检测石蜡包埋肝组织乙型肝炎病毒cccDNA的试剂盒

摘要

石蜡包埋肝组织的乙型肝炎病毒cccDNA定量检测试剂盒，特征是对肝组织进行石蜡包埋，然后将从中提取的总DNA分别加入HBV滚环引物和跨缺口引物，进行滚环加跨缺口荧光定量扩增。本试剂盒不需要新鲜肝组织作为检测样本，检测特异性好，灵敏度高。

说明书

技术领域：

本发明涉及一种乙型肝炎病毒cccDNA定量检测的方法，特别是用于微量石蜡包埋肝组织乙型肝炎病毒cccDNA定量检测的方法和检测试剂盒。

背景技术：

乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA(HBV cccDNA)是HBV持续感染和抗病毒药物停用后病情反复的关键因素。定量检测HBV cccDNA对于评价乙肝患者抗病毒治疗效果具有十分重要的意义，但目前在临床上尚未得到开展。有两个因素制约了HBV cccDNA检测的实际应用。

一方面是样本来源的的问题：

由于乙型肝炎病毒cccDNA主要存在于肝细胞核，需要用人新鲜肝组织作为检测样本，然而新鲜肝组织不容易得到。除非要求患者专为进行该项检测而接受创伤性的肝穿。且新鲜肝组织保存条件苛刻，无疑给科研和临床开展该项目检测产生阻碍。

目前常规病理检测用甲醛固定石蜡包埋肝组织(FFPET)作为检测对象，可保存时间长，但现有的技术方法不能进行石蜡包埋肝组织cccDNA检测。

目前国产试剂主要用于血清和外周血单个核细胞样本，但是由于cccDNA是否存在于血液尚有争议(由于HBV cccDNA主要存在于肝组织，血清中不存在或仅在肝细胞炎性坏死后有少量进入外周血，单独进行血清HBV cccDNA检测的意义十分有限)；而且血清和外周血保存时间短，因此血液并不是检测cccDNA的理想样本。

文献EUR J Gastroenterol Hepatol.2010Feb 10.[Epub ahead of print]，Detection of hepatitis B virus covalently closed circular DNA in paraffin-embedded and cryo-preserved liver biopsies of chronic hepatitis B patients.报道了“定量检测石蜡包埋肝穿组织中乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(cccDNA)”。但该文献报道的石蜡包埋肝穿组织中DNA提取方法与本发明不同，且该方法定量cccDNA仅采用跨缺口PCR，没有采用PSAD酶消化和滚环扩增，不能保证检测的特异性和灵敏性。

另外在技术方面：

目前HBV cccDNA检测主要方法为荧光探针检测技术，其中之一是跨缺口实时荧光定量PCR技术，采用跨rcDNA缺口区引物扩增cccDNA。

滚环扩增(rolling cycle amplification，RCA)是一种体外等温核酸扩增方法，其特点是只能扩增闭合环状DNA，不能有效去除PSAD酶未消化完全的非闭合环状DNA，所以仅用滚环扩增方法难以完成HBV cccDNA的定量检测。

这些方法存在以下几个问题：

1.检测的特异性和灵敏性不强

HBV cccDNA主要存在于肝细胞核中。由于HBV cccDNA的含量通常远远低于HBV松驰环状DNA(rcDNA)，跨缺口实时荧光PCR方法和Invader方法难以保证检测的特异性和灵敏性。

2.无法区分整合DNA和cccDNA

HBV慢性感染特别是肝硬化患者肝组织中存在大量整合HBV DNA，即使采用目前先进的PSAD酶降解非闭合环状DNA，仍不能保证非闭合环状DNA被完全彻底消化，也不能有效区别cccDNA和整合HBV DNA。

3.不能有效区分整合DNA、松驰环状DNA(rcDNA)和闭合环状DNA(cccDNA)。

4、样本间的差异干扰数据分析，没有内参进行标准化。

发明内容：

本发明的目的是提供一种不需要新鲜肝组织作为检测样本的乙型肝炎病毒cccDNA定量检测方法和检测试剂盒，且灵敏度高、特异性强、简单方便。

本发明提供的方法是，将石蜡包埋肝组织中提取的总DNA分别加入HBV滚环引物和跨缺口引物，进行滚环扩增加跨缺口荧光定量PCR；所述总DNA可以从乙肝患者病理检查剩余的微量石蜡包埋肝组织切片中提取。且需要量非常少，仅取4-6微米厚的切片2-3片便可完成检测(见实施例)。

具体操作步骤是：(1)石蜡包埋肝组织；(2)提取肝组织总DNA；(3)设计、合成引物与探针；(4)滚环扩增加跨缺口荧光定量cccDNA；(5)加入内参照标准化，消除样本间的差异。

所述石蜡包埋肝组织，包括以下步骤：1、固定；2、水洗；3、脱水；4、透明；5、浸蜡；6、包埋；7、切片。分述如下：

1、固定：将肝组织固定于10％福尔马林，其目的在于保存组织内细胞的形态、结构及其组成，使其与生活时相似。

2、水洗：将组织块用水冲洗。目的是洗去渗入组织中的固定液。

3、脱水：将组织块用75％-100％乙醇脱水，乙醇浓度为每次更换新的脱水剂时从低浓度到高浓度。目的是把组织中的水分彻底脱除，有利于组织的透明和浸蜡，便于永久保存。

4、透明：在二甲苯中两次透明。目的是使组织中的乙醇被透明剂所代替，以使石蜡能很顺利地进入组织中；还能增强组织的折光系数。

5、浸蜡：将透明好的组织块用石蜡浸透。浸蜡目的是为下一步包埋做准备。

6、包埋：将组织块包埋在石蜡中，待凝固冷冻，使其便于切片。

7、切片。

石蜡包埋肝组织的详细操作方法见实施例。

所述跨缺口荧光定量扩增技术，优选为Taqman跨缺口荧光定量扩增。

若在进行滚环扩增加跨缺口实时荧光PCR方法之前，先在单管中进行不降解质粒的ATP依赖的DNA酶(Plasmid safe ATP-dependent DNase，简称为PSAD)消化非闭合环状DNA，则检测效果更好。

经实验证实，本方法不仅可应用新鲜肝穿组织，还可以应用微量的福尔马林固定石蜡包埋肝穿组织(formalin-fixed paraffin embedded，FFPE)进行检测(代表性结果见附图3)本方法可以完全排除rcDNA和整合HBV DNA的干扰。本发明扩增线性范围宽：相同PCR条件下，可扩增标准品HBV cccDNA浓度范围10²-10¹⁰拷贝/毫升(图1)。

本发明研发了可以利用微量石蜡包埋肝组织检测cccDNA的滚环扩增+跨缺口荧光定量PCR新技术，尤其是突破了以往对HBV cccDNA的检测在方法学上特异性、灵敏度不高，不能有效区分整合DNA、松驰环状DNA(rcDNA)和闭合环状DNA(cccDNA)的技术瓶颈。当血清中HBV DNA含量用现有技术方法无法检测到时，用本方法仍可检测到肝组织中HBV cccDNA，最低可检测0.1拷贝/肝细胞。特别是不需要新鲜肝组织作为检测样本，采用临床病理检查剩余的石蜡包埋肝组织，不需额外取样，患者容易接受。

通过对100例慢性乙型肝炎和HBV感染相关肝硬化、肝癌患者的新鲜冰冻及石蜡包埋肝组织的检测，30例非乙型肝炎患者新鲜冰冻及石蜡包埋肝组织的检测，以及200余例HBV感染患者及健康人血清的检测，表明我们建立的检测方法具有良好的特异性、灵敏度和稳定性。

本发明的有益效果是：

1、不需要新鲜肝组织作为检测样本，采用临床病理检查剩余的石蜡包埋肝组织即可完成检测。解决了以往只能用新鲜肝组织检测造成HBV cccDNA检测用量大、样本来源困难的难题。

2、灵敏度高

检测cccDNA标准品灵敏度达到10²拷贝/毫升。当乙肝患者血清中HBV DNA含量用现有技术方法无法检测到时，用本方法仍可检测到石蜡包埋肝组织中HBV cccDNA，最低可检测0.1拷贝/肝细胞。

从附图2、图3可以看出，滚环扩增(RCA)后检测灵敏度大大增强。

3、特异性强

通过PSAD酶消化，去除非闭合环状DNA的干扰，在此基础上进行滚环扩增加跨缺口PCR，进一步去除未消化完全的非闭合环状DNA和整合DNA，进一步增强了特异性。

4、重复性好

从实施例给出的实验结果可证实，以10个梯度稀释的质粒PCP10DNA(标准品)为样本，每个样本分别进行6次重复实验，组内组间差异无显著性(p＜0.05)。对临床来源的10份样本进行4次重复检测，组内组间差异无显著性(p＜0.05)。

5、污染性小

PSAD酶消化和滚环扩增在单管中进行，使操作过程和结果分析更简便、省时，减少污染机会。

6、检测结果误差小

设置内参，消除样本间的差异干扰数据分析。

用本发明的方法可以制备检测石蜡包埋肝组织乙型肝炎病毒cccDNA的试剂及试剂盒。所述试剂盒中除常规检测试剂盒应有的试剂、工具外，还具有脱蜡及DNA提取试剂、PSAD酶，Phi29DNA聚合酶，HBV滚环引物及相关缓冲液等。检测方法的特征是：

所述脱蜡及总DNA提取的步骤详见实施例。

附图说明：

图1是HBV cccDNA检测线性范围10²-10¹⁰拷贝/毫升；

图2是不同检测方法扩增电泳图，其中：

a：以梯度稀释的PCP10质粒DNA为模板，PSAD消化后直接跨缺口荧光定量PCR；

b：以梯度稀释的PCP10质粒DNA为模板，经PSAD消化后用RCA+跨缺口荧光定量PCR扩增；

图3是不同方法检测FFPE肝组织扩增电泳图，其中：

c：FFPE肝组织DNA经PSAD消化后直接跨缺口荧光定量PCR；

d：FFPE肝组织DNA经PSAD消化后用RCA+跨缺口荧光定量PCR。

图4是部分乙肝患者FFPE肝组织样本中总HBV DNA和cccDNA的定量结果比较；

图5是HBeAg阳性与HBeAg阴性乙肝患者FFPE肝组织cccDNA水平的比较；

图6是HBeAg阳性与HBeAg阴性乙肝患者FFPE肝组织总HBV DNA水平的比较；

图7是新鲜冰冻肝组织和石蜡包埋肝组织样本cccDNA检测结果比较，其中上面是新鲜冰冻肝组织，下面是石蜡包埋肝组织。

具体实施方式

实施例1    微量石蜡包埋肝组织乙型肝炎病毒cccDNA检测

一、研究样本

研究对象为解放军302医院2008年5月～2009年5月期间100例慢性乙型肝炎患者，其中男73例，女27例，年龄范围3～68岁。诊断符合2000年第十次全国病毒性肝炎会议修订的病毒性肝炎诊断标准，排除甲、丙、丁、戊、庚型肝炎病毒及输血传播病毒、巨细胞病毒、EB病毒感染以及酒精性、药物性、自身免疫性肝病。取甲醛固定石蜡包埋(FFPE)肝组织切片4-6微米2-3片，并对其中7例病人同时进行新鲜冰冻肝组织和石蜡包埋肝组织样本对比实验。另收集非HBV感染的石蜡包埋肝组织样本作为阴性对照。

二、方法

1.制备石蜡包埋肝组织切片

1.固定：肝组织取材1.5cm×0.1cm，固定于10％福尔马林2-3小时。固定液的用量一般为组织体积的10～20倍。(组织离体后，组织细胞由于血液供应停止，即可发生缺氧，导致生物氧化过程停止。相反，细胞内的无氧酵解酶类活跃，使组织内蛋白质、糖、脂肪降解，导致组织发生自溶。另外，组织也可因污染细菌而发生腐败。固定的目的在于保存组织内细胞的形态、结构及其组成，使其与生活时相似。)

2.水洗：将组织块放在广口瓶内，胶管插入瓶内接通自来水，瓶口用纱布包住，以自来水流水冲洗30分钟。目的是洗去渗入组织中的固定液。

3.脱水

乙醇脱水过程

75％乙醇2小时

95％乙醇I 1～2小时

95％乙醇II 1～2小时

100％乙醇I 2小时

100％乙醇II 2小时

每次更换新的脱水剂时(组织块从低浓度到高浓度)，都要把组织块放在吸水纸上吸干，装组织块的容器也要控干水分，以免将水及低浓度脱水剂带入高浓度脱水剂中，影响脱水效果。脱水的目的是把组织中的水分彻底脱除。脱水有利于组织的透明和浸蜡，有利于组织的永久保存。

4.透明：

将上述样本在二甲苯中两次透明，每次透明60分钟。(透明的目的是使组织中的乙醇被透明剂所代替，以使石蜡能很顺利地进入组织中，另外，还能增强组织的折光系数)。

5.浸蜡：

在60度恒温箱中放置2个蜡杯，分别编号蜡1、蜡2。取透明好的组织块放入上述蜡缸中各1小时，使石蜡浸透组织(浸蜡目的是将石蜡透入整个组织，为下一步包埋做准备)。

6.包埋：

(1)准备包埋蜡：硬蜡(56～58℃或60～62℃)，透明无杂质。

(2)准备包埋框：金属的或一次性塑料包埋框。

(3)点燃酒精灯，准备好无齿尖镊子。

(4)在包埋框中倒入融化的石蜡，然后用无齿镊子取组织块放入石蜡中，使包埋面平整。室温下冷却。

(5)待蜡块完全凝固以后，连同包埋框放入4度冰箱45分钟后切片。

7.切片

(1)固定切片刀：刀刃向上，调好角度。

(2)固定组织块。

(3)调整所需要的切片厚度：一般在4-6微米。

(4)调整组织块与刀刃之间的角度和位置。

(5)切片：右手转动摇轮，转一圈可切下一片，切第二片与第一片连在一起，即成连续切片。左手用镊子或毛笔提起切片的下端，轻轻向自身方向拽，使切片成连续的带状。

2、提取石蜡包埋肝组织总DNA：

切取4-6微米厚石蜡包埋肝组织切片2-3片，采用德国Qiagen公司DNA提取试剂盒FFPE mini kit并加以改进。向甲醛固定石蜡包埋(FFPE)肝组织切片中加入二甲苯1毫升，短暂涡旋、13000转离心2分钟，弃上清，重复上述步骤一次。加入无水乙醇1毫升，短暂涡旋、13000转离心2分钟，弃上清，加入180微升裂解buffer重悬样品；加入20微升蛋白酶K，涡旋混匀；56度水浴3小时后，90度孵育10分钟。加入200微升AL buffer，涡旋使之充分混匀；加入200微升无水乙醇，涡旋使之充分混匀；将上述样品全部加入到柱子中，8000转离心1分钟，弃滤液；柱子放入新的收集管；小心开盖并加入500微升AW1 buffer，8000转离心1分钟，弃滤液；柱子放入新的收集管。小心开盖并加入500微升AW2 buffer，8000转离心1分钟，弃滤液；将柱子放入新的收集管，14000转离心3分钟，使滤膜干透，弃滤液；将柱子移入新的EP管中，加入60～100微升ATE，室温孵育15分钟，8000转离心1分钟，收集洗脱液，-20度冰箱储存。

3、设计、合成引物与探针

根据我国常见的HBV基因型B，C基因组全序列，设计引物及探针

RCA1  AATCCTCACAATA*C*C                    99-113

RCA2  ACCTATTCTCCTC*C*C                    1758-1744

RCA3  CCTATGGGAGTGG*G*C                    510-524

RCA4  CCTTTGTCCAAGG*G*C                    2689-2675

RCA5  ATGCAACTTTTTC*A*C                    1686-1700

RCA6  CTAGCAGAGCTTG*G*T                    29-15

RCA7  TAGAAGAAGAACT*C*C                    2240-2254

RCA8  GGGCCCACATATT*G*T                    2599-2585

p82：5-GGGGCGCACCTCTCTTTA-3                1523-1540

p83：5-AGGCACAGCTTGGAGGC-3                 1886-1870

探针：5-FAM-TCACCTCTGCCTAATCATCTC-TAMRA-3  1825-1845

4、Plasmid safe ATP-dependent DNase酶消化：

设定反应体系为：样品DNA 6.8μl，PSAD酶0.4μl，ATP应用液0.8μl，反应缓冲液2μl。反应条件为37℃30min，70℃灭活30min。

5、滚环扩增：

上述产物作为模板：加入RCA1、RCA2、RCA3、RCA4、RCA5、RCA6、RCA7、RCA8八个引物，每个引物0.0625μl，共0.5μl。95℃3min，50℃15s，30℃15s，20℃10min；再加入上述八个引物：0.0625μl/每个引物，共0.5μl，Phi29酶1μl，Phi29buffer 1μl，BSA 0.2μl，d NTP 1.6μl，无菌去离子水4.2μl。30℃16个小时。

6、跨缺口荧光定量PCR：

取上述产物3μl，dNTP5μl，Mg²⁺3.5mM，PCR缓冲液2.5μl，跨缺口引物0.5μl(终浓度5μM)，Taq酶0.5μl(终浓度2.5U)，探针0.2μl(终浓度2μM)，剩余体积用无菌去离子水补足，总体系为25μl，94℃3min，94℃10s，60℃45s，单采光，40个循环。

标准曲线由已知浓度的质粒PCP10DNA梯度稀释后建立。

7、加入内参照标准化，消除样本间的差异：

设计内参β-actin的引物β-up、β-down和探针扩增内参β-actin基因。反应体系和条件同上。

8、特异性、灵敏度和可重复性实验：

分别用有文献报道的方法PSAD消化HBV非闭合环状DNA后直接用跨缺口荧光定量PCR法及PSAD消化HBV非闭合环状DNA后用RCA+跨缺口荧光定量PCR法(本发明方法)进行cccDNA定量，检测本研究方法的特异性；同时以10个梯度稀释的质粒PCP10DNA(标准品)为样本，每个样本分别进行6次重复实验，检测组内组间差异；对临床来源的10份样本分别进行4次重复实验，检测组内组间差异。此外还以梯度稀释的已知浓度DNA为模板，评价本方法的检测灵敏度和线性范围。以新鲜冰冻、FFPE非乙肝患者肝组织及血清DNA作为阴性对照。

9、HBeAg阳性及阴性患者HBV cccDNA检测采用PSAD消化后用RCA+跨缺口荧光定量PCR方法分别对100例HBeAg阳性及阴性乙肝患者进行cccDNA水平检测，同时检测相应样本肝组织中总HBV DNA含量及血清中HBV DNA含量。

10、统计学分析：

应用SPSS16.0软件完成，通过线性相关、Pearson检验及直线回归分析等方法对数据进行分析。

三、实验结果

1、标准曲线的建立：

如附图1所示。标准曲线相关系数达0.994，HBV cccDNA检测线性范围10²-10¹⁰拷贝/毫升

2、方法特异性、灵敏度和稳定性实验：

分别以梯度稀释的已知浓度的PCP10HBV基因组重组质粒DNA和FFPE肝组织DNA为模板，分四组进行特异性实验，a组：PCP10质粒DNA经PSAD消化后直接跨缺口荧光定量PCR(文献报道方法)；b组：PCP10质粒DNA经PSAD消化后用RCA+跨缺口荧光定量PCR扩增(本发明方法)；c组：FFPE肝组织DNA经PSAD消化后直接跨缺口荧光定量PCR；d组：FFPE肝组织DNA经PSAD消化后用RCA+跨缺口荧光定量PCR。1.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果，如图2所示，梯度稀释PCP10质粒DNA经过RCA反应之后电泳条带(图2b)明显亮于未经RCA反应的相应电泳条带(图2a)；这种趋势在石蜡包埋样本DNA表现的更加明显，如图3所示，未经过RCA反应的石蜡包埋肝组织DNA，仅高浓度的样品出现目的条带，其他较小浓度的样品，由于cccDNA含量甚微达不到检测要求不能检测到(图3c)，而经过RCA反应的样品从10⁷拷贝/毫升到10²拷贝/毫升1均能出现目的条带(图3d)。以非乙型肝炎病人肝组织DNA及血清DNA作为阴性对照，均未检测出条带。表明本发明方法具有较好的特异性。用本发明方法RCA+跨缺口荧光定量PCR方法最低可检测到FFPE组织中1×10²拷贝/毫升，经内参校准后最低可检测到相当于0.1拷贝/细胞的cccDNA。表明本发明方法具有较好的灵敏性。

采用本发明方法，以10个梯度稀释的质粒PCP10DNA(标准品)为样本，每个样本分别进行6次重复实验，组内组间差异无显著性(p＜0.05)。对临床来源的10份样本进行4次重复检测，组内组间差异无显著性(p＜0.05)。表明本方法稳定性及可重复性较好。

3、FFPE肝组织中总HBV DNA和cccDNA水平的比较对100例患者进行FFPE肝组织cccDNA、总HBV DNA、血清中HBV DNA定量，以β-actin为内参照，参照文献报道的每个细胞中含有人类基因组DNA6.667pg进行细胞数的计算。利用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测条带是否为目的条带，FFPE非乙肝患者肝组织及血清DNA作为阴性对照。肝组织总HBV DNA和cccDNA水平的检测部分结果见图4，二者间呈正相关(P＜0.05)。

通过分析100例乙肝患者石蜡包埋肝组织中cccDNA含量可知，肝组织中cccDNA含量大多集中于10～100拷贝/细胞，且肝组织中cccDNA的含量与肝组织中总HBV DNA成正相关(P＜0.01)，符合理论要求。本实施例还针对肝细胞中的cccDNA含量与血清HBVDNA含量的相关性进行了分析，分析结果显示HBeAg阳性患者肝组织HBV cccDNA与血清中总HBV DNA水平相关。相关文献报道HBV cccDNA与HBeAg阳性与否关系密切，本实例HBeAg阳性患者肝组织HBV cccDNA及HBV DNA水平都高于HBeAg阴性患者(P＜0.05)(图5、图6)。

4、新鲜冰冻肝组织和石蜡包埋肝组织样本cccDNA检测结果比较新鲜冰冻肝组织cccDNA水平较石蜡包埋肝组织样本cccDNA水平略高，但同一病人二者趋势一致(图7)。

以上实施例中所用的材料、试剂的来源如下：

脱蜡及DNA提取试剂：Qiagen产品；

PSAD酶(Plasmid safe ATP-dependent DNase)：Epicentre产品；

Phi29DNA聚合酶：New England Biolab产品；

滚环引物：见实施例方法中2设计、合成引物与探针一节。