预防和治疗关节炎疾病的包含混合草药金银花和知母提取物的组合物

摘要

本发明涉及本发明的组合物，该组合物包含混合草药金银花和知母提取物，并显示有效的抗炎症活性，因此，可将其用作治疗和预防关节炎疾病的有效及安全的治疗制剂或健康食品。

说明书

技术领域

本发明涉及一种组合物，该组合物包含一种混合草药金银花(Lonicera japonica THUNB)和知母(Anemarrhena asphodeloides BUNGE)的提取物，用于预防和治疗关节炎疾病。

背景技术

关节炎是一种自身免疫性疾病，以它们的症状如关节中的疼痛、肿胀和僵直为特征。在哺乳动物中两种主要类型的关节炎是炎症性关节炎如类风湿性关节炎(RA)和骨关节炎(OA)，一种经常继发于机械应激、衰老、发育异常情况和/或破坏的软骨渐近的、退化的损失。关节炎的症状一般与脊柱关节有关，例如，趾僵化、关节化脓性银屑病或者风湿性关节炎。

骨关节炎表现出与类风湿性关节炎(RA)相似的症状。特别地，虽然骨关节炎以关节软骨的退化开始，但是类风湿性关节炎以滑膜中的炎症开始。在骨关节炎中，随着软骨恶化，后来经常发展为反应性的滑膜炎。相反地，随着类风湿性关节炎侵蚀软骨，继发的骨关节炎改变骨和软骨的发育。在骨关节炎和类风湿性关节炎的最后阶段，患有两种疾病的关节相互之间出现相同的现象。

骨关节炎通常表示伴随运动恶化的疼痛或简单X-射线辐射清晰地显示出减薄的软骨。一般受影响的关节是膝关节、髋关节、脊柱关节、指关节、拇指或大脚趾的底部等等。该疾病涉及到由MMPs(基质金属蛋白激酶)引起的关节软骨的破环，该酶主要使软骨缺失，其以关节软骨中的退化改变为特征和由炎症性细胞因子(例如，白介素-1(IL-1)，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等等)的过度产生导致，从而导致关节、肌腱、肌肉和韧带中极严重的疼痛(Fernandes J.C.，The role ofcytokines in osteoarthritis pathophysiology，39，pp237-246，2002)。类风湿性关节炎(RA)是一种常见的自身免疫性疾病，以关节的肿胀、变形和破坏为特征，达到极点时会造成严重的身体残疾。类风湿性疾病包括发生在肌肉、肌腱、关节、骨或窦处的疾病，其一般以炎症和/或退化为特征。患有类风湿性关节炎的患者表现出免疫系统中的失衡，其导致前炎症性细胞因子例如，TNF-α、IL-1等等的过度产生，和抗炎症性细胞因子的缺乏例如，IL-10、IL-1等等。类风湿性关节炎的特征是滑膜炎症，其可进展为软骨破坏，骨侵蚀和随后的关节变形。在炎症的过程期间，从关节中释放出多形核细胞，巨噬细胞和淋巴细胞。被激活的T-淋巴细胞产生细胞毒素和前炎症性细胞因子，而巨噬细胞则刺激前列腺素和细胞毒素的释放。在炎症的位点释放血管活性物质如组胺、激肽和前列腺素，它们在发炎的关节区域导致水肿、红斑和疼痛。

受影响的滑膜组织的主要病理是增生和T和B淋巴细胞的内膜下浸润。滑膜组织增生在血管翳组织中形成，其在不可逆地破坏受影响关节中的软骨和骨。类风湿性关节炎的进展是与巨噬细胞和树突状细胞产生的TNF-α和IL-1β的提高的水平、Th1/Th2的失衡和抗原特异性免疫球蛋白的过度产生相关的。尤其地，TNF-α和IL-1β直接诱导蛋白质水解酶如基质金属蛋白激酶(MMPs)的合成，该酶可以分解细胞外的基质大分子。在正常情况下，金属蛋白酶的组织抑制剂(TIMPs)以1∶1的比例与MMPs正常地结合。由于MMPs水平的上调而引起TIMPs与MMPs的失衡比例(其一般由MMPs的上调导致)导致类风湿性关节炎中持续的基质破坏。

用于治疗关节炎的急救药物包括用于减轻疼痛和炎症的药物，其被分类为非甾体类抗炎症性药(NSAIDs)，例如，阿司匹林、布洛芬、萘普生、甲氨蝶呤等等。次级急救药物包括皮质类固醇类，慢效抗风湿药物(SAARDs)或缓解疾病的药物(DMs)，例如，青霉胺、环磷酰胺、金盐、硫唑嘌啉、左旋咪唑等等。由FDA批准的第一组用于治疗类风湿性关节炎的生物反应调节剂(BRMs)是TNF-α拮抗剂，该拮抗剂通过与它的受体结合或直接与TNF-α蛋白结合而起作用。然而，各种弊端阻碍了对DMARDs的利用，例如，潜在的长期的副作用和毒性，成本高，对药物的超敏反应和由于TNF-α阻塞而引起的感染等等。

退行性关节炎，作为代表性骨关节疾病的一种，是一种慢性关节炎。临床中用常规有效的抗炎症性药物很难治疗这种疾病。而且，药物引起全身的不良反应如消化紊乱、胃肠道紊乱和肾脏功能紊乱，以及随着患者年龄的增长会更加频繁地发生药物的不良反应，其在老年人中进行长期全身治疗的情况下会导致很多问题。因此，与以前的全身治疗疗法相比，最近更迫切地需要开发出靶向抗炎症作用、对软骨具有保护和再生作用的新的药物。药物开发的最新理念已经聚焦到关节组织裂解酶抑制剂，自由基清除剂如SOD，通过对关节组织组分(如软骨素或氨基葡萄糖等等)的长期治疗而使用的保守治疗(Badger A.M.等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.，290，pp587-593，1999；Choi J.H.等人，Osteoarthritis Cartilage，10(6)，pp471-478，2002)。

在体内，各种生物化学机理，特别是，产生一氧化氮的一氧化氮合成酶(NOS)酶和其它涉及前列腺素(PGs)合成的酶在关节炎的病因中起了重要的作用。因此，从L-精氨酸中产生NO的NOS酶或涉及各种前列腺素合成的环氧合酶(COX)成为阻断关节炎炎症的主要靶点。

根据最新报道，人体内存在几种NOS酶例如存在于脑中的bNOS(脑NOS)、在神经系统中的nNOS(神经NOS)、在内皮系统中的eNOS(内皮NOS)等等，其在人体中以有规律的水平进行表达。因而所产生的少量NO在维持稳态如神经传输或诱导血管舒张等等中起着重要作用。然而，通过各种细胞因子或外界刺激物诱导的iNOS(诱导型NOS)使过量的NO突然发生会引起细胞毒性或炎症性反应。慢性炎症与增加的iNOS的活性相关(Chan P.S.等人，Osteoarthritis cartilage，13(5)，pp387-394，2005；Appleton I.等人，Adv.Pharmacol.，35，pp27-28，1996)。

一般来说，软骨恶化和通过软骨中蛋白聚糖或胶原的晚期产生速率引起的关节炎发生，其导致缓冲功能的丧失。关节软骨由对润滑和生长而言必需的水(70～80％)、胶原(10～15％)、蛋白聚糖(5～10％)和软骨细胞组成，其中蛋白聚糖具有附上数个粘多糖(GAG)的核心蛋白的特殊结构(Hardingham等人，J.Rheum(Suppl)，43(2)，pp86-90，1995)。

金银花(Lonicerae Japonicae)是金银花属(属于忍冬科)的花蕾部分。它们味甜并对解毒是有用的，其传统地用于痢疾、疼痛和肿胀。已知它们具有抗溃疡、抗细菌、抗病毒、抗痉挛、利尿、抗炎症和止痛的生物活性。主要成分是毛地黄黄酮、肌糖、皂甙、丹宁、异绿原酸、绿原酸等等(B.S.Chung等人HyangYakDaeSaJeon，Youngrimsa，pp939-940，1989)。

知母属于仙茅(Haemodoraceae)。它们味酸，其传统地用于发热、渴甚、咳嗽和糖尿病。已知它们具有降血糖、解热、抗血小板聚集、抑制应激性溃疡、镇静、抑制cAMP磷酸二酯酶和Na/K-ATPase、溶血、抗肿瘤的生物活性。主要成分是各种皂甙如知母皂甙A-I、知母皂甙A-II、知母皂甙A-III、知母皂甙A-IV、知母皂甙B-I和知母皂甙B-II、烟酸、芒果甙、异芒果甙等等(B.S.Chung等人HyangYakDaeSaJeon，Youngrimsa，pp203-204，1989)。

然而，在以上列举的文献中尚未报道或披露关于混合草药金银花和知母提取物对关节炎疾病的治疗作用，其中的公开通过引用并入本文。

因此，本发明者通过各种实验确认混合草药金银花和知母提取物具有有效的抗炎症作用，也就是，在软骨组织中对蛋白聚糖和II型胶原的分解的抑制作用；通过由于MMP-1、MMP-3和MMP-13活性的抑制而对软骨的保护作用；和对软骨组织的修复作用；在水肿动物模型中的抗炎症和消炎作用；通过对PEG₂活性、GAG降解的抑制实验和各种遗传毒性实验确认的抗炎症作用，因此，它可用作治疗和预防关节炎疾病的有效而安全的治疗法或健康食品。

发明内容

技术问题

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种用于预防和治疗关节炎疾病的包含混合草药金银花和知母提取物的组合物及其应用。

技术方案

因此，本发明的目的是提供一种包含混合草药金银花和知母提取物的药物组合物，作为治疗和预防关节炎疾病的活性成分，特别是通过刺激软骨组织的修复，由于刺激软骨组分和抑制软骨分解而保护软骨不受破坏，以及抑制炎症和疼痛。

本发明提供一种包含混合草药金银花和知母提取物的药物组合物，作为预防和治疗关节炎疾病的活性成分。

此处所述的术语“提取物”包括可溶于水、C₁至C₄的低级醇及其混合物的粗提取物；和通过使用丁醇溶液从粗提取物中分级分离获得的可溶于丁醇的提取物。

此处所述的术语“混合草药金银花和知母”包括的混合草药的混合比例按重量计算(w/w％)为0.5～3∶1，优选地，按重量计算(w/w％)为1～2∶1，最优选地，按重量计算(w/w％)为1.5～2∶1。

此处所述的术语“提取物”还包含金银花提取物中作为标准组分的绿原酸和知母提取物中作为标准组分的芒果甙，这二者作为标准组分在总提取物中所占的比例优选为0.5～6(w/w％)绿原酸和0.5～4(w/w％)芒果甙，更优选比例为1.5～5(w/w％)绿原酸和0.5～3.5(w/w％)芒果甙，最优选比例为3～4.5(w/w％)绿原酸和0.5～2.5(w/w％)芒果甙。

此处所述的术语“关节炎疾病”包括退行性关节炎、风湿性关节炎或者狼疮性关节炎，优选风湿性关节炎。

本发明还提供了一种应用混合草药金银花和知母提取物来制备用于治疗和预防哺乳动物或人类中关节炎疾病的治疗制剂。

本发明的目的是提供一种治疗或预防人类或哺乳动物中关节炎疾病的方法，所述的方法包含给予作为有效成分的混合草药金银花和知母提取物的治疗有效剂量及其药学上可接受的载体。

在下文中，本发明进行详细地说明。

本发明的发明提取物可以详细地通过下列方法进行制备。

例如，将金银花和知母干燥、切割、粉碎，混合在一起并加入到1至20倍，优选地，大约5至10倍体积的蒸馏水、C₁至C₄的低级醇或其混合物中，优选地水和醇的混合物以大约1∶0.1至1∶10，更优选地以1∶0.5至1∶5的混合比例(v/v)混合；将所述的溶液用10℃～100℃温度范围的热水处理，优选地，60℃～100℃的热水进行1至6个小时的时间范围的处理，优选地，为2至4个小时，其提取方法可以通过用热水、冷水、回流提取或超声波处理提取的提取，优选为用热水提取；通过过滤收集提取液，在减压情况下将其浓缩、干燥以获得本发明的发明粗提取物。

另外，将等量的丁醇可溶性溶液加入到上述的粗提取物中，然后将混悬液进行分级分离以获得本发明的发明纯提取物。

如前文所述提供一种制备本发明粗提取物和丁醇可溶性提取物的方法是本发明的另一目的。

按照以上所诉的方法制备的本发明粗提取物和纯提取物中包含金银花提取物中作为标准组分的绿原酸和知母提取物中作为标准组分的芒果甙，这二者在总提取物中作为标准组分所占的比例优选为0.5～6(w/w％)绿原酸和0.5～4(w/w％)芒果甙，更优选比例为1.5～5(w/w％)绿原酸和0.5～3.5(w/w％)芒果甙，最优选比例为3.0～4.5(w/w％)绿原酸和0.5～2.5(w/w％)芒果甙。

此外，对以上所描述的方法也可以进一步修饰或增加其步骤，通过本领域中已知的常规方法来分级分离或分离获得更多有效的馏分或化合物，比如可以利用文献中报道的方法(Harborne J.B.Phytochemical methods：A guide to modern techniques of plant analysis，3^rd Ed.pp6-7，1998)。

因此，本发明还提供了一种应用以上所述的制备方法制备的混合草药金银花和知母的提取物用于制备治疗和预防哺乳动物或人类中关节炎疾病的治疗制剂。

本发明还提供了一种用于预防和治疗关节炎疾病的包含通过以上所述的制备方法制备的混合草药金银花和知母的提取物作为活性成分的药物组合物及其药学上可接受的载体。

本发明的目的是提供一种治疗或预防人类或哺乳动物中关节炎疾病的方法，其中所述的方法包含给予通过以上所述方法制备的混合草药金银花和知母提取物的治疗有效剂量，其中所述的提取物是作为有效成分的及其药学上可接受的载体。

本发明的用于预防和治疗关节炎疾病的组合物可以包含基于组合物总重量的0.1～50％重量的上述提取物。

本发明的组合物还额外地包含本领域已知使用方法中的常规载体、佐剂或稀释剂。所述载体优选的根据它的用途和应用方法用作适当的物质，但不限于此。适当的稀释剂列在雷明思药学(Remington′s Pharmaceutical Science)的书面文本里(Mark Publishing co.，Easton PA)。

在下文中，下列制备方法和赋形剂仅仅是示例性的而绝不限制本发明。

根据本发明的组合物可以作为一种药学组合物来提供，所述的药物组合物包含药学上可接受的载体、佐剂或稀释剂的药物组合物，例如，乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤丁四醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯橡胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟甲基苯甲酸、羟丙基苯甲酸、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油。这些制剂另外可以包括填料、抗凝剂、润滑剂、湿润剂、调味剂、乳化剂、防腐剂等等。本发明的组合物可以通过利用本领域任何已知方法制成，以使病人用药后能提供快速、持久或缓慢释放的活性成分。

例如，本发明的组合物可以溶解在油、丙烯乙二醇或其它通常用于制备注射剂的溶剂中，适合的载体实例包括生理盐水、聚乙烯乙二醇、乙醇、植物油、异丙基十四酸酯等等，但不限于它们。作为表皮给药，本发明的提取物还可以被制成软膏和乳膏。

包含本发明组合物的药物制剂可以任何形式进行制备，如口服剂型(粉剂、片剂、胶囊、软胶囊、液体药物、糖浆、酏丸、散剂、囊剂、粒剂)，或表皮制剂(乳膏、软膏、洗剂、凝胶、香脂、膏药、糊剂、喷雾剂、气雾剂等等)，或注射制剂(溶液、悬浮剂、乳剂)。

本发明的组合物在药物剂型中可以采用其药学上可接受的盐的形式，也可以单独使用或适当的组合，也可以与其它药学上有活性的化合物联合使用。

本发明提取物或组合物的想要的剂量根据个体的情况和重量、病情的严重程度、药物形式、给药途径以及给药周期的不同而不同，其也可以由本领域技术人员进行选择。然而，为了获得想要的作用，对本发明的发明提取物，通常建议给药剂量范围按重量/天计算为0.1至1000毫克/千克，优选地，为1至100毫克/千克。剂量可以是每天单次给药或每天分多次给药。

本发明中的药物组合物通过各种途径给药至个体动物如哺乳动物(大鼠、小鼠、驯化动物或人类)，所有的给药方式均是预期的，例如，给药可以是口服、直肠给药或经静脉、肌肉内、皮下、皮内、鞘膜内、硬膜外或脑室内注射。

因此，本发明另一目的是提供一种包含混合草药金银花和知母提取物的功能性健康食品。

此处的术语“功能性健康食品”定义为“通过在常规食物中添加本发明的提取物，来增强功能如身体功能或生理功能的功能性食物，以预防或改善人类或哺乳动物中的目标疾病”。

本发明的另一目的是提供一种包含本发明提取物的保健食品，及营养学上可接受的添加剂，以预防和减轻目标疾病。

此处的术语“保健食品”定义为“包含本发明提取物的食品，所述的食品没有特异性的预期作用但有一般的预期作用，可以用其少量作为添加剂，或以全量作为胶囊、粒剂、片剂等等的形式”。

此处的术语“营养学上可接受的添加剂”定义为“任何具有预期用途的物质，所述物质将成为或合理地期望直接或间接地成为任何食物的组分或否则可以影响任何食物的特征”，例如，稠化剂、成熟剂、漂白剂、多价螯合剂、保湿剂、抗凝剂、澄清剂、食品加工剂、乳化剂、稳定剂、浓缩剂、碱和酸、发泡剂、营养素、着色剂、调味剂、甜味剂、防腐剂、抗氧剂等等，其在本领域中已知的物质。

如果一种物质出于特殊目的被添加到食品中，它可被称作为直接添加剂和间接食品添加剂，这些添加剂由于包装、储藏或其它处理而以微量用量成为食品的一部分。

上述健康食品可以包含于食物中、健康饮料中、膳食疗法中等等，并且可以使用其粉剂、粒剂、片剂、咀嚼片、胶囊、饮料等等形式用于预防或改善目标疾病。

本发明的提取物还可以被添加到食物或饮料中用于预防和改善目标疾病。作为功能性健康食品或保健食品，本发明提取物在食物或饮料中的数量一般为作为功能性健康食品组分的食物总重量的大约0.01至15w/w％的范围。特别的，尽管本发明的发明提取物在功能性健康食品、保健食品或特殊营养食品中优选用量根据每一个食品的预期目的不同而变化，一般来说本发明的发明提取物优选地使用作为添加剂的用量在食物(如面条等等)中是约0.01至5％的范围，在保健食品中以100％的食物组分的比率表示为40至100％的范围。

只要本发明中的健康饮料组合物在所示比率中包含作为基本成分的本发明提取物，那么对其它的液体组分则没有特别的限制，其中其它成分可以是各种除臭剂或天然碳酸等等，如常规的饮料。上述天然碳酸的例子为单糖如葡萄糖、果糖等等；双糖如麦芽糖、蔗糖等等；常规糖如糊精、环糊精；以及糖醇如木糖醇和赤丁四醇等等。除了上述提到的除臭剂以外的其它除臭剂，还有天然除臭剂如索吗甜、甜叶菊提取物如当归皂甙A、甘草酸等等，和合成除臭剂如糖精、阿斯巴甜等等，这些除臭剂也许是有利地使用的。上述天然碳酸的用量一般为100毫升的本发明饮料组合物的比例中约为1至20克，优选为5至12克的范围。

除了上文所述组合物以外的其它组分是各种营养素、维生素、矿物质或电解液、合成调味剂、着色剂和奶酪巧克力等中的改进剂，果胶酸及其盐，藻原酸及其盐，有机酸，保护性胶体粘着剂，pH调节剂，稳定剂，防腐剂，丙三醇，醇，碳酸饮料中的碳化剂等等。除了上文所述的组分以外的其它的组分还有用于制备天然果汁、果汁饮料和蔬菜饮料的水果汁，其中的组分可以单独或联合使用。所述组分的比例并不是如此重要，但一般每100w/w％本发明组合物中约0至20w/w％的范围。这里提到的包含上述提取物的可添加的食品的例子是各种食物、饮料、口香糖、维生素复合物、健康改善食物等等。

本领域技术人员会发现可以在不脱离本发明实质或范围的情况下对本发明的组合物、用法和制品可以进行各种修饰和改变。

本发明将通过以下的实施例更具体地进行说明，但是应该理解本发明在任何方法中并不限于这些实施例。

本领域技术人员会发现可以在不脱离本发明实质或范围的情况下对本发明的组合物、用法和制品可以进行各种修饰和改变。

有益效果

包含一种混合草药金银花和知母的提取物的本发明通过各种实验显示出有效的抗炎作用，例如，对软骨组织中蛋白多糖和II型胶原的分解的抑制作用；由于抑制MMP-1、MMP-3和MMP-13活性对软骨的保护作用；对软骨组织的恢复作用；在水肿动物模型中的抗炎和消炎的作用；通过对PEG₂活性和GAG的降解以及各种遗传毒性实验的抑制实验证明抗炎作用，因此，该提取物可以作为有效安全的治疗制剂或健康食品用于治疗和预防关节炎疾病。

本发明将通过以下的附图和实施例更具体地说明，但是，应该理解的是本发明并不限于这些实施例。

附图说明

从以下结合附图的具体实施方式中，将更清晰地理解前文提到的以及本发明其它的内容、特点和其它优点，其中：

图1显示绿原酸的色谱分析结果，绿原酸是包含在金银花提取物中的标准组分；

图2显示芒果甙的色谱分析结果，芒果甙是包含在知母提取物中的标准组分；

图3显示绿原酸的色谱分析结果，绿原酸为KM-3中的标准组分；

图4显示芒果甙的色谱分析结果，芒果甙为KM-3中的标准组分；

图5-A表示经KM-1处理后对NO生成的抑制作用；

图5-B表示经KM-3处理后对NO生成的抑制作用；

图6-A表示经KM-1处理后对PGE₂生成的抑制作用；

图6-B表示经KM-3处理后对PGE₂生成的抑制作用；

图7-A表示经KM-1处理后对IL-1β生成的抑制作用；

图7-B表示经KM-3处理后对IL-1β生成的抑制作用；

图7-C表示经KM-3处理后对IL-6生成的抑制作用；

图8表示KM-1和KM-3对胶原酶诱导的骨关节炎(CIA)动物模型肿胀的抑制作用；

图9表示KM-1和KM-3在胶原酶诱导的骨关节炎(CIA)动物模型中对增加的淋巴细胞数量的抑制作用；

图10表示KM-1和KM-3在胶原酶诱导的骨关节炎(CIA)动物模型中对软骨侵蚀的抑制作用；

图11表示KM-1和KM-3在胶原酶诱导的骨关节炎(CIA)动物模型实验中对胶原特异性IgG抗体生成的抑制作用；

图12-A描述KM-1对蛋白聚糖降解的抑制作用；

图12-B描述KM-3、芒果甙和绿原酸对蛋白聚糖降解的抑制作用；

图13-A描述应用KM-1处理后，通过RT-PCR方法检验出的，患有骨关节炎患者的软骨组织中蛋白聚糖和II型胶原的增加的mRNA基因表达；

图13-B描述应用KM-3处理后，通过RT-PCR方法检验出的，患有骨关节炎患者的软骨组织中蛋白聚糖和II型胶原的增加的mRNA基因表达；

图13-C描述应用芒果甙和绿原酸处理后，通过RT-PCR方法检验出的，患有骨关节炎患者的软骨组织中蛋白聚糖和II型胶原的增加的mRNA基因表达；

图14-A描述KM-1对患有骨关节炎患者的软骨组织中MMP-13活性水平的抑制作用；

图14-B描述KM-3对患有骨关节炎患者的软骨组织中MMP-13活性水平的抑制作用；

图15-A描述KM-1对患有骨关节炎患者的软骨组织中MMP-1活性水平的抑制作用；

图15-B描述KM-3、芒果甙和绿原酸对患有骨关节炎患者的软骨组织中MMP-1活性水平的抑制作用；

图16描述应用KM-1(A)和KM-3(B)处理后，对骨关节炎患者软骨组织的MMP-1、MMP-3和MMP-13的mRNA基因表达水平的抑制作用；

图17描述应用KM-1(A)和KM-3(B)处理后，患有骨关节炎患者软骨组织的细胞毒性的测定；

图18-A描述在骨关节炎软骨的软骨保护中所涉及的KM-3对一些丝裂原活化的蛋白激酶(MAPK)磷酸化的抑制作用；

图18-B描述在骨关节炎软骨的软骨保护中所涉及的芒果甙对一些丝裂原活化的蛋白激酶(MAPK)磷酸化的抑制作用；

图18-C描述在骨关节炎软骨的软骨保护中绿原酸对一些丝裂原活化的蛋白激酶(MAPK)磷酸化的抑制作用；

图19表示对胶原酶诱导的骨关节炎(CIA)动物模型中的关节的KM-1(A)和KM-3(B)的肿胀和活动性恢复作用；

图20-A表示通过对胶原酶诱导的骨关节炎(CIA)动物模型关节中通过形态学分析获得的KM-1的软骨保护作用；

图20-B表示通过对胶原酶诱导的骨关节炎(CIA)动物模型关节中通过形态学分析获得的KM-3的软骨保护作用；

图21-A描述通过对胶原酶诱导的骨关节炎(CIA)动物模型关节中通过番红精氧染色分析获得的KM-1对蛋白聚糖表达的恢复作用；

图21-B描述通过对胶原酶诱导的骨关节炎(CIA)动物模型关节中通过番红精氧染色分析获得的KM-3对蛋白聚糖表达的恢复作用；

图22-A描述通过对胶原酶诱导的骨关节炎(CIA)动物模型关节中通过马森三色染剂分析获得的KM-1对胶原表达的恢复作用；

图22-B描述通过对胶原酶诱导的骨关节炎(CIA)动物模型关节中通过马森三色染色分析获得的KM-3对胶原表达的恢复作用；

图23描述KM-3对胶原酶诱导的骨关节炎(CIA)动物模型关节中来自软骨下骨和聚集蛋白聚糖的组织的分化间充质干细胞(CD105，CD73)表达的软骨再生作用；

图24-A表示KM-3对GAG降解实验的抑制作用，该实验是通过从骨关节炎患者的软骨组织和软骨下骨组织中分离获得的正常区(NSC)中共同培养软骨细胞和软骨下骨组织进行的；

图24-B表示KM-3对GAG降解实验的抑制作用，该实验是通过从骨关节炎患者的软骨组织和软骨下骨组织中分离获得的异常区(SC)中共同培养软骨细胞和软骨下骨组织进行的；

具体实施方式

实施本发明的最好模式

本领域技术人员会发现可以在不脱离本发明实质或范围的情况下对本发明的组合物、用法和制品进行各种修饰和改造，

本发明将通过以下的实施例特别说明，但是应该理解的是本发明并不限于这些实施例。

发明模式

以下的比较实施例、参考实施例、实施例和实验实施例是为了进一步证明本发明，但并不限于它的范围。

比较实施例1：金银花花苞提取物的制备

将从韩国庆熙医学中心(Kyunghee Medical Center in Korea)购买的金银花花苞100克干燥，切割成小块，并加入到0.7升的50％的乙醇中。将所述的溶液在85℃下搅拌回流4小时并将残余物过滤。将所述的滤液浓缩并干燥获得35克金银花花苞提取物，该提取物被用作对照实验的样品(如下文所指定的“LJ提取物”)。

如图1所示，已经通过色谱分析证明LJ提取物包含2.2％的绿原酸(w/w％)(见图1)。

比较实施例2：知母提取物的制备

将从韩国庆熙医学中心(Kyunghee Medical Center in Korea)购买的知母100克气干，切割成小块，并加入到0.7升的50％的乙醇中。将所述的溶液在85℃下搅拌回流4小时并将残余物过滤。将所述的滤液浓缩、干燥获得50克知母提取物，该提取物被用作对照实验的样品(如下文指定的“AA提取物”)。

如图2所示，已经通过色谱分析证明AA提取物中包含2.3％的芒果甙(w/w％)(见图1)。

实施例1：混合草药(KM-1)提取物的制备

将从韩国庆熙医学中心(Kyunghee Medical Center in Korea)购买的50克金银花花苞和50克知母干燥、混合在一起、切割成小块，并加入到0.7升的50％的乙醇中。将所述的溶液在85℃下搅拌回流4小时并将残余物过滤。将所述的滤液浓缩至溶液体积达到0.1升的程度，然后将等体积的正丁醇加入其中以进行分级分离。经过反复分级分离，收集正丁醇可溶性馏分，将其浓缩并干燥获得9克混合草药提取物，该提取物用作实验样品(如下文指定的“KM-1”)。

如在色谱分析中所示，已经通过色谱分析证明KM-1提取物包含3％的绿原酸(w/w％)和3.5％的芒果甙(w/w％)。

实施例2：混合草药(KM-2)提取物的制备

将从韩国庆熙医学中心(Kyunghee Medical Center in Korea)购买的50克金银花花苞和50克知母干燥、混合在一起、切割成小块，并加入到0.7升的50％的乙醇中。将所述的溶液在85℃下搅拌回流4小时并将残余物过滤。将所述的滤液浓缩并干燥获得40克混合草药提取物，该提取物用作实验样品(如下文指定的“KM-2”)。

如在色谱分析中所示，已经通过色谱分析证明KM-2提取物包含1.5％的绿原酸(w/w％)和1.8％的芒果甙(w/w％)。

实施例3：混合草药(KM-3)提取物的制备

将从韩国庆熙医学中心(Kyunghee Medical Center in Korea)购买的100克金银花花苞和50克知母干燥、混合在一起、切割成小块，并加入到0.7升的50％的乙醇中。将所述的溶液在85℃下搅拌回流4小时并将残余物过滤。将所述的滤液浓缩至溶液体积达到0.1升的程度，然后将等体积的正丁醇加入其中以进行分级分离。经过反复分级分离，收集正丁醇可溶性馏分，将其浓缩并干燥获得11克混合草药提取物，该提取物用作实验样品(如下文指定的“KM-3”)。

如图3和图4中所示，已经通过色谱分析证明KM-3提取物包含4.5％的绿原酸(w/w％)和2.1％的芒果甙(w/w％)(见图3和4)。

实施例4：混合草药(KM-4)提取物的制备

将从韩国庆熙医学中心(Kyunghee Medical Center in Korea)购买的100克金银花花苞和50克知母干燥、混合在一起、切割成小块，并加入到0.7升的50％的乙醇中。将所述的溶液在85℃下搅拌回流4小时并将残余物过滤。将所述的滤液浓缩并干燥获得56克混合草药提取物，该提取物用作实验样品(如下文指定的“KM-4”)。

如色谱分析中所示，已经通过色谱分析证明KM-4提取物包含2.2％的绿原酸(w/w％)和1.4％的芒果甙(w/w％)。

参考实施例1：巨噬细胞的培养

在RPMI-1640培养基(10％FBS，2mM 1-谷氨酰胺，100单位/毫升青霉素钠，100单位/毫升硫酸链霉素和250纳克/毫升两性霉素B)中培养小鼠巨噬细胞株(Raw264.7，从ATCC购买)。将培养细胞接种在24孔板上(10⁶细胞/孔)，并用KM-1(10，50，100，200微克/毫升)，KM-3(10，20，40微克/毫升)，阳性对照组，即，塞来考昔(CEL，100微克/毫升)和ETCP(SK化学)(100，200，400微克/毫升)处理30分钟。向其中加入1微克/毫升的LPS和1纳克/毫升的IFN-，在二氧化碳培养箱中培养24小时，并在2000rpm下离心5分钟，收集上清，所述的上清用作以下实验的样品。

参考实施例2：胶原诱导的风湿性关节炎(CIA)模型

从中央实验动物(Chungang Experiment Animals)(www.labanimals.co.kr.韩国)购买DBA/1J小鼠。将等体积的CFA(弗氏佐剂)滴入到2毫升胶原溶液(2毫克/毫升)中并混合均匀。取100微升混合液皮下注射到小鼠尾根上方2.5厘米部位。注射后3周，将2毫升胶原溶液和等体积IFA(不完全弗氏佐剂)的混合液以100微升剂量注射在小鼠尾根部上方1厘米部位。再经过3周，小鼠经口服给予溶解于CMC溶液中的KM-1(200毫克/千克)、KM-3(200毫克/千克)和塞来考昔(100毫克/千克)。给予CMC(羧甲基纤维素，Sigma)溶液作为阴性对照组。

参考实施例3：软骨组织的制备

人类关节软骨由已经做了人造关节手术(庆熙医学中心整形外科Orthopedics Surgery Dep.of Kyunghee Medical Center)的患者提供。在无菌条件下通过外科手术取得关节表面后，将约200-220毫克从人类和兔关节软骨制备的关节表面组织浸泡在DMEM培养基中(FBS，GIBCO BRL，USA)，向其中补加5％的胎牛血清和100单位/毫升的青霉素-链霉素。将组织用该培养基清洗数次，然后在37℃增湿95％的二氧化碳培养箱中培养所述的关节组织。培养1或2天后，将培养基用新的碱性培养基替换，然后将30毫克的软骨细胞转移至48孔板，该新碱性培养基包含经加热处理失活的5％胎牛血清，10mM HEPES和100单位/毫升的青霉素-链霉素。

经1小时培养后，将5纳克/微升的白介素-1α(IL-1α，R&D System，USA)加入到培养基中诱导炎症，将各种浓度的实验样品KM-1，ETCP(SK化学)，塞来考昔(CEL，Pfizer Co.，USA)和氨基葡萄糖(GLUCO，Sigma Co.，USA)，即，0.1、0.2和0.4毫克/毫升分别加入此培养基中。所述培养基在37℃下再经过7天的培养，收集上清，将其储存在-20℃以用作对照性实验和实验的样品。

参考实施例4：逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)

将根据参考实施例1中公开的方法培养的软骨细胞用TRIzol试剂(Invitrogen Corporation，CA，USA)处理来分离RNA，通过向培养基中加入包含寡(dT)₁₂引物、三磷酸碱基脱氧核苷酸(Dntp)(10mM)、0.1M二硫苏糖醇(DDT)的缓冲液，逆转录酶和RNA酶抑制剂来进行对1微克总RNA的逆转录。将所述的培养基在42℃培养60分钟。通过使用表1和序列(SEQ)I.D.1至16中公开的引物进行PCR(聚合酶链式反应)，该PCR应用1微克的每一个由上述方法制备的cDNA，2.5单位的嗜热水生菌(Taq)聚合酶(TaKaRa Taq^TM，Takara，Japan)，1.5mM dNTP，1×的缓冲液(10mM Tris-HCl pH 8.3，50mM KCl，TritonX-100)和20pM的表1和序列I.D.1至16中每一配对引物来进行。将所述溶液用蒸馏水调节至10微升的总体积，然后通过使用热循环装置(Bio-Rad，USA)按照如下的方法进行聚合酶链式反应(PCR)：经过94℃5分钟的变性后，PCR按照94℃反应60秒，55℃反应60秒和72℃反应90秒的顺序进行。该循环重复30次，最后的延伸是在72℃进行5分钟。通过PCR获得的产物在1.8％琼脂糖凝胶上进行电泳(5V/厘米)，并用2微克/毫升的溴化乙锭(EtBr)染色5分钟。染色产物用蒸馏水洗10分钟，其结果在紫外波长(260nm)处进行检测。

表1

参考实施例5：胶原酶诱导的骨关节炎模型

将兔子(Newzealand White Rabbit，Samtako，Korea)驯化一周，并向兔子的右膝的滑液腔中注射1.25毫升胶原酶(4毫克/毫升，Sigma Co.USA)。在样品处理前称量兔子的体重，并每周的间隔称量一次体重。在实验期间观察临床症状，如行走行为、活动范围、肿胀等等。每组(n＝8)用样品处理4周，并采集血样。将右膝切下并用10％福尔马林溶液固定。

参考实施例6：共同培养软骨细胞和软骨下骨组织细胞模型

人类软骨下骨组织和关节软骨样本由已经做了人造关节手术(Orthopedics Surgery Dep.Of Kyunghee Medical Center)的患者提供。将软骨下骨粉碎成片，然后用II型胶原酶处理30分钟。将碎片进行移植培养并传代培养两次后使用。用II型胶原酶分离出软骨细胞后在培养基条件下传代培养两次使用。将软骨细胞用藻原酸制成小球并种植在上闸室中，而将软骨下骨组织细胞种植在下闸室中，然后培养24小时。随后用50微克/毫升的KM-3处理14天，且每七天收集一次培养基。

实验实施例1：福尔马林痛觉缺失实验

为了测定用实施例方法制备的本发明提取物的止痛活性，按照下列文献中公开的方法(Frazli-Tabaei S等人，Behav.Pharmacol.，16，pp613-619，2005)进行了福尔马林诱导痛觉缺失实验。

体重在20至25克的雄性ICR小鼠(Orient Bio，Japan)驯化数日，按每组8只小鼠分组。实验样品经口服给予小鼠，给药后1小时将10％的福尔马林溶液(v/v，Sigma Co.USA)经皮下给药至小鼠的左后肢。在第一期(从给药后开始至5分钟)和第二期(从给药后15分钟至20分钟)观察和记录小鼠舔舐足底的频率。通过设定经常规使用的非甾体类抗炎药塞来考昔处理的阳性对照组中的抑制率为100来计算抑制率(％)。

表2

如表2所示，实验证明经KM-1、KM-2、KM-3和KM-4处理的小组与那些分别经包含单独的草药的LJ和AA处理的小组以及用塞来考昔处理的阳性对照组相比具有更有效的镇痛作用。特别地，KM-3的镇痛作用在它们之中显示了最有效的镇痛作用。

实验实施例2：MIA(碘醋酸单钠盐)模型

为了确认用实施例方法制备的本发明提取物的止痛活性，按照文献中描述的方法(James D.Pomonis等人，Pain，114，pp339-346，2005)进行了MIA(碘醋酸单钠盐)诱导的关节炎动物模型实验。

体重在200至220克的雄性SD大鼠(Orientbio.Japan)驯化数日，将溶解在PBS中的MIA(Sigma，cat#I2512，USA)注射入大鼠左后膝的关节盂中诱发关节炎。一周恢复后，通过使用incapacitance测试仪(Linton，Stoelting Co.，Wood Dale，IL)选出诱导关节炎成功的个体，并且所述的个体按照每组8只动物分组。诱导后的第八天开始，每天定时经口服给予实验样品，结果数据的测定开始于经三周给药后的第一周，每周一次。数据通过使用incapacitance测试仪(Linton，Stoelting Co.，Wood Dale，IL)进行测定，并根据下面的麦氏方程1进行计算。通过设定经常规使用的非甾体类抗炎药塞来考昔处理的阳性对照组中的抑制率为100来计算抑制率(％)。

麦氏图1

麦氏方程1

左后重量％＝{左后重量/(左后重量+右后重量)}×100

表3

如表3所示，实验证明KM-1、KM-2、KM-3和KM-4比分别用单独的草药处理的LJ和AA具有更有效的镇痛作用。特别地，KM-3和KM-4的疼痛抑制作用分别优于KM-1和KM-2的疼痛抑制作用，也优于阳性对照塞来考昔的疼痛抑制作用。特别地，KM-3的镇痛作用最能显著的抑制疼痛。

实验实施例3：放射线诱导的尾部轻弹痛觉缺失实验

为了确认用实施例方法制备的本发明提取物的镇痛作用，按照文献中描述的方法(Shaw FZ等人，Brain Res.，911(2)，pp105-115，2001)进行了放射线诱导的尾部轻弹痛觉缺失实验。

体重在20至25克的雄性ICR小鼠(Orientbio.Japan)驯化数日，并按照每组8只动物进行分组。实验样品经口服向其中给药，处理后1小时用红外线照射其尾中部来测定直到出现回避反应的时间。通过设定经常规使用的非甾体类抗炎药塞来考昔处理的阳性对照组中的抑制率为100来计算提取物的抑制率(％)。

表4

如表4所示，实验证明KM-1、KM-2、KM-3和KM-4比分别用单独的草药处理的LJ和AA具有更有效的镇痛作用。特别地，KM-3和KM-4的疼痛抑制作用优于KM-1和KM-2的疼痛抑制作用，也优于阳性对照塞来考昔的疼痛抑制作用。特别地，KM-3处理的组在它们之中显示出最有效的抑制作用。

实验实施例4：爪压力痛觉缺失实验

为了确认用实施例方法制备的本发明提取物的镇痛作用，按照文献中描述的方法(Randall LO and Selitto JJ，Arch Int.Pharmacodyn.，111，pp409-419，1957)进行大鼠爪压力痛觉缺失实验。

体重在180至200克的雄性SD大鼠(Orientbio.Japan)驯化数日，并按照每组8只动物进行分组。实验样品经口服向其中给药。处理后一小时，将2％角叉胶(Sigma Co.，USA)经皮下注射入大鼠左后肢。注射后3小时，用止痛测量仪(analgesic meter)(Ugobasile，Italy)测量在出现回避反应时的重量。通过设定经常规使用的非甾体类抗炎药塞来考昔处理的阳性对照组中的抑制率为100来计算抑制率(％)。

表5

如表5所示，实验证明KM-1、KM-2、KM-3和KM-4比分别用单独的草药处理的小组具有更好的有效镇痛作用。特别地，KM-3和KM-4的疼痛抑制作用分别优于KM-1和KM-2的疼痛抑制作用，也优于阳性对照塞来考昔的疼痛抑制作用。特别地，KM-3处理的组在它们之中显示出最有效的抑制作用。

实验实施例5：热板疼痛实验

热板疼痛实验按照文献中描述的方法(Pharmacological report，60(2008)pp409-414)进行。

体重在15至20克的雄性ICR小鼠(Orientbio.Japan)驯化数日，并按照每组8-9只动物进行分组。实验样品经口服向其中给药。处理后1至2小时，将小鼠置于塑料气缸中，并将气缸的温度维持在55±1℃以测定当小鼠舔脚掌或跳起时的时间。截止时间设定为15秒，并且通过设定经常规使用的非甾体类抗炎药塞来考昔处理的阳性对照的抑制率为100来计算抑制率(％)。

表6

如表6所示，实验证明KM-3比分别用单独的草药处理的LJ和AA具有更有效的镇痛作用。特别地，KM-3的疼痛抑制作用优于阳性对照塞来考昔的疼痛抑制作用。

实验实施例7：醋酸诱导的扭体实验

为测定抗炎作用按照文献(H.O.J collier等人，Br.J.Pharmac.Chemother.，32，pp295-310，1968)中描述的方法进行醋酸诱导的扭体实验。

体重在20至23克的雄性ICR小鼠(Orientbio.Japan)驯化数日，并按照每组5-8只动物进行分组。实验样品经口服向其中给药，处理后1小时，将1％醋酸(Sigma，USA)溶液经腹膜内注射向其中给药。注射后记录下从5至20分钟测定的扭体次数。通过设定经常规使用的非甾体类抗炎药塞来考昔处理的阳性对照组中的抑制率为100来计算抑制率(％)。

表7

如表7所示，实验证明KM-3比分别用单独的草药处理的LJ和AA具有更有效的镇痛作用。特别地，KM-3的疼痛抑制作用优于阳性对照塞来考昔的疼痛抑制作用。

实验实施例8：巴豆油诱导的耳水肿实验

巴豆油可以诱导各种皮肤炎症如皮疹、肿胀、水疱等等。为了测定本发明提取物的抗炎症活性，按照文献中公开的方法(Gabor M，Mouse ear inflammation models and their pharmacological applications，Published by Akademiai Kiado，Budapest，pp24-28，2000)进行下列使用巴豆油诱导的耳水肿实验。

采用体重在20至25克的雄性ICR小鼠(Orientbio.Japan)作为实验动物，并且每组包括6只小鼠。实验样品经口服给药，给药1小时后，将2.5％溶于丙酮中的巴豆油涂抹在小鼠右耳的内侧和外侧表面以诱发耳水肿。4小时后，通过使用根据速度传感技术的厚度仪来测定死亡小鼠左耳与右耳的厚度，并比较其厚度来计算增厚率(Patrick等人，Toxicol.Appl.Pharmacol.，81，pp476-490，1985)。

通过设定经常规使用的非甾体类抗炎药塞来考昔处理的阳性对照组中的抑制率为100来计算抑制率(％)。

表8

如表8所示，实验证明KM-1、KM-2、KM-3和KM-4比分别用单独的草药处理的LJ和AA具有更有效的镇痛作用。特别地，KM-3和KM-4的疼痛抑制作用优于KM-1和KM-2的疼痛抑制作用，也优于阳性对照塞来考昔的疼痛抑制作用。特别地，KM-3处理的组在它们之中显示出最好的有效抗炎症作用。

实验实施例9：角叉胶诱导的大鼠爪水肿实验

为了测定本发明的发明提取物的镇痛活性，按照如下方法进行了角叉胶诱导的大鼠爪水肿实验。

体重在20至25克的雄性Wister小鼠(Orient Bio，Japan)驯化数日，并且每组包括8只小鼠。将实验样品以100-400毫克/千克的剂量经口服给予小鼠，并将溶解在生理盐水中的角叉胶，经皮下注射入小鼠的左后肢以诱发炎症。在避免感染的条件下利用器官充盈度测量仪在规律的时间间隔测量一下左脚掌中心处的水肿程度并与右脚掌中心处作比较。塞来考昔以100毫克/千克(体重)的剂量经口服给药作为阳性对照组。通过设定经常规使用的非甾体类抗炎药塞来考昔处理的阳性对照组中的抑制率为100来计算抑制率(％)。

表9

如表9所示，经KM-3口服给药的实验组在400毫克/千克的剂量下具有有效的抑制水肿的作用，并且比用塞来考昔处理的阳性对照组更有效。

实验实施例10：抑制NO(一氧化氮)的生成

为了确认本发明提取物对NO活性的抑制作用，按照文献中公开的方法(International Immunopharmacology，7(6)，pp871-8，2007(June))进行了下列的实验。

亚硝酸盐的蓄积，即NO合成的指示，是通过应用格里斯(Griess)反应来进行测量的。腹膜巨噬细胞用RPMI(GIBCO BRL，USA)培养基在5％二氧化碳培养箱中37℃进行培养，该RPMI培养基中包含加热失活的胎牛血清(FBS，GIBCO BRL，USA)，100单位/毫升的青霉素和100单位/毫升的硫酸链霉素。将100微克/毫升的KM-1和50毫克/毫升的塞来考昔(Pfizer Ltd.，USA)加入到96孔板中经30分钟处理后，1微克/毫升的LPS和1纳克/毫升的IFN-γ加入其中进行处理，然后在5％二氧化碳培养箱中培养。培养96小时后，将100微升的收集的细胞培养基与包含1％(w/v)磺胺，0.2％N-萘基乙二胺二盐酸盐和2.5％磷酸的100微升5％(v/v)格里斯试剂混合，并将孔板用新的96孔板进行替代。通过使用微孔板计读器(Power Wave 340，Bio-Tek，USA)在10分钟内测量550纳米处的吸光度。在所有实验中新鲜的培养基被用作非处理组。培养基中NO的量基于生成的硝酸钠(NaNO₂)的标准曲线来计算，其结果如图5所示。

如图5所示，NO可刺激炎症性细胞因子的释放从而导致炎症的诱导，通过比较实验组与阳性对照组中NO的生成量可以确认KM-1和KM-3比阳性对照组具有更有效的抑制作用。

实验实施例11：测定炎性介质(PGE₂)

为了测定实验样品对参考实施例1的上清液中PGE₂(#SKGE004，R&D systems，USA)的释放的抑制作用，按照文献(Dovedi SJ等人，J.Urol.，174(1)，pp332-337，2005)中公开的ELISA方法进行了实验。

将血清用磷酸缓冲液稀释至1∶500，然后将50微升的稀释液加入到上清液中。将用山羊抗小鼠前列腺素E₂单克隆IgG预包被的板子用各种浓度的KM-1(10，50，100，200微克/毫升)，KM-3(10，20，40，80微克/毫升)，塞来考昔(CEL，80微克/毫升)和ETCP(80微克/毫升)处理，使其反应，并依照标准PGE₂的连续稀释来定量测定合成的PGE₂的量。

其结果是，用KM-1和KM-3处理的小组与塞来考昔处理的小组相比对PGE₂的释放显示出了有效的抑制作用(见图6)。

实验实施例12：测定炎症性细胞因子(IL-1β，IL-6)

为了测定实验样品对参考实施例1的上清液中IL-1β，IL-6(#200-LA，R&D systems，USA)的释放量的抑制作用，如下进行了ELISA方法实验。

为了测定用各种浓度的每个KM-1(10，50，100，200微克/毫升)，KM-3(10，20，40，80微克/毫升)，塞来考昔(CEL，100微克/毫升)，ETCP(100，200，400微克/毫升)和消炎痛(30微克/毫升，吲哚美辛)处理的小组的抗炎症活性，每组的100微升的上清液加入到用各个抗体共同进行预包被的板子上，反应1小时显影。所述反应溶液的光学密度在540纳米处进行测定。

如图7-A所示，用KM-1处理的小组以剂量依赖方式对细胞因子IL-1β的释放显示出重要的抑制作用。并且，如图7-B和7-C所示，用KM-3处理的小组与用塞来考昔和ETCP处理的小组相比显示出对IL-1β和IL-6表达的释放的抑制作用。

实验实施例13：胶原诱导的关节炎

抗炎和免疫抑制作用是使用参考实施例2的动物模型来进行测定的。

将2毫升的胶原溶液(2毫克/毫升)以滴的方式与等体积的CFA(完全弗氏佐剂)混合。将100微升的混合溶液经皮下注射入DBA/1J小鼠(Chungang Experiment animal，Korea)的尾根部以上2.5厘米的部位区域。注射后3周，将2毫升的胶原溶液与等体积的IFA(不完全弗氏佐剂)混合，并将100微升的溶液经皮下再次注射至尾根部以上1厘米的部位区域。实验样品经口服向其中给药3周。给药后3周，测定水肿的程度，COMP(软骨低聚物基质蛋白，Animal COMP ELISA，AnaMar Medical Co.，Sweden)的浓度，脾中总的淋巴细胞的数量和胶原特异性抗体(抗胶原抗体测定试剂盒，Chondrex Co.，USA)的数量，其中COMP是用于测定软骨破坏程度的代表性指示物，既然通过胶原注射的凹痕再生的抗体会攻击软骨部位，那么胶原特异性抗体已知是抗炎症性效应子中主要的指示物。如图8至11所示，用KM-1和KM-3处理的实验组与用塞来考昔处理的阳性对照组相比具有有效的抗炎症活性。特别地，KM-3的抗炎作用优于KM-1的抗炎作用。

实验实施例14：对软骨作用于粘多糖分解的保护作用

为了测定对人类关节软骨组织的保护作用，按照文献(French MM等人，Ann.Biomed.，Eng.，32(1)，pp50-56，2004)中公开的方法进行1，9-二甲基亚甲基蓝(DMB)测定方法来证明对由蛋白聚糖组成的GAG(粘多糖)降解的抑制作用。

作为标准使用的是，通过测定与blyscan染料溶液和软骨素的硫酸盐反应后产生的多阴离子性物质的量来测定按照参考实施例3中公开所示的方法培养的软骨组织的培养基中的GAG的浓度。50微升的培养基用KM-1提取物(0.1，0.2和0.4毫克/毫升)，KM-3提取物(0.1，0.2，0.4毫克/毫升)来处理，并用塞来考昔(CEL，Pfizer，USA)(20，100微克/毫升)，氨基葡萄糖(GLUCO，Sigma，USA)(100，200，400微克/毫升)，芒果甙(100，200，400微克/毫升)和绿原酸(100，200，400微克/毫升)作为阳性对照，将它们分别与500微升的blyscan染料溶液混合并在室温反应30分钟。将反应物在12,000rpm离心10分钟，将沉淀物溶解在blyscan染料分解溶液中。分光镜的GAG量在540纳米进行测定，抑制率的表示基于由白介素-1α(IL-1α)诱导的GAG降解的量。

如图12所示，经KM-1，KM-3和标准组分即芒果甙和绿原酸处理的小组有效的抑制GAG降解到介质中，这证明本发明的提取物以剂量依赖方式抑制由IL-1α诱导的软骨中蛋白聚糖的降解，并且，与用作对照的塞来考昔和氨基葡萄糖相比它还可抑制人类软骨组织中GAG的降解。

实验实施例15：蛋白聚糖基因的基因表达

测定了在以上的参考实施例3中从兔子的软骨组织和软骨细胞中收集的蛋白聚糖和Col II基因的表达，通过使用参考实施例4中公开的方法逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)来进行所述的实验。

在实验中应用了KM-1(10，100和200微克/毫升)，KM-3(5，10，20微克/毫升)，芒果甙(0.01，0.1，1微克/毫升)和绿原酸(0.01，0.1，1微克/毫升)

如图13所示，本发明的发明提取物以剂量依赖方式有效地增加蛋白聚糖和Col II基因的基因表达，所述的表达在软骨组织中通过IL-1α的处理而被抑制。

实验实施例16：MMP-1和MMP-13浓度的测定

基质金属蛋白激酶(MMP)是一种裂解软骨组织中的蛋白的蛋白酶，其可以破坏风湿性关节炎和骨关节炎中的软骨组织导致加重的关节炎。因此，抑制所述的酶的再生是保护关节软骨的主要靶点(Nagase H and Woessner JF Jr.，J.Biol.Chem.，274(31)，pp21491-21494，1999)。

应用参考实施例3中制备的人类软骨组织培养基测定对MMP再生的抑制作用，根据生产商手册使用ELISA试剂盒(MMP-1试剂盒，MMP-13试剂盒，Biomol Research Lab.，Inc.，PA，USA)来进行测定，thiopeptolide(Ac-Prop Leu-Gly-[2-mercapto-4-methyl-pentanoyl]-Leu-Gly-OC₂H₅)被用作比色分析法的底物被MMP-1(胶原酶-1)和MMP-13(胶原酶-13)所切除。为了测定蛋白水解的活性，将每25微升培养基和50微升底物加入到96孔板中，在37℃培养1小时，用ELISA计读器(Molecular devices，USA)在450纳米处测定光学密度。每一个样品对MMP-1和MMP-13的活性通过计算每一孔中培养基的MMP(％)来确定。

如图14和15所示，用KM-1、KM-3和标准组分即芒果甙和绿原酸处理的小组以剂量依赖方式显著地抑制胶原酶MMP-1和MMP-13活性。用KM-1与KM-3处理的小组与用作阳性对照的ETCP具有等效的抑制作用，而比塞来考昔和氨基葡萄糖处理的组相比具有更有效的抑制作用。

实验实施例17：MMP-1、MMP-3和MMP-13的基因表达的抑制

应用参考实施例3中制备的兔软骨组织和软骨细胞以测定本发明提取物对MMPs(基质金属蛋白激酶)再生的抑制作用，根据参考实施例4中公开的方法进行RT-PCR。

如图16所示，本发明的发明提取物以剂量依赖方式显著地抑制软骨细胞中MMP-1、MMP-3和MMP-13的基因表达。

实验实施例18：细胞毒实验

为了检验本发明提取物对软骨细胞活力的影响，应用参考实施例3中制备的兔软骨组织和软骨细胞进行细胞毒实验，其按照文献(Carmak O等人，ArchFacialPlast.Surg.，7(6)，pp406-409，2005)中公开的方法进行的。

作为软骨细胞活力的指标，细胞质酶乳酸脱氢酶(LDH)的活性通过常规可获得的试剂盒(LDH试剂盒，Promega Corp.，Madison，WI，USA)进行测定，其按照文献(Hussian SM等人，Toxicol.In Vitro，19(7)，pp975-983，2005)中公开的方法进行。

为了测定LDH的活性，阴性对照组、用KM-1(0.1，0.2和0.4毫克/毫升)，KM-3(0.1，0.2和0.4毫克/毫升)处理的实验组以及阳性对照组(ETCP，CEL，GLUCO)经培养后收集培养基。将底物混合粉末(心肌黄酶，乳酸盐，NAD)溶解在TBT溶液(氨基丁三醇四唑盐，#G1781，Promega)中后，将50微升培养基与50微升底物混合物混合，在室温下反应30分钟。向其中加入50微升终止液后，在490纳米处测定培养基的吸光度以确定LDH的活性。

如图17所示，经KM-1和KM-3处理的小组经7天后对培养的人类软骨组织活力无影响。因此，可以证明本发明的发明提取物在软骨组织中无细胞毒，其证明了它是安全的。

实验实施例19：软骨保护信号传导磷酸化过程

为了测定本发明的发明提取物涉及与软骨保护机制相关的MAPK(pERK，pp38，pJNK)中的信号通路和涉及软骨细胞分化的抑制与关节再生来激活软骨细胞，采用参考实施例3中获得的蛋白根据如下方法进行了下列的实验。

将所述的蛋白加入至溶解缓冲液中混合，在4℃反应1小时，在15,000xg下离心以获得上清液。将所述的上清液保存在冰箱中；其中的一部分通过使用BCA溶液用于测定蛋白的量。将20微克蛋白置于12％丙烯酰胺凝胶上进行电泳，将其转移至硝基纤维素纸上，然后用5％的脱脂牛奶封闭1小时。向其中加入抗pERK，pp38，pJNK的抗体另外处理2小时，用TBST溶液洗涤。抗那些抗体的每个第二个抗体反应1小时，洗涤，然后用ECL溶液试剂盒曝光使其显像。

如图18所示，经KM-3和标准组分即芒果甙和绿原酸处理的小组抑制pEPK的活性，并且对引发细胞死亡信号传导的pJNK和pp38的活性进行有效的抑制，这使得其具有软骨保护功能。

实验实施例20：眼观察(CIA动物模型)

为了证明对骨关节炎的恢复作用，应用通过参考实施例5中制备的CIA动物模型进行了下列的实验。

用作阴性对照(载体)的0.5％羟甲基纤维(CMC)，用作处理组的KM-1(100，200，400毫克/千克)，KM-3(100，200，400毫克/千克)，塞来考昔(CEL，100，200毫克/千克)和氨基葡萄糖(400毫克/千克)以200毫升/天的剂量向兔子口服给药。CIA兔子的水肿程度和活动范围通过将兔子分为4分在4周内每周进行定量测定，计算数据的平均值。

如图19所示，KM-1和KM-3显著地抑制骨关节炎的水肿，并进一步增强兔子的活动范围。

实验实施例21：通过组织化学染色(CIA动物模型)确定软骨组织的修复

为了证明对软骨组织或软骨细胞的修复作用，按照文献(Byron CR等人，Am.J.Vet.Res.，66(10)，pp1757-1763)中公开的方法应用CIA动物模型进行下列组织化学染色方法。

将参考实施例5中制备的兔软骨组织的培养切片固定在10％的中性福尔马林中，进行脱钙作用，并用石蜡包埋。

将石蜡块切成5微米厚度并附着于聚L-赖氨酸包被的载玻片上(Sigma，USA)。将切片进行脱蜡、水化过程、并用苏木精和曙红染色。

为了使软骨组织中的每一个蛋白聚糖和胶原染色，将切片用番红精O(Sigma，USA)和三色素染色(Sigma，USA)(Muir HM等人，Histology，Churchill Livingstone，Edinburgh，pp 177-198，1986)。

没有识别出样本信息的病理学家可以通过染色的载玻片来观察，该载玻片通过透镜(200X)成像。

如图20所示，尽管对照组中兔股骨头软骨的软骨厚度变薄了，但是用KM-1和KM-3处理的组的股骨头软骨的软骨已经恢复到与对照组中相似的水平。特别地，KM-3处理的小组比KM-1处理的小组具有更有效的对软骨厚度的修复作用。

其结果按照文献(Kikuchi等人，Osteoarthritis，4，pp99-110，1996)中公开的方法评分并进行分级。

如表10所示，用各种因素的和，即，软骨表面破坏，软骨破坏和裂解，软骨细胞的分布等等加起来的总分在用KM-1处理的实验组中显示更低的值，与用0.5％CMC处理的对照组中的总分相比约2.2倍更低的水平，这证明本发明的提取物具有有效的软骨组织的恢复作用。

表10

实验实施例22：软骨保护作用(CIA动物模型)

为了证明对软骨组织或软骨细胞侵蚀的保护作用，如下进行了对参考实施例5中使用CIA模型兔子获得的CIA动物模型的关节石蜡组织中的胶原和蛋白聚糖的染色实验，利用马森三色染料对胶原进行染色，利用番红精染料对蛋白聚糖进行染色。

从载玻片组织中去除石蜡，用软接触镜保护液浸泡载玻片组织。将该组织用Weigert铁苏木精溶液染色10分钟，即番红精O染色法，并在流水中浸泡10分钟。其后，将该组织用固绿(FCF)溶液进一步染色5分钟并用1％醋酸冲洗10-15秒。载玻片再用0.1％的番红精O染色5分钟，脱水并密封。用显微镜观察每一个载玻片，染料含量的程度利用I-解决程序(I-solution^TMprogram)(IMTechnology，England)转换为可以计算的值。

如图21和图22所示，CIA动物模型的兔股骨头软骨的软骨厚度变薄，但是用KM-3处理的组的股骨头软骨已经恢复到与对照组中的股骨头软骨相似的水平。特别地，KM-3处理的小组较其它处理的小组具有更有效的对软骨厚度的恢复作用。

实验实施例23：软骨恢复作用(CIA动物模型)

为了证明对软骨组织或软骨细胞侵蚀的保护作用，利用从参考实施例5中获得的CIA动物模型中的使用可以识别间充质干细胞抗原的抗体(抗CD105，抗CD73)和蛋白聚糖抗体(抗聚集蛋白聚糖)，按照如下的方法进行了免疫组织化学实验。

从附着于载玻上的组织中将石蜡除去，并清洗载玻片。将所述的组织与3％的过氧化氢反应5分钟，用TBS洗涤，并用蛋白酶K处理20分钟，再次清洗。组织与山羊血清反应30分钟，然后与抗体如CD105、CD73抗体等反应，用TBS清洗。然后与过氧化物酶结合的山羊抗小鼠IgG的第二抗体反应后，所述组织与链霉标记(streptavinlabeled)的抗体反应，用DAB染色，再用苏木精对比染色后取出，用显微镜观察。

如图23所示，就在CIA动物模型的软骨下骨而言，几乎不表达间充质干细胞表面抗原和蛋白聚糖抗原，然而在用KM-3处理的小组中所述的表达却大量的增加。特别地，用KM-3处理的小组由于增加的蛋白聚糖(软骨成分)而修复受损的软骨下骨。

实验例24：软骨恢复作用(共同培养软骨下骨的软骨细胞和组织细胞)

为了证明对软骨组织侵蚀的恢复作用，按照如下的方法测定了细胞因子和骨的分化标志物，以及GAG降解的量。

从参考实施例6获得的培养基用于测定ALP的活性。将细胞溶解收集，通过测定它们在405纳米处的光密度来确定细胞内碱性磷酸酶的量，这种碱性磷酸酶可以降解p-磷酸硝基苯(Sigma-Aldrich，USA)为p-硝基苯和磷酸。还有，通过在预包被每一个抗体的板上加入100微升每一组的上清液与每个抗体反应1小时，并在540纳米处测定的光密度来确定介质中IL-1β(#200-LA，R&D system，USA)、VEGF(#DM900，R&D system，USA)和MMP-13(#DM1300，R&D system，USA)的水平。GAG的浓度通过测定与Blyscan染料溶液反应过程中产生的多阴性离子物质的量来确定，将硫酸软骨素用作标准物质。

表11

如表11所示，如果软骨下骨组织细胞只是被培养，本发明的发明提取物KM-3在细胞因子水平、生长激素水平和胶原酶水平均无作用，然而在正常的软骨下骨组织细胞中却显示了对那些非正常组织细胞中生长激素和胶原酶的具有显著的抑制作用。

再有，如图24所示，在软骨下骨组织细胞和软骨细胞被共同培养的情况下，GAG降解可显著的被抑制。

实验实施例25：单次口服剂量毒性试验

为了确认本发明的发明提取物的安全性，按照文献或补充材料(OECD(2006)：OECD Guidelines for the testing of chemicals No.425：Acure oral toxicity：Up-and-Down-Procedure(UPD))中公开的Up&Down方法，应用雌性Sprague-Dawley大鼠(Coretech，co，Korea)进行下列单次口服剂量毒性试验。

本发明的发明KM-3提取物以一次5000毫克/20毫升/千克的剂量经口服对每组包含3只大鼠的每一组给药，观察大鼠症状14天。给予提取物后，观察所有的临床变化，即死亡率、临床表现和体重变化。

结果是，经过对任一组或每种性别中未发现任何在死亡率、临床表现、体重上的变化和总体观察中的任何变化。并且，在用5000毫克/千克的本发明提取物处理的实验组中显示任何毒性。

因此，实验证明本发明中制备的发明提取物为有效和安全的物质，其MLD(最小致死量)被认为大于5000毫克/千克。

实验实施例26：两周重复口服剂量DRF毒性试验

为了确认本发明的发明提取物的安全性，按照文献(Greaves，P.(2000)：Histopathology of preclinical toxicity studies：Interpretation and relevance in drug evaluation，Elsevier)中公开的方法，应用雌性Sprague-Dawley大鼠(Coretech，Co，Korea)进行下列两周重复口服剂量DRF毒性试验。

本发明的发明KM-3提取物经口服给予三组SD大鼠，即，用1000毫克/千克/天的KM-3和2000毫克/千克/天的KM-3处理的实验组，只用佐剂(0.5％CMC-Na；羧甲基纤维素钠)处理的对照组包包含5只大鼠，观察大鼠症状14天。给予提取物后，观察所有的临床变化，即死亡率、临床表现和体重变化。

给予提取物后，观察所有的临床变化，即死亡率、临床变现、体重，并进行了血液实验如血液学实验和血液生物化学实验。解剖后观察腹部器官和胸部器官的异常变化。在每一组或每种性别中未发现在死亡率、临床表现、体重上的变化和总体观察中的任何变化。并且，用1000毫克/千克/天的KM-3和2000毫克/千克/天的KM-3处理的实验组显示任何毒性。因此，实验证明在本发明中制备的发明提取物为有效和安全的物质，经口服给药后显示了NOEL(少于1000毫克/千克)和NPAEL(2000毫克/千克)。

实验实施例27：细菌逆向突变实验

为了评价细菌中的基因毒性，按照文献(Maron D.M.and Ames B.N.(1983)：Revised methods for the Salmonella mutagenecity test.Mutat.113：173-215)中公开的方法，应用组胺必需的菌株鼠伤寒沙门氏菌，即，5种菌株TA100、TA1535、TA98、大肠埃希氏杆菌WP2 uvrA和TA1537(Molecular toxicology Inc.P.O.Box 1189 Boone，NC 28607，USA)和色氨酸必需的菌株大肠埃希氏杆菌，即，WP2 uvrA进行了细菌逆向突变实验。

50毫克/毫升的实施例2中制备的KM-3溶解在DMSO中并处理细菌。对每一种应用和未应用代谢活化系统的菌株分别设定范围为62，185，556，1667和5000克/板，实验中使用阴性对照(DMSO；Sigma-Aldrich Company)和阳性对照(2-氨基蒽，叠氮化钠，N-氧化-4-硝基喹啉，9-氨吖啶；Sigma-Aldrich Company)。

结果为，与阳性对照相比在菌落的数量中未显示增加，也没有抗细菌活性。另一方面，相对于阴性对照显示明显的菌落数量的增加。因此，可以证明KM-3处理的小组没有诱导实验菌株中的逆向突变。

实验实施例28：微核实验

为了评估基因毒性，按照文献(Heddle，J.A.，E.Staurt and M.F.Salamone(1984)：The bone marrow micronucleus test，In：Handbook of mutagenecity test procedure，2^nd Ed.，B.J.Kibey，M.Legator，W.Nichols and C.Ramel，Elsevier Science Publishers BV，pp441-457)中公开的方法，应用雄性ICR小鼠进行了骨髓微核实验。

7周龄的雄性ICR小鼠经口服给予各种剂量的实验样品，即，0，500，1000和2000毫克/千克/天，给药两天。最后给药后24小时，收集骨髓细胞以测定它们的微核诱导和细胞毒性。计数2000个多色性红细胞(PCE)/细胞用微核来计数微核多色性红细胞(MNPCE)的数量。

结果是，与用在蒸馏水中的0.5％甲基纤维素(0.5％MC)处理的阴性对照组相比，所有用本发明提取物处理的小组均没有显示统计学上显著的增加。关于在总的红细胞中的多色性红细胞的比率，实验组与阴性对照组之间也没有统计学上显著的差别。PCE/(PCE+NCE)的比例，作为细胞毒的指标，在所有实验组中显示大于0.35(平均值)，并且与阴性对照组相比在所有的实验组中均无显著下降。因此，已经证明本发明的KM-3提取物不会诱导小鼠骨髓细胞中的微核。

实验实施例29：应用中国仓鼠肺(CHL)细胞的染色体异常诱发实验

为了测定本发明提取物对哺乳动物细胞中染色体畸变的遗传毒性，按照文献(Richardson，C.，Williams，D.A.，Alen，J.A.，Amphlett，G.，Chanter，D.O.and Phillips，B(1989)：Analysis of Data from in vitro cytogenetic Assay.In：Statistical Evaluation of Mutagenecity Test Data(Kirkland，D.J.Ed.，)，Cambridge University Press，Cambridge，U.K.pp141-154)中公开的方法，使用存在或缺失代谢活化系统(S-9混合+S和-S)的中国仓鼠肺细胞进行了染色体异常诱发实验。

实验样品和阳性对照药物(水合环磷酰胺(CPA)和乙基磺酸(EMS))的处理浓度经过预实验确定，设定如表12所示的确定浓度。样本在存在(+S，6小时)和缺失(-S，6和24小时)代谢活化系统下进行处理，并计算因而发生的染色体畸变。

表12

结果如下，用KM-3处理6小时和24小时的小组在存在和缺失代谢活化系统下发生的染色体畸变的频率没有显示统计学上显著增加。因此，可证明用KM-3处理的小组在CHL细胞中没有诱导染色体畸变。

实验实施例30：hERG通道膜组分结合测试

为了测定本发明提取物潜在的导致心律不齐的作用，按照文献(Kevin Petrecca，Roxana Atansiu，Armin Akhavan and Alvin Shrier.，N-linked glycosylation sites determine HERG channel surface membrane expression.，J.Physiol.，1999，515：41-48)中公开的方法进行hERG通道膜组分结合测试，所述的测试基于许多因子中活动的潜在持续时间的增加会诱导长QT延长的发现(通过抑制钾离子通道的Ikr导致诱发心律不齐而导致突然死亡)。

为了确定Ikr通道的电流，将可以编码Ikr的hERG DNA插入载体中形成质粒，将质粒转染入CHO细胞株以表达Ikr离子通道。通过膜片钳技术确定电流密度，该技术是一种电生理学方法，根据药物的用药剂量确定抑制率IC₅₀，以预测长QT延长的潜在危险性。KM-3的剂量根据如表13所示的实验条件确定。

表13

表14

如表14所示，KM-3的抑制浓度显示为大于100克/毫升，这表明没有心血管的急性毒性。特别地，实验证明，由于非常低的因心律不齐而导致突然死亡的风险，因此本发明提取物被认为是安全的。

下文将列出构成方法和辅药的种类，但本发明不限于它们。代表性的制备实施例如叙述如下。

注射剂的制备

KM-1～4 100毫克

偏亚硫酸氢钠3.0毫克

对羟基苯甲酸甲酯0.8毫克

对羟基苯甲酸丙酯0.1毫克

注射用蒸馏水适量

注射剂的制备如下，溶解活性组分，控制pH值至约7.5，然后将所有组分填充至2毫升安瓿中，并用常规的注射剂制备方法灭菌。

粉剂的制备

KM-1～4 500毫克

玉米淀粉100毫克

乳糖100毫克

滑石粉10毫克

粉剂制备方法如下，将上述组分混合，装入密封包装中。

片剂的制备

KM-1～4 200毫克

玉米淀粉100毫克

乳糖100毫克

硬脂酸镁适量

片剂是通过将上述组分混合和压片(entabletting)制得。

胶囊的制备

KM-1～4 100毫克

乳糖50毫克

玉米淀粉50毫克

滑石粉2毫克

硬脂酸镁适量

片剂制备是通过将上述组分混合装入按照常规的明胶制备方法制备的明胶胶囊中制得。

液体剂的制备

KM-1～4 1000毫克

糖20克

多糖20克

柠檬调味剂20克

液体剂制备是通过溶解活性成分，然后将所有组分填充至1000毫升安瓿中，并按照常规的液体制备方法灭菌，制得液体剂。

保健食品的制备

KM-1～4 1000毫克

维生素混合物适量

醋酸维生素A 70毫克

维生素E 1.0毫克

维生素B₁ 0.13毫克

维生素B₂ 0.15毫克

维生素B6 0.5毫克

维生素B12 0.2毫克

维生素C 10毫克

维生素H 10毫克

烟酸酰胺1.7毫克

叶酸50毫克

泛酸钙0.5毫克

矿物质混合物适量

硫酸亚铁1.75毫克

氧化锌0.82毫克

碳酸镁25.3毫克

磷酸二氢钾15毫克

磷酸二钙55毫克

枸橼酸钾90毫克

碳酸钙100毫克

氯化镁24.8毫克

以上提到的维生素和矿物质混合物可以多种方式地进行变化。这样的变化并不被认为是偏离本发明的实质和范围的。

健康饮料的制备

KM-1～4 1000毫克

枸橼酸1000毫克

寡糖100克

杏浓缩物2克

牛磺酸1克

蒸馏水900毫升

健康饮料制备如下，溶解活性组分，混合，在85℃搅拌1小时，过滤，然后将所有组分填充至1000毫升安瓿中，并按照常规的健康饮料的制备方法灭菌。

因此，如上描述了本发明，很明显本发明可以多种方式变化。这样的变化并不被认为偏离本发明的精神和范围，所有这些修饰对本领域技术人员而言是显而易见的并希望包含于下列权利要求的范围内。

工业适用范围

如在本发明中所描述的，发明的包含混合草药金银花和知母提取物的组合物经各种实验证明具有有效的抗炎症作用，因此，它可以用来作为治疗和预防关节炎疾病的有效安全的治疗制剂或健康食品。

序列表

Col II正义引物：AAC ACT GCC AAC GTC CAG AT(SEQ.I.D.1)，反义引物：CTG CAG CAC GGT ATA GGT GA(SEQ.I.D.2)；PG正义引物：GAG GTG GTG GTG AAA GGT GT(SEQ.I.D.3)，反义引物：GTGTGG ATG GGG TAC CTG AC(SEQ.I.D.4)；MMP-1正义引物：AAAGGG AAT AAG TAC TGG G(SEQ.I.D.5)，反义引物：GTT TTT CCAGTG TTT TCC TCA G(SEQ.I.D.6)；MMP-3正义引物：TGC GTG GCAGTT TGC TCA GCC(SEQ.I.D.7)，反义引物：GAA TGT GAG TGGAGT CAC CTC(SEQ.I.D.8)；MMP-13正义引物：GAT AAA GAC TATCCG AGA C(SEQ.I.D.9)，反义引物：CGA ACA ATA CGG TTA CTC(SEQ.I.D.10)；OCN正义引物：CAT GAG AGC CCT CAC A(SEQ.I.D.11)，反义引物：AGA GCG ACA CCC TAG AC(SEQ.I.D.12)；Col I正义引物：TGA CCT CAA GAT GTG CCA CT(SEQ.I.D.13)，反义引物：GGG AGT TTC CAT GAA GCC AC(SEQ.I.D.14)；GAPDH正义引物：GCT CTC CAG AAC ATC ATC CCT GCC(SEQ.I.D.15)，反义引物：CGT TGT CAT ACC AGG AAA TGA GCT(SEQ.I.D.16)