猫泛白细胞减少症病毒反向遗传学操作系统的建立

摘要

猫泛白细胞减少症病毒（Feline panleukopenia virus，FPV，FLPV），又称猫细小病毒。主要易感动物是猫，故而又称为猫瘟热病，也可感染猫以外的多种猫科动物。由于细小病毒颗粒体积极小，最初并没有学者报道。随着电镜及病毒分离技术广泛使用，科研者在传代细胞和肿瘤组织陆续分离到细小病毒。法国人Verge首次发现，1939年正式命名，1985年首次在我国自然感染病例中分离到一株猫细小病毒，从而证实猫细小病毒在我国流行。1986年国内文献首次报道云豹、非洲幼狮、华南虎均感染了FPV。由此证明：虎、豹、狮等多种珍稀野生动物已经严重受到猫泛白细胞减少症病毒的威胁。我国某实验动物基地2008年从猴传染性腹泻病料中分离到一株猫细小病毒的变异株（BJ-22株），其VP2氨基酸序列与FPV的同源性高达98.75％，与CPV的同源性为98.15%。可见，FPV宿主感染谱正在不断扩大，已由最初的猫科动物扩展至非人灵长类，对社会公共卫生安全构成巨大威胁。
　　本文首先对FPV HH-1/86株细小病毒理化性质进行鉴定，并对其全基因组进行测序。在此基础上构建该株细小病毒感染性克隆pFPV，利用脂质体转染法将其导入F81细胞，成功拯救获得带有遗传标记的重组病毒 rFPV。为揭示猫细小病毒高频率跨物种传播特征和分子机制提供反向遗传学操作平台；为猫细小病毒跨物种传播预警和有效防治提供科学依据。
　　该株病毒电镜下可见直径20nm左右的立体对称细小病毒粒子。经实验证实：该病毒在连续50℃加热1h、pH3.0作用2h和乙醚作用2h，病毒TCID50升高不到一个对数，表明病毒对热、酸、乙醚具有一定的耐受性，pH在5.8～6.80.015M PBS均能凝集1%猪红细胞，其中pH6.5血凝活性最佳。该病毒全基因组长5123nt，C+G的含量为36.35%。3’末端反向重复序列（Inverted Terminal Repeats，ITR）形成Y型结构，长126nt；5’末端ITR形成U型结构，长198nt。
　　本实验利用overlap PCR方法，以病毒基因组片段M1、M2、M3为模板，克隆基因组中间大片段M1+M2+M3，经凝胶电泳鉴定正确。通过Infusion克隆技术将中间片段M1+M2+M3插入含3’和5’端质粒pE中。体外定点突变：将2981nt由A→G，产生一个新酶切位点Xho I，构建FPV全基因组感染性克隆pFPV。经酶切和序列测定证明pFPV正确，用脂质体转染方法，以Lip3000与质粒pFPV按7.5μL：3.5μg比例转染F81细胞。转染后72h，细胞出现明显拉网、脱落等细小病毒细胞病变，将rFPV0三冻三融后按5%同步接毒，第2代后rFPV接毒量降至1%同步接毒，连续传代至15代，用于病毒鉴定。通过CPE鉴定、免疫荧光、生长曲线、血凝试验、western blot试验，结果证明，rFPV与亲代毒（FPV HH-1/86）病毒学及生物学特性没有明显差异。
　　本研究为探究猫细小病毒跨物种传播关键氨基酸位点、揭示猫细小病毒高频率跨物种传播分子机理，从而有效防治猫细小病毒跨物种传播奠定基础。

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第一章 引 言

1.1细小病毒形态及理化特征

1.2细小病毒基因组组成及蛋白功能概述

1.3细小病毒滚动式复制

1.4细小病毒受体转铁蛋白

1.5 FPV、MEV和CPV的进化概述

1.6病毒反向遗传学研究概况

1.7研究内容及目的意义

第二章 FPV HH-1/86株理化性质鉴定及全基因组测序

2.1材料与方法

2.2结果

2.3讨论

第三章 FPV全长质粒pFPV构建

3.1材料与方法

3.2结果

3.3讨论

第四章 rFPV病毒拯救与鉴定

4.1材料与方法

4.2结果

4.3讨论

第五章 全文结论

5.1结论

5.2展望

参考文献

致谢

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附表1 进化分析所参照的FPV、MEV和CPV的序列信息