团被快速裂开，可能通过酯酶，并且羧基因此被重新构建。由于脂族链的羧基在细胞内pH下带电荷，其可能涉及到与ASKs的离子相互作用，例如，与赖氨酸或精氨酸残基。可选地，还可能涉及氢键。同样地，吡啶环的氮也可能涉及与蛋白质的氢键或离子相互作用。可以看出，用苯环取代吡啶环严重降低了抑制效能。为了更为详细研究杂环的重要性，合成了化合物11，其与高活性的化合物3的区别仅在于杂环氮的位置。体外测试表明11不具备活性，这说明杂环氮必须是紧靠酰氨基琥珀酰侧链，以得到有效的抑制剂。有趣的是，尽管初步的数据显示了相反的效果，但本发明的结果表明化合物的活性随着吡啶环位置5上卤素取代基的原子序数的增加而增加。碘代衍生物(15号)的活性最高而氟代衍生物(13号)的效能最低。由于其疏水性，抑制剂的这一结构部分可能涉及与激酶的范德华相互作用。对于范德华引力而言，相互作用的原子之间的距离至关重要。其随着距离的增大而急剧下降，并且只有当原子互相挨得非常近时才有效。在元素周期表的一个族中，描述最佳相互作用距离的范德华半径随着周期的增大而增大。例如，碘的范德华半径是0.22nm，而氟原子的是0.14nm。此外，吡啶环的碳和碘之间的共价键长度也比与其他卤素的长。因此碘代衍生物的结构可能具有与ASKs的疏水部位结合的理想特性。此外，如RP-HPLC(表1)中延长的保留时间所示，化合物的疏水性随着卤素取代基原子数的增加而增加，这可能进一步有助于疏水性相互作用。

组织渗透性测试表明，化合物的摄取、尤其是酯化化合物的摄取非常迅速。有趣的是，其原位浓度超过周边介质的好几倍。这可以由化合物的pK_a值来解释(表1)。例如，衍生物15的pK_a值为5.8，这意味着当介质中的pH是5.8时，50％的化合物是离解的并因此带负电荷，而剩下50％是未离解的。在pH为7.4的细胞内，低于3％的化合物是未离解的。由于只有未离解的、亲脂性的形式可以有效地穿过生物膜，化合物被捕获在细胞中，并累积至超过周边介质的浓度。这种依赖于pH的摄取与植物的激素生长素相类似，其中在pH驱动下的扩散有助于运送到细胞内。酯化化合物，例如10号，是依赖于pH、高度亲脂性的并且能够通过膜。在细胞内，它们被迅速水解成相应的酸，去质子化为亲水的阴离子。有意思的是，化合物10的摄取速率是化合物15的大概两倍，这与能够扩散通过膜的部分有关。化合物10的100％是亲脂性的，而化合物15只有50％是未离解的并因此是足够亲脂性的。这可能解释摄取速率的不同。总之，化合物15，也称为碘-4-[(5-溴-2-吡啶基)氨基]-4-氧代丁酸，是体外最具效能的化合物，并且在体内具有高抑制活性。其甲基化变型，甲基碘-4-[(5-溴-2-吡啶基)氨基]-4-氧代丁酸(化合物10)，摄取速度非常快，因此是体内研究选择的ASK抑制剂。已知几种类GSK3/Shaggy激酶响应于应激快速被激活。由于其极好的和快速的细胞渗透性，甲基碘-4-[(5-溴-2-吡啶基)氨基]-4-氧代丁酸和相关化合物对于研究这一激酶家族在早期应激信号传导中的作用将是有价值的。

参考文献：

Kim等人，Bioorg Med Chem6(1998)，1975-1982。

Min等人，Bioorg Med Chem Lett9(1999)，425-430。

Rozhon等人，Anal Bioanal Chem 382(2005)，1620-1627。

Sekimata等人，J Agric Food Chem50(2002)，3486-3490。

Sekimata等人，Planta 213(2001)，716-721。

Vert等人，Nature 441(2006)，96-100。