一种以痘苗病毒载体为基础的反向遗传学系统建立及应用

摘要

本发明涉及以痘苗病毒载体为基础的反向遗传学系统建立及应用，尤其涉及一种重组冠状病毒及其应用。本发明提供的蛋白，来源于含鼠肝炎冠状病毒(mouse hepatitis virus，MHV)A59株，命名为mNSP1，是如下1)或2)的蛋白：1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白；2)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白。本发明的实验证明，通过缺失突变获得的重组痘苗病毒的DNA，将其DNA通过反转录导入BHK-21细胞中，再与17CL-1共培养，获得MHV的突变体，是一个很好的疫苗候选株。

说明书

技术领域

本发明涉及一种以痘苗病毒载体为基础的反向遗传学系统建立及应用，尤其涉及一种重组冠状病毒及其应用。

背景技术

随着生物科学技术的发展，病毒学的研究方法得到了极大的丰富。其中反向遗传学技术以其定位准确、直观快捷等特点，而备受人们的青睐。然而，当人们利用传统技术手段来构建冠状病毒反向遗传学系统时遇到了一些技术瓶颈的制约。这是因为：第一，冠状病毒基因组非常大，长达30kb左右；第二，冠状病毒某些特定cDNA片段在细菌性载体中极不稳定。为此，研究者利用多种非传统方法(如人工细菌染色体技术、冠状病毒cDNA体外连接技术和痘苗病毒载体扩增技术等)进行了有益的尝试。其中痘苗病毒载体的应用使冠状病毒反向遗传学系统的建立成为可能。这是因为，与其它载体系统相比，痘苗病毒载体具有以下优点：第一，痘苗病毒载体的载量大，至少可容纳26kb的外源序列；第二，痘苗病毒载体可直接用于外源DNA片段的体外连接、插入等，这就避免了在细菌中克隆冠状病毒cDNA的麻烦；第三，痘苗病毒可介导高频率的同源重组，这有利于对冠状病毒基因组进行定向突变。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种重组冠状病毒及其应用。

本发明提供的蛋白，来源于鼠肝炎冠状病毒(mouse hepatitis virus，MHV)A59株，命名为mNSP1，是如下1)或2)的蛋白：

1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白；

2)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白。

上述序列2由238个氨基酸组成；所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

所述蛋白的编码基因mNSP1也是本发明保护的范围。

所述编码基因为如下1)-4)中任一所示的基因：

1)序列表中序列1所示的DNA分子；

2)序列表中序列1自5’末端第211-924位核苷酸所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA分子杂交且具有相同功能的DNA分子；

4)与1)或2)限定的DNA序列至少具有90％同源性且具有相同功能的DNA分子。

上述序列1由1746个核苷酸组成。

含有所述编码基因的重组载体、转基因细胞系、重组菌、表达盒或重组病毒为本发明保护的范围。

所述重组载体为用所述编码基因替换痘苗病毒载体vaccinia virus inf-1中的nsp1基因得到的。所述nsp1基因为序列表中序列3自5’末端第211-951位核苷酸。

本发明的另一个目的是提供一种重组冠状病毒。

本发明提供的重组冠状病毒，其基因组核酸为RNA，该RNA的反转录cDNA序列为序列表中序列4所示的DNA分子。

所述的蛋白、所述的编码基因、所述的重组载体或所述重组冠状病毒在制备抗病毒疫苗中的应用也是本发明保护的范围。

本发明的第三个目的是提供一种抗病毒疫苗。

本发明提供的抗病毒疫苗，它的活性成分为如下任一一种：1)所述的蛋白质；2所述的编码基因；3)所述的重组载体；4)所述重组冠状病毒。

上述应用或抗病毒疫苗中，所述抗病毒疫苗为抗冠状病毒疫苗，所述抗冠状病毒疫苗优选为抗鼠肝炎冠状病毒疫苗。

本发明的实验证明，通过缺失突变获得的重组痘苗病毒的DNA，将其DNA通过反转录导入BHK-21细胞中，再与17CL-1共培养，获得MHV的突变体，该突变体与野生型(未突变)的病毒相比，在体外可高效增殖，而在体内的致病力却大大降低，具有良好的免疫效果，因此具有发展为疫苗的潜质。

附图说明

图1为病毒生长曲线

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、突变冠状病毒表达载体的构建

1、质粒、菌、毒株和细胞

含鼠肝炎冠状病毒(mouse hepatitis virus，MHV)A59株基因组全长cDNA的痘苗病毒(vaccinia virus inf-1)记载在林磊，吴晓燕，常国辉，祝庆余.鼠肝炎冠状病毒非结构蛋白1内保守序列LLRKxGxKG的功能研究.解放军医学杂志.2010，35(5)：508-512；中，公众可从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得。

CV-1细胞(购自Invitrogen公司，Catalog no#R752-07)。

D980R细胞和17Clone-1(17CL-1)由军事医学科学院微生物流行病研究所细胞库提供，细胞在常规条件下培养。pcDNA3.1-myc-his(a)真核表达载体(购自Invitrogen公司，Catalog no#V790-20)。

BHK-21细胞、L929细胞、D980R细胞、17CL-1细胞和质粒pGPT-1(含大肠杆菌gpt基因的)均记载在Scott E.Coley，Ehud Lavi，Stanley G.Sawicki，Li Fu，et al.Recombinant Mouse Hepatitis Virus Strain A59 from Cloned，Full-Length cDNAReplicates to High Titers In Vitro and Is Fully Pathogenic In Vivo(J).病菌学杂志，2005年3月79卷5期中，公众可从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得。

一、MHV NSP1正常及突变蛋白真核表达载体的构建

1、引物设计与合成

根据鼠肝炎冠状病毒A59株(Mouse Hepatitis Virus strain A59)(GenBankNC001846)的mRNA序列设计引物如下(表1)。扩增引物由上海英骏公司合成，用无核酸酶水配制成浓度为10μM的工作液，-20℃保存备用。

表1PCR扩增引物

注：下划线序列为添加的限制性内切酶Not I(GCGGCCGC)和Xba I(TCTAGA)的酶切识别序列；NSP1 OL-R和NSP1 OL-F为缺失突变中所用的Over-lap引物。

2、Vaccinia Virus inf-1病毒载体DNA的提取

BHK-21细胞采用DMEM完全培养液(DMEM完全培养液中含有FBS(胎牛血清)、HEPES、青霉素和链霉素，所述胎牛血清在所述DMEM完全培养液中的浓度为10％(体积百分含量)，所述HEPES在所述DMEM完全培养液中的浓度为10mM，所述青霉素在所述DMEM完全培养液中的浓度为100U/mL，所述链霉素在所述DMEM完全培养液中的浓度为100U/mL。)于37℃、5％CO₂条件下培养。当细胞长至致密单层后用0.25％胰酶消化，按1∶4的比例进行传代。

重组痘苗病毒Vaccinia Virus inf-1用BHK-21细胞培养。具体步骤如下：待上述传代的BHK-21细胞长至单层后，加入用DMEM完全培养液适量稀释(moi＝1)的重组痘苗病毒载体Vaccinia Virus inf-1，于37℃培养，每日观察细胞病变。待细胞病变达到+++时(约3d)，冻融收集病毒培养液，于2,000rpm离心5min后，取细胞沉淀，按照QIAGEN公司生产的DNA提取试剂盒说明书提取重组痘苗病毒Vaccinia Virus inf-1的DNA，-70℃冻存备用。

3、MHV NSP1基因的扩增

以上述提取的重组痘苗病毒Vaccinia Virus inf-1的DNA为模板，用引物对NSP1F/NSP1R进行扩增，得到的PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，结果为扩增出约750bp大小的片段，与预期大小相符。再将PCR产物纯化回收后，测序分析，结果为该PCR产物为具有序列表中的序列3自5’末端第211-951位核苷酸，与MHV的NSP1基因(GenBank NC001846)相比无任何缺失突变，因此，扩增的PCR产物即为MHV NSP1基因。

4、LLRKxGxKG序列缺失的MHV NSP1突变基因的构建

以上述提取的DNA为模板，分别用引物对NSP1 F/NSP1 OL-R、NSP1 OL-F/NSP1 R扩增MHV NSP1基因的左、右两侧片断，PCR产物分别标记为NSP1 overlap-L和NSP1overlap-R。

以扩增的NSP1 overlap-L和NSP1 overlap-R PCR产物互为模板与引物，进行over-Lap PCR反应，得到的PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，观察结果。该PCR产物经纯化回收后，送样测序。结果：序列测定证明，该PCR产物具有序列表中序列1的自5’末端的第211-924位核苷酸，该PCR产物的基因命名为mNSP1，即为781-807nt缺失的NSP1突变基因。该基因的编码区为序列1的自5’末端的第211-924位核苷酸。该基因编码的蛋白命名为mNSP1，该蛋白的氨基酸序列为序列2。

二、同源重组质粒的构建

首先，分别克隆MHV未突变基因的上下游片段，将其插入到E.coli gpt基因(便于以后鉴定)左右两侧，构建pGPT-in同源重组质粒；其次，利用痘苗病毒介导的同源重组用E.coli gpt基因替换MHV基因组中待突变的基因，并通过GPT阳性筛选得到含e.coli gpt基因的重组痘苗病毒；再次，用突变基因替换E.coli gpt基因，构建pGPT-out同源重组质粒；最后，通过第二次同源重组用突变基因替换MHV基因组中E.coli gpt基因，经GPT阴性筛选得到含突变基因的重组痘苗病毒。具体步骤如下：

1、PCR扩增引物的设计与合成

根据鼠肝炎冠状病毒A59株(Mouse Hepatitis Virus strain A59)(GenBankNC001846)的mRNA序列设计引物如下。扩增引物由上海英骏公司合成，用无核酸酶水配制成浓度为10μM的工作液，-20℃保存备用。

表2PCR扩增所用的引物

注：下划线序列为添加的限制性内切酶Sac II(CCGCGG)、BamH I(GGATCC)、EcoR I(GAATTC)和Sal I(GTCGAC)的酶切识别序列。

2、pGPT-in-nsp1重组质粒的构建

以上述提取的痘苗病毒DNA为模板，用引物对NSP1 L-F/NSP1 L-R、NSP1 R-F/NSP1R-R分别扩增得到的两个PCR产物分别记作MHV NSP1-L(即MHV NSP1基因L(左)片段)和MHV NSP1-R(即MHV NSP1基因R(右)片段)，两个PCR产物分别经1％琼脂糖凝胶电泳观察结果。

回收MHV NSP1-L(446bp，序列3自5’末端第1位-446位核苷酸)和MHV NSP1-R(454bp，序列3自5’末端第856位-1310位核苷酸)，将回收后的MHV NSP1-L和MHVNSP1-R分别经SacII/BamH I和EcoR I/Sal I双酶切后，分别插入质粒pGPT-1内gpt基因的左侧的Sac II/BamH I位点和右侧的EcoR I/Sal I位点，得到的连接产物转化Top10F′感受态细胞得到重组子，将重组子分别以引物对NSP1 L-F/NSP1 L-R和NSP1R-F/NSP1 R-R进行菌落PCR鉴定，得到与预期大小相同的两个片段(MHV NSP1-L和MHVNSP1-R)的重组子为阳性克隆。再将阳性克隆提取质粒进一步测序验证，结果表明：阳性克隆的质粒中含有MHV NSP1-L(446bp，序列3自5’末端第1位-446位核苷酸)和MHV NSP1-R(454bp，序列3自5’末端第856位-1310位核苷酸)两个片段，且这两个片段插入正确(分别位于gpt基因的左、右两侧)。将该阳性克隆的质粒标记为pGPT-in-nsp1，并进一步扩增，备用。

3、pGPT-out-nsp1重组质粒的构建

以Overlap PCR产物(上述获得的mNSP1)为模板，以NSP1F/NSP1R为引物对，进行扩增，得到PCR产物(序列表中序列1的自5’末端第211-924为核苷酸，该序列比序列3中少27个核苷酸)经用Sac II/Sal I酶切后得到的片段，插入到质粒pGPT-1的Sac II和Sal I识别位点间，替换掉质粒pGPT-1的gpt基因，得到重组质粒。将重组质粒经PCR筛选，引物对为NSP1 L-F/NSP1 R-R，得到预期大小的片段(序列1自5’末端第211-924位核苷酸)的质粒为阳性克隆质粒。将阳性克隆质粒再进一步测序验证，测序结果表明：阳性克隆质粒中插入序列1自5’末端第211-924位核苷酸序列(与上述突变基因mNSP1一致)，验证正确。将该阳性克隆质粒标记为pGPT-out-nsp1，并进一步扩增，备用。

三、痘苗病毒介导的同源重组

CV-1细胞按1∶2的比例由75cm²培养瓶传至6孔板内，继续培养至80-90％融合时，感染重组痘苗病毒(Vaccinia Virus inf-1)(m.o.i.＝1)，37℃吸附1h，然后吸除病毒液，获得感染的CV-1细胞；按照脂质体2000(购自Invitrogen公司，货号为：Cat.No.11668-027)转染试剂的说明书，将上述获得的重组质粒pGPT-in-nsp1转入感染Vaccinia Virus inf-1的CV-1细胞中，继续培养2-3d，直至细胞病变完全，再冻融收集细胞培养物，得到GPT-IN同源重组细胞培养物，于-70℃保存、备用；

再将上述获得的重组质粒pGPT-out-nsp1导入GPT-IN同源重组细胞培养物中进行第二次同源重组，收集细胞培养物，得到GPT-OUT同源重组细胞培养物，于-70℃保存、备用。

四、GPT双向筛选

1、GPT阳性筛选

CV-1细胞按1∶2的比例由75cm²培养瓶传至6孔板内，于37℃、5％CO₂条件下培养，至细胞80％融合时，换成GPT阳性DMEM培养基继续培养24h。

GPT阳性DMEM培养基为由霉酚酸、次黄嘌呤、黄嘌呤和DMEM培养基组成，所述霉酚酸在GPT阳性DMEM培养基中的浓度为25ug/ml，所述次黄嘌呤在GPT阳性DMEM培养基中的浓度为15ug/ml，所述黄嘌呤在GPT阳性DMEM培养基中的浓度为250ug/ml。

取上述获得的GPT-IN同源重组细胞培养物，冻融3次后，用GPT阳性DMEM培养基依次10倍稀释，并感染上述在GPT阳性DMEM培养基中培养的CV-1细胞，37℃吸附1h；期间，将0.25％Gelrite(固化剂，质量百分含量)和2×MEM培养基(每500ml2×MEM培养基按照如下方法制备：将100ml 10×MEM、10ml 2M HEPES、10ml 100×青霉素链霉素抗生素、25ml 7.5％碳酸氢钠、10ml 100×L-谷氨酰胺、10ml 100×MEM非必需氨基酸和100ml胎牛血清混合，用水定容到500ml。)预热至56℃，且在2×MEM培养基中加入GPT阳性筛选药物(霉酚酸、次黄嘌呤和黄嘌呤，所述霉酚酸在2×MEM培养基中的浓度为25ug/ml，所述次黄嘌呤在2×MEM培养基中的浓度为15ug/ml、所述黄嘌呤在2×MEM培养基中的浓度为250ug/ml)；待病毒吸附完成后，吸除病毒液，将适量0.25％ Gelrite和加入GPT阳性筛选药物的2×MEM培养基等体积混匀，按3ml/孔加入各孔；室温放置3-5min，待其凝固后，置于37℃继续培养，直至观察到明显细胞病变(CPE)，挑取单个噬斑，获得已纯化的GPT-IN重组痘苗病毒，-70℃保存备用。

2、GPT阴性筛选

D980R细胞按1∶6的比例由75cm²培养瓶传至6孔板内，于37℃、5％CO₂条件下培养，至细胞60-70％融合时，换成GPT阴性DMEM培养基(由6-硫鸟嘌呤和DMEM培养基组成，6-硫鸟嘌呤在所述GPT阴性DMEM培养基中的浓度为0.5ug/ml。)继续培养6h。

取上述获得的GPT-OUT同源重组细胞培养物，冻融3次后，用GPT阴性DMEM培养基依次10倍稀释，按1ml/孔感染上述在GPT阴性DMEM培养基中培养的D980R细胞，37℃吸附1h；吸附完成后，吸除病毒液，每孔补加GPT阴性DMEM培养基3ml；37℃继续培养，直至观察到明显细胞病变(CPE)。挑取单个噬斑，获得已纯化的GPT-OUT重组痘苗病毒，-70℃保存备用。

五、重组痘苗病毒的PCR鉴定

1、PCR鉴定引物的设计与合成

根据鼠肝炎冠状病毒A59株(Mouse Hepatitis Virus strain A59)(GenBankNC001846)的mRNA序列及pGPT-1质粒序列设计引物如下(表3)。引物由上海英骏公司合成，用无核酸酶水配制成浓度为10μM的工作液，-20℃保存备用。

表3PCR鉴定所用的引物

2、PCR鉴定

提取上述获得的已纯化的GPT-OUT的重组痘苗病毒和上述获得的已纯化的GPT-IN重组痘苗病毒和Vaccinia Virus inf-1的DNA。将这三种DNA分别作为模板，每种分别以引物对L-F/L-R、R-F/R-R、GPT L-F/R-R、GPT R-F/R-R进行PCR反应，检测NSP1基因与GPT基因的重组情况。

PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳观察结果，相应片段纯化回收后，送样测序。

PCR及测序结果：

以亲代病毒Vaccinia Virus inf-1中的DNA为模板，L-F/L-R为引物，PCR产物为序列3的自5’末端第153-737位核苷酸；R-F/R-R为引物，PCR产物为序列3的自5’末端第637-1773位核苷酸；GPT L-F/R-R为引物，无条带；GPT R-F/R-R为引物，无条带。可以看出，有NSP1基因的相应扩增产物。

以已纯化后的GPT-IN重组病毒的DNA为模板：L-F/L-R为引物，无条带；R-F/R-R为引物，无条带；GPT L-F/R-R为引物，PCR产物为GPT基因序列和序列3的自5’末端第856-1773位核苷酸；GPT R-F/R-R为引物，PCR产物为序列3的自5’末端第856-1773位核苷酸。可以看出，在纯化后的GPT-IN重组病毒中只有GPT基因的扩增产物，无NSP1基因全长的扩增产物，这说明，已经完成了E.coli gpt基因与MHVNSP1内的部分序列(序列3的第447-855为核苷酸)的重组置换。将只有GDT基因的纯化后的GPT-IN重组病毒命名为Vaccinia Virus-gpt-in-nsp1(V.V.-gpt-in-nsp1)。

以已纯化后的GPT-OUT重组病毒的DNA为模板：L-F/L-R为引物，PCR产物为序列1的自5’末端第153-737位核苷酸；R-F/R-R为引物，PCR产物含有序列1的自5’末端第635-1746位核苷酸；GPT L-F/R-R为引物，无条带；GPT R-F/R-R为引物，无条带。可以看出，只有NSP1基因的相应扩增产物，无GPT基因的扩增产物。这说明，已纯化后的GPT-OUT重组病毒完成了mNSP1(序列1的自5’末端第211-924位核苷酸。)与E.coli gpt基因的重组置换。这些纯化后的GPT-OUT重组痘苗病毒，命名为Vaccinia Virus-gpt-out-nsp1(V.V.-gpt-out-nsp1)。

实施例2、突变病毒的制备

六、含有mNSP1基因鼠肝炎冠状病毒(MHV)突变体的拯救

1、重组痘苗病毒DNA的提取

BHK-21细胞采用DMEM完全培养液(含10％FBS，10mM Hepes，100U/mL青霉素和100U/mL链霉素)于37℃、5％CO₂条件下培养。当细胞长至致密单层后用0.25％胰酶消化，按1∶4的比例进行传代。

重组痘苗病毒V.V.-gpt-out-nsp1用BHK-21细胞培养。具体步骤如下：将BHK-21细胞培养至单层后，加入用培养液稀释的重组痘苗病毒V.V.-gpt-out-nsp1原液(moi＝1)，于37℃培养，每日观察细胞病变。待细胞病变达到+++时(3d)，冻融收集病毒培养液，于2,000rpm离心5min后，取细胞沉淀，提取重组痘苗病毒V.V.-gpt-out-nsp1的DNA。提取完成后，于260nm处测定其OD值，以判断DNA浓度和纯度。重组痘苗病毒V.V.-gpt-out-nsp1原液即为上述得到的已纯化的V.V.-gpt-out-nsp1。

DNA纯度A260/A280＝1.90，浓度达2000ng/ul。

2、体外转录

取上述提取的重组痘苗病毒V.V.-gpt-out-nsp1的DNA(～10ug)，加入50ul10×NEB Buffer 3和100U EagI(购自BioLabs公司。货号为：R0505)，加水补足体积至500ul；混匀后，于37℃酶切2h。经酚/氯仿/异戊醇抽提后，加2.5倍体积的无水乙醇沉淀，13,000rpm离心15min，弃上清，加0.5ml 70％乙醇洗涤，13,000rpm离心15min，吸除上清液，加20ul无核酸酶的水，获得酶切回收的DNA，-20℃保存、备用。以上述酶切回收的DNA为模板，用Promega公司RiboMAX RNA T7试剂盒进行体外转录反应，得到V.V.-gpt-out-nsp1的RNA，于-80℃保存备用。

3、MHV基因组全长RNA的转染

BHK-21细胞按1∶6的比例由75cm²培养瓶传至6孔板内，于37℃、5％CO₂条件下培养，至细胞80-90％融合时，用脂质体(购自Invitrogen公司。货号为：Cat.No.1668-027)将2ug V.V.-gpt-out-nsp1的RNA转入BHK-21细胞，37℃继续培养。

17CL-1细胞按1∶4的比例由75cm²培养瓶传至6孔板内，于37℃、5％CO₂条件下培养，使其在BHK-21转染24h后，刚好生长至致密单层。此时，用胰酶消化17CL-1细胞及转染的BHK-21细胞，并将其按4∶1比例混合，接种至6孔板(1×10⁷细胞/孔)中，33℃继续培养，观察细胞病变。收集病变孔上清及细胞培养物，记作MHV突变体(MHV mu)，-70℃保存备用。

七、MHV突变体的纯化与鉴定

利用17CL-1细胞，通过3轮噬斑挑选，对MHV突变体进行纯化，然后用QIAGEN公司RNeasy Mini Kit提取纯化的MHV突变体RNA，用Invitrogen公司Superscript III反转录酶进行反转录，取上述反转录产物为模板，以引物对NSP1 F/NSP1 R扩增，得到PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，观察结果，并回收相应目的条带，送样测序。结果，与野生型MHV(MHV wt)(序列3)相比，MHV突变体(MHV mu)中的NSP1基因的781-807nt(LLRKxGxKG)发生了缺失。这表明，拯救得到了LLRKxGxKG序列(781-807nt)缺失的MHV突变体，命名为MHV-NSP1Δ27。提取MHV-NSP1Δ27的基因组测序，结果为其基因组核酸为RNA，该RNA的反转录cDNA序列为序列表中序列4所示的DNA分子。

鼠肝炎冠状病毒(mouse hepatitis virus，MHV)A59株(野生型MHV，MHV wt，)记载在Scott E.Coley，Ehud Lavi，Stanley G.Sawicki，Li Fu，et al.Recombinant Mouse Hepatitis Virus Strain A59from Cloned，Full-Length cDNA Replicates to High Titers In Vitro and Is Fully Pathogenic In Vivo(J).病菌学杂志，2005年3月79卷5期.中，公众可从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得。

八、MHV突变体生长曲线的测定

MHV用17CL-1细胞进行增殖，并通过噬斑分析测定其滴度(log PFU/ml)。生长曲线的测定方法具体如下：

MHV wt和上述获得的MHV-NSP1Δ27按1m.o.i.分别感染17CL-1细胞，于33℃吸附1小时，然后吸除病毒液，并用PBS冲洗2遍，随后加入正常DMEM培养基；此时收集1个感染孔的细胞及上清，记作时间点0h p.i.，之后每隔2小时收集1次，直至24h p.i.；取各时间点收集的细胞培养物，反复冻融3次后，进行噬斑分析测定其病毒滴度(Log PFU/ml)。

结果为MHV wt病毒0h、2h、4h、6h、8h、10h、12和24h滴度分别为：2.81、2.85、2.60、3.00、3.30、4.90、6.00、和7.85Log PFU/ml；而MHV-NSP1Δ27病毒上述各时间点滴度则分别为：2.18、2.54、2.40、2.85、2.70、3.93、5.00和6.98Log PFU/ml。

分析实验数据，绘制病毒生长曲线，见图1所示。

实验结果：在17CL-1细胞中MHV-NSP1Δ27与MHV wt的复制周期完全一致，病毒增殖主要发生在感染后8-12小时，但MHV-NSP1Δ27的复制能力略低于MHV wt。这说明，LLRKxGxKG序列缺失对MHV的体外复制能力有一定的影响，但并不显著。

实施例3、实验动物检测

一、检测MHV-NSP1Δ27对MHV致病力的影响

将24只3-4周龄雄性C57BL/6小鼠分为三组：PBS组、MHV wt组和MHV-NSP1Δ27组，每组8只；

每组的注射方法为：PBS组：通过腹腔向小鼠体内注射0.5ml的PBS；

MHV wt组：通过腹腔向小鼠体内注射5×10⁶PFU/只的MHV wt；

MHV-NSP1Δ27组：通过腹腔向小鼠体内注射5×10⁶PFU/只的MHV-NSP1Δ27；

观察10天，MHV-NSP1Δ27或MHV wt感染后小鼠都伴有弓背、耸毛等症状，严重感染时表现为偏瘫、行动迟缓等。PBS组小鼠正常。

同时称量各小组的小鼠的体重，PBS组小鼠体重在感染后第0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10天分别为13.65g、14.53g、14.98g、15.49g、16.21g、17.26g、18.34g、19.18g、19.82g、19.85g、20.28g；

MHV-NSP1Δ27组小鼠体重在感染后第0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10天分别为12.70g、11.79g、11.23g、11.21g、11.16g、11.17g、12.70g、13.16g、13.74g、14.34g、15.04g；

MHV wt组小鼠体重在感染后第0、1、2、3、4、5天分别为13.51g、12.13g、12.22g、12.83g、12.55g、15.50g。

MHV-NSP1Δ27组和MHV wt组感染小鼠体重均显著下降，MHV-NSP1Δ27组至感染后第4天体重降至最低，随后缓慢上升，而MHV wt组感染第5天已经全部死亡，无法统计体重。

同时统计各小组的小鼠的死亡个数，PBS组小鼠死亡数量在感染后第10天仍无死亡；

MHV-NSP1Δ27组小鼠死亡数量在感染后第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10天分别为0只、0只、0只、0只、1只、2只、0只、0只、0只、0只；

MHV wt组小鼠死亡数量在感染后第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10天分别为0只、2只、2只、1只、2只、0只、0只、0只、0只、0只。

MHV wt感染组在感染后第2天就开始出现死亡，至第5天达到死亡高峰，其致死率为87.5％；而MHV-NSP1Δ27感染组在感染后第5天才开始出现死亡，至第6天达到高峰，其致死率为37.5％，与MHV wt相比下降了50％。

上述试验证明，MHV-NSP1Δ27(LLRKxGxKG序列缺失后MHV)对小鼠的致病力显著下降，其表现为推迟发病和致死率大大降低。

二、检验脑内不同感染量

将30只3-4周龄雄性C57BL/6小鼠分为5组，每组6只，具体为：

MHV-NSP1Δ27组(200PFU)：脑内注射200PFU MHV-NSP1Δ27；

MHV-NSP1Δ27组(2×10⁴PFU)：脑内注射2×10⁴PFU MHV-NSP1Δ27；

MHV wt组200PFU：脑内注射200PFU MHV wt；

MHV wt组(2×10⁴pFU)：脑内注射2×10⁴PFU MHV wt；

PBS组：脑内注射0.2mlPBS。

采用上述一的方法，通过脑内注射对C57BL/6小鼠进行了不同剂量(200PFU/只和2×10⁴PFU/只)的感染试验。结果发现，与腹腔感染类似，染毒小鼠也都伴有弓背、耸毛等症状，所不同的是脑内感染小鼠还表现出翘尾症状，严重感染时出现身体前后摇摆、行走不稳的状况。

PBS组小鼠在感染后第10天仍无死亡；

200PFU/只剂量组中，MHV-NSP1Δ27组小鼠死亡数量在感染后第10天仍无死亡；MHV wt组小鼠死亡数量在感染后第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10天分别为0只、0只、0只、0只、1只、0只、0只、0只、1只、0只；MHV wt感染后第5天开始出现死亡，并且在第9天再次出现死亡，其致死率为33.3％；MHV-NSP1Δ27感染组无死亡病例出现，致死率为0％。

2×10⁴PFU/只剂量组中，MHV-NSP1Δ27组小鼠在感染后第10天仍无死亡；MHV wt组小鼠死亡数量在感染后第1、2、3、4、5、6、7天分别为0只、0只、0只、0只、2只、3只、1只；MHV wt感染后第5天开始出现死亡，并且在第6天达到高峰，至第7天感染小鼠已全部死亡，其致死率为100％；而MHV-NSP1Δ27感染组仍无死亡病例出现，致死率为0％。

可以看出，无论哪种感染方式的结果均为：LLRKxGxKG序列缺失后，MHV突变体(MHV-NSP1Δ27)对小鼠的致病力显著降低。

三、检验MHV突变体(MHV-NSP1Δ27)的免疫保护效果

将30只3-4周龄雄性C57BL/6小鼠分为五组：

PBS免疫对照组：通过腹腔接种了0.5ml的PBS，两周后再经腹腔注射5×106pFU/只的MHV wt进行攻毒

免疫组1：通过腹腔接种了5×10³PFU/只的MHV-NSP1Δ27，两周后再经腹腔注射5×10⁶PFU/只的MHV wt进行攻毒；

免疫组2：通过脑内分别接种了200PFU/只的MHV-NSP1Δ27，两周后再经脑内注射2×10⁴PFU/只的MHV wt进行攻毒

免疫组3：通过脑内分别接种了2×10⁴pFU/只的MHV-NSP1Δ27，两周后再经脑内注射2×10⁴PFU/只的MHV wt进行攻毒

未免疫组：通过脑内接种了0.2ml的PBS，两周后再经脑内注射2×10⁴pFU/只的MHV wt进行攻毒。

结果：14天观察，PBS免疫对照组经腹腔感染5×10⁶PFU MHV wt后，小鼠病死率高达66.7％；而免疫组1腹腔经腹腔感染5×10⁶PFU MHV wt后，小鼠无一死亡；免疫组2和免疫组3经不同剂量的MHV-NSP1Δ27脑内免疫后，再通过脑内感染2×10⁴pFU的MHV wt，小鼠也无一死亡；未免疫组小鼠脑内感染同等剂量的MHV wt后，其病死率是100％。

由此证明，MHV-NSP1Δ27具有良好的免疫原性，并且接种较低剂量的MHV-NSP1Δ27即对MHV wt感染具有良好的免疫保护效果。

实验结果显示，无论经腹腔或脑内免疫，MHV-NSP1Δ27对MHV wt感染都具有良好的免疫保护效果。

上述结果表明：LLRKxGxKG序列缺失的MHV突变体MHV-NSP1Δ27可有效刺激机体产生免疫应答，对MHV wt感染具有良好的保护效果；同时MHV-NSP1Δ27还具有体外高效复制、体内低致病力的特点，因此是一个很好的疫苗候选株。