基于多功能聚酰胺-胺树状大分子负载抗癌药物的方法

摘要

本发明涉及一种基于多功能聚酰胺-胺树状大分子负载抗癌药物的方法，包括：(1)将第五代聚酰胺-胺树状大分子溶解于DMSO溶液，加入含FI的DMSO溶液，透析冻干；(2)将FA溶解在DMSO溶液中，加入EDC，再加入含G5.NH

说明书

技术领域

本发明属负载抗癌药物的方法领域，特别是涉及一种基于多功能聚酰胺-胺树状大分子负载抗癌药物的方法。

背景技术

现在癌症化学治疗经常面临着这样的一个问题，抗癌药物不仅杀死了癌症组织，而且对正常的组织也会产生副作用。另外，许多抗癌药物的水溶性不好，严重限制了药物的生物利用度。面对这样的问题，许多药物输送体系包括脂质体、聚合物胶束、纳米颗粒和树状大分子用来包裹药物，从而提高了药物的溶解性并且实现了药物的靶向运输。特别地，作为一类高度支化、单分散性和合成性的大分子，树状大分子已经在靶向药物传输体系上得到了广泛的关注。

树状大分子(Dendrimers)是指具有树状结构，高度支化，由分子内核、表面功能基团及连接二者的支化链段构成的合成性大分子。树状大分子具有尺寸大小可精确控制、无免疫原性、稳定、在使用剂量下无毒性等特点。其内核为疏水空间，可以物理包裹一些药物；端基官能团可以静电吸附许多药物，也可以化学键合一些药物，同时可以修饰不同的官能团，如减小毒性的基团(PEG、羟基、乙酰基、羧基等)、标记物(异硫氰酸荧光素(FITC)、生物素)和靶向配体(抗体、叶酸、RGD(Arg-Gly-Asp)多肽、半乳糖等)，这样就可以形成毒性小、具有标记和靶向作用的多功能载药纳米颗粒。树状大分子作为药物载体可延长药物在血液中的滞留时间，控制药物在体内的释放速率，保护药物免受环境破坏，具有很好的缓释作用和靶向性。这使其在药物载体的应用领域具有较好的前景。

树状大分子可作为新型药物载体与药物形成纳米级微粒给药系统，其与药物的结合方式可分为两种：1)化学键合；2)物理包裹和吸附。前者将药物共价键合在树状大分子的表面，然而共价键合一般都需要许多步有机反应，并且共价键应该在特定的生物条件下能够断裂将药物释放出来。后者的反应比较简单，但是药物/树状大分子复合物在体内的稳定性又面临着挑战。

2-甲氧基雌二醇(2-methoxyestradiol，2-ME)是雌二醇在体内的生理代谢产物，存在于血液和尿液中。研究发现，2-ME可抑制多种人类或动物肿瘤细胞的增殖，其抗肿瘤活性主要是通过诱导肿瘤细胞和内皮细胞凋亡、抑制细胞增殖、抗血管新生、增强肿瘤细胞对辐射的敏感性而实现的。2-ME已经被证明是一个潜在的抗癌药物。然而，2-ME的水溶性不好，严重限制了它在体内的生物利用度。因此，为了提高2-ME的水溶性和生物利用度，为了保持2-ME对肿瘤的抑制作用，使用各种药物载体对2-ME进行负载是非常有必要的。

总结目前的研究，2-ME被药物载体所负载这方面的研究还很少。2008年，Desai KGH等[Desai KGH，Mallery SR，Schwendeman SP.Effect of formulation parameters on2-methoxyestradiol release from injectable cylindrical poly(DL-lactide-co-glycolide)implants.Eur J Pharm Biopharm 2008；70：187-98]用可注射的圆柱状聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)作为植入物对2-ME进行负载，试验证明，PLGA对2-ME的负载不仅提高了2-ME的溶解度，而且2-ME的释放可以持续长达一个月，大大提高了2-ME的生物利用度。2009年，Wang SH等人[Wang SH，Shi XY，Chen XS，Baker JR.TherapeuticEfficacy of 2-Methoxyestradiol Microcrystals Encapsulated within Polyelectrolyte Multilayers.Macromol Biosci 2009；9：429-36.]通过层层自组装技术将2-ME包裹在聚合物多层胶囊里，虽然2-ME的溶解度提高了，且与纯药2-ME具有相同的生物活性，但是，最终形成的2-ME颗粒尺寸太大(大约1μm)，不适合癌症组织的靶向治疗。在我们最近的工作中(Shi X，Lee I，ChenX，Shen M，Xiao S，Zhu M，et al.Influence of dendrimer surface charge on the bioactivity of2-methoxyestradiol complexed with dendrimers.Soft Matter 2010；6：2539-2545；中国发明专利，申请号：200910199867.3.)，我们采用第五代表面具有不同电荷的树状大分子来包裹2-ME分子，并研究被包裹的2-ME分子的生物活性，试验表明，末端基团为酰基、羟基、氨基、羧基的第五代树状大分子可以包裹2-ME分子，但是只有末端基团为酰基和羟基的树状大分子包裹的2-ME分子对癌症细胞有毒性作用，而表面为氨基的第五代树状大分子由于自身氨基引起的毒性，因而不适合用于药物载体。

检索国内外有关多功能树状大分子负载2-ME药物方面的文献和专利结果表明：在还没有发现用多功能树状大分子负载2-ME药物的文献。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种基于多功能聚酰胺-胺(PAMAM)树状大分子负载抗癌药物的方法，该制备方法简单，适合于工业化生产；负载2-ME后，2-ME的水溶解度大大提高，药物释放时间也延长了，被多功能的树状大分子包裹的2-ME仍然具有着相同的生物活性，并且对那些高叶酸受体表达的癌细胞具有靶向的杀伤作用。

本发明的一种基于多功能聚酰胺-胺(PAMAM)树状大分子负载抗癌药物的方法，包括：

(1)将52.0mg-55mg的第五代聚酰胺-胺树状大分子溶解于5mL-10mL的DMSO溶液中，在搅拌的情况下，逐滴加入5mL-10mL含3.9mg-4.2mgFI的DMSO溶液，反应24h-48h，将反应溶液放入透析袋中，在PBS缓冲液中透析，再在去离子水中透析，最后将透析袋中的溶液冻干即得G5.NH₂-FI；

(2)将2.55mg-2.9mgFA溶解在5mL-10mL的DMSO溶液当中，然后加入22.1mg-25mgEDC，在室温条件下搅拌反应3h-5h后，将混合溶液逐滴地加入到5mL-10mL含35.0mg-40mg G5.NH₂-FI的DMSO溶液当中，搅拌反应3-5天，将反应溶液放入透析袋中，在PBS缓冲液中透析，再在去离子水中透析，最后将透析袋中的溶液冻干即得G5.NH₂-FI-FA；

(3)将26.3mg-28mg G5.NH₂-FI-FA溶解在5mL-10mL DMSO溶液当中，加入52.74mg-56mg三乙胺，然后逐滴地加入5mL-10mL含44.35mg-48mg乙酸酐的DMSO溶液中，搅拌反应1-2天，将反应溶液放入透析袋中，在PBS缓冲液中透析，再在去离子水中透析，最后将透析袋中的溶液冻干即得G5.NHAc-FI-FA；

(4)将上述10mg-12mgG5.NHAc-FI-FA溶于1.5mL-2mL水中，然后加入300μL-400μL含2-甲氧基雌二醇(2-ME)的甲醇溶液，剧烈搅拌12-24h，离心除去沉淀，即未包裹的药物分子，取上清液冻干即得5.NHAc-FI-FA/2-ME复合物；其中2-ME∶G5.NHAc-FI-FA摩尔比＝10-12∶1。

所述以第五代聚酰胺-胺树状大分子(来源)为模板，每个树状大分子上分别以共价键键合5个异硫氰酸荧光素(FITC)分子、5个叶酸(FA)分子，树状大分子表面剩余的氨基和过量乙酸酐(Ac)分子反应。

所述步骤(3)所制备的每个G5.NHAc-FI-FA中FITC和FA的分子个数都是5。

所述步骤(4)离心条件为7000rpm，10min。

对负载抗癌药物的多功能聚酰胺-胺(PAMAM)树状大分子的制备、药物缓释及肿瘤靶向治疗研究，我们做了一些测试：

(1)NMR测试结果

NMR测试结果表明：以第五代树状大分子为模板，已经成功合成了多功能的树状的分子G5.NHAc-FI-FA。每个树状大分子表面健合的FI和FA的数量都是5。参见附图说明1。

(2)UV-Vis测试结果

UV-Vis图谱证明了树状大分子G5.NHAc-FI-FA已经成功地负载了抗癌药物2-ME，即成功地合成了G5.NHAc-FI-FA/2-ME复合物。参见附图说明2。

(3)HPLC测试结果

HPLC测试结果表明每个G5.NHAc-FI-FA分子中包裹有3.7个2-ME分子。

(4)药物释放结果

药物释放曲线表明：2-ME药物分子被树状大分子G5.NHAc-FI-FA包裹后，释放速度变慢了。在pH为7.4和5.0条件下，24h后仅释放了35％和25％。参见附图说明3。

(5)相差显微镜结果

KB细胞形态的相差显微镜照片表明：G5.NHAc-FI-FA/2-ME复合物对KB细胞的杀伤作用与相同浓度的纯药2-ME的效果相同，说明2-ME被G5.NHAc-FI-FA负载后仍然具有相同的生物活性。参见附图说明4。

(6)荧光显微镜结果

荧光显微镜照片表明：用G5.NHAc-FI-FA/2-ME复合物分别作用于KB-HFAR细胞和KB-LFAR细胞1h后，KB-HFAR细胞有明显的荧光，说明G5.NHAc-FI-FA/2-ME复合物对KB-HFAR细胞有特异的靶向性。参见附图说明5。

(7)MTT细胞活力测定结果

MTT细胞活力测定结果表明：用G5.NHAc-FI-FA/2-ME复合物分别作用于KB-HFAR细胞和KB-LFAR细胞后，表面表达高叶酸受体的KB-HFAR细胞的杀伤效应更加明显，说明G5.NHAc-FI-FA/2-ME复合物对KB-HFAR细胞有特异的治疗效果。

以第五代聚酰胺-胺树状大分子为模板，合成具有靶向功能和标记功能的第五代树状大分子，并用多功能的树状大分子来物理包裹2-ME药物分子。本发明涉及了一个基本原理：第五代聚酰胺-胺树状大分子内部是一个疏水的空间，2-ME是个不溶于水的药物，树状大分子通过疏水相互作用将2-ME包裹在其内部空腔内。

有益效果

(1)本发明的制备方法简单，适合于工业化生产；选用的第五代聚酰胺-胺树状大分子的尺寸大小为5.4nm，在血液循环中可以直接从肾脏中排出，不需要生物降解；

(2)本发明的多功能的树状大分子负载2-ME后，2-ME的水溶解度大大提高，药物释放时间也延长了，被多功能的树状大分子包裹的2-ME仍然具有相同的生物活性，并且对那些高叶酸受体表达的癌细胞具有靶向的杀伤作用。

附图说明

图1为本发明制备的多功能树状大分子G5.NHAc-FI-FA的¹H NMR图谱。

图2为本发明制备的多功能G5.NHAc-FI-FA/2-ME复合物的UV-Vis图谱。

图3为本发明制备的G5.NHAc-FI-FA/2-ME复合物中2-ME在不同pH缓冲液条件下的释放曲线。

图4分别为未处理的(a)、1μL乙醇(b)、10μM的2-ME(c)、10μL PBS(d)、G5.NHAc-FI-FA(e)和G5.NHAc-FI-FA/2-ME(f)处理过的KB细胞的相差显微镜照片，培养时间为48h。图5分别为用PBS处理过的KB-HFAR细胞(a)、G5.NHAc-FI-FA/2-ME complexes([2-ME]＝10mM)处理过的KB-HFAR细胞(b)和KB-LFAR细胞(c)的荧光显微镜照片，培养时间为1h。

图6为MTT法测试的KB-HFAR细胞和KB-LFAR细胞经G5.NHAc-FI-FA/2-ME复合物处理后的细胞活力，复合物与细胞作用1h后，清洗细胞，更换不含复合物的培养液，培养48h后测定细胞活力。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

将第五代聚酰胺-胺树状大分子(52.0mg，0.002mmol)溶解于5mLDMSO溶液中，在搅拌的情况下，逐滴加入5mL含FI(3.9mg，0.01mmol)的DMSO溶液。反应24h，将反应溶液放入透析袋(MWCO＝10,000)中，在PBS缓冲液中透析3次，再在去离子水中透析3次，最后将透析袋中的溶液冻干即得G5.NH₂-FI.

将FA(2.55mg，0.00577mmol)溶解在5mL的DMSO溶液当中，然后加入EDC(22.1mg，0.1154mmol)，在室温条件下搅拌反应3h后，将混合溶液逐滴地加入到5mL含G5.NH₂-FI(35.0mg，0.00115mmol)的DMSO溶液当中，搅拌反应3天，将反应溶液放入透析袋(MWCO＝10,000)中，在PBS缓冲液中透析3次，再在去离子水中透析3次，最后将透析袋中的溶液冻干即得G5.NH₂-FI-FA。

将G5.NH₂-FI-FA(26.3mg，0.00087mmol)溶解在5mL DMSO溶液当中，加入三乙胺(52.74mg，0.52128mmol)，然后逐滴地加入5mL含乙酸酐(44.35mg，0.4344mmol)的DMSO溶液中，搅拌反应1天，将反应溶液放入透析袋(MWCO＝10,000)中，在PBS缓冲液中透析3次，再在去离子水中透析3次，最后将透析袋中的溶液冻干即得G5.NHAc-FI-FA。

NMR测试结果表明：以第五代树状大分子为模板，已经成功合成了多功能的树状的分子G5.NHAc-FI-FA，每一个树状大分子表面分别健合了5个FI分子和5个FA分子。

实施例2

将第五代聚酰胺-胺树状大分子(55.0mg)溶解于10mLDMSO溶液中，在搅拌的情况下，逐滴加入10mL含FI(4.2mg)的DMSO溶液。反应24h，将反应溶液放入透析袋(MWCO＝10,000)中，在PBS缓冲液中透析3次，再在去离子水中透析3次，最后将透析袋中的溶液冻干即得G5.NH₂-FI.

将FA(2.9mg)溶解在10mL的DMSO溶液当中，然后加入EDC(25mg)，在室温条件下搅拌反应3h后，将混合溶液逐滴地加入到10mL含G5.NH₂-FI(40.0mg)的DMSO溶液当中，搅拌反应3天，将反应溶液放入透析袋(MWCO＝10,000)中，在PBS缓冲液中透析3次，再在去离子水中透析3次，最后将透析袋中的溶液冻干即得G5.NH₂-FI-FA。

将G5.NH₂-FI-FA(28mg)溶解在10mL DMSO溶液当中，加入三乙胺(56mg)，然后逐滴地加入10mL含乙酸酐(48mg)的DMSO溶液中，搅拌反应1天，将反应溶液放入透析袋(MWCO＝10,000)中，在PBS缓冲液中透析3次，再在去离子水中透析3次，最后将透析袋中的溶液冻干即得G5.NHAc-FI-FA。

NMR测试结果表明：以第五代树状大分子为模板，已经成功合成了多功能的树状的分子G5.NHAc-FI-FA，每一个树状大分子表面分别健合了5个FI分子和5个FA分子。

实施例3

将10mg G5.NHAc-FI-FA溶解在1.5mL水中，取10摩尔当量的2-ME(相对于树状大分子)溶于300μL甲醇中，将上述两种溶液混合搅拌过夜，使甲醇溶液充分蒸发，然后将混合溶液离心(7,000rpm，10min)。将沉淀即未包裹的2-ME药物溶于1mL甲醇溶液，进行HPLC分析，从而确定药物的负载量；上清液收集冻干从而得到G5.NHAc-FI-FA/2-ME复合物。

UV-Vis图谱证明了树状大分子G5.NHAc-FI-FA已经成功地负载了抗癌药物2-ME，即成功地合成了G5.NHAc-FI-FA/2-ME复合物。HPLC结果表明每个G5.NHAc-FI-FA分子中包裹有3.7个2-ME分子。

将上述G5.NHAc-FI-FA/2-ME复合物在37℃、两种不同pH的缓冲液(pH＝5.0，pH＝7.4)下进行缓释，通过高效液相色谱(HPLC)检测释放的药量来研究其对2-ME的缓释效果；其中释放出的2-ME的含量是通过HPLC来检测的，流动相是线性梯度变化的，起始水/乙腈(v/v)为66∶34，终止水/乙腈(v/v)为30∶70。时间为20mins，流速为1mL/min。

将上述G5.NHAc-FI-FA/2-ME复合物与相同浓度的纯药2-甲氧基雌二醇(2-ME)(10μM)分别作用于人类上皮癌细胞(KB细胞)，培养48h后，通过MTT法检测细胞活力来研究G5.NHAc-FI-FA/2-ME复合物对KB细胞的毒性作用；其中2-ME的浓度为5-10μM。

将上述G5.NHAc-FI-FA/2-ME复合物分别作用于高叶酸受体表达的KB细胞(KB-HFAR)与低叶酸受体表达的KB细胞(KB-LFAR)，培养1h，通过荧光显微镜研究G5.NHAc-FI-FA/2-ME复合物对KB-HFAR的靶向性；在G5.NHAc-FI-FA/2-ME复合物与细胞作用1h后，清洗细胞，并更换不含G5.NHAc-FI-FA/2-ME复合物的培养液，继续培养细胞至48h，利用MTT法测定G5.NHAc-FI-FA/2-ME复合物的特异抗癌活性。

所述KB-LFAR细胞是通过将KB-HFAR细胞与FA预培养一天得到的，FA浓度为2.5μM；研究靶向性时，G5.NHAc-FI-FA/2-ME复合物作用于KB-LFAR细胞和KB-HFAR细胞的时间为1h。研究特异抗癌活性时，在G5.NHAc-FI-FA/2-ME复合物与细胞作用1h后，清洗细胞，并更换不含G5.NHAc-FI-FA/2-ME复合物的培养液，继续培养细胞至48h，利用MTT法测定G5.NHAc-FI-FA/2-ME复合物的特异抗癌活性。