基于人胚胎三叉神经利用组织切片染色进行三维重建方法

摘要

本发明公开了一种基于人胚胎三叉神经利用组织切片染色进行三维重建方法。通过选择人胚胎新鲜标本，特别是非疾病死亡的引产胎儿，20周以上的胎龄人胚胎新鲜标本的三叉神经节，根及神经分支，经HE常规染色，利用光境、透射电镜观察，采用计算机TRI for win 95/NT，Version：3.01实现三维重建。本发明通过对人胚胎三叉神经的形态及运动根的走行进行研究，是人类历史上第一次将人胚胎三叉神经的三维立体结构展现出来，既丰富了人类三叉神经形态学研究的内容，同时为临床三叉神经痛的病理生理及治疗提供形态学依据，具有广泛的应用领域。

说明书

技术领域

本发明属于神经解剖技术领域。具体的说，本发明涉及一种基于人胚胎三叉神经利用组织切片染色进行三维重建的技术领域。

背景技术

三叉神经(trigeminal nerve)为粗大的混合性脑神经，含有一般躯体感觉和特殊内脏运动两种纤维。特殊内脏运动纤维起于脑桥中段的三叉神经运动核，其轴突组成三叉神经运动根，脑桥基底部(自脑桥腹侧面)与小脑中脚移行处出脑，位于感觉根的前内侧，最后进入下颌神经，经卵圆孔出颅，随下颌神经分支分布于咀嚼肌等。一般躯体感觉纤维的胞体集中在三叉神经节内，其中中枢突集中构成了粗大的三叉神经感觉根，由脑桥基底部与小脑中脚交界处入脑，止于三叉神经诸感觉核；三叉神经节细胞的周围突组成三叉神经三大分支，即第1支眼神经，第2支上颌神经，第3支为下颌神经。从3大分支不断分支分布于面部皮肤、眼及眶内、口腔、鼻腔、鼻旁窦的粘膜，牙，脑膜等，传导痛、温、触等多种感觉。

三叉神经痛(trigeminal neuralgia，TN)是脑神经痛中最常见的一种，也是周围神经系统疾病中常见的疾病之一。根据资料统计，本病的患病率为182/10万，发病在面部三叉神经一支或几支分布区内，以骤然发生的闪电式剧烈面部疼痛为特征，患者常描述成撕裂样、触电样、闪电样、针刺样、刀割样、或烧灼样剧痛。疼痛以面颊、上颌、下颌或舌部最为明显。由于三叉神经痛确切发病机制及病因尚不清楚，所以临床上缺乏理想的治疗方法，以外科手术治疗常见。目前选择性三叉神经感觉根切断术是外科治疗三叉神经痛较常用的方法之一。但术中有时可损伤运动根，表现为同侧咀嚼肌麻痹，牙齿咬合不紧，有些患者易发生颞下颌关节脱位，还有一些患者可出现张口困难，张口时下颌偏向患侧等。术中需要辨清三叉神经节内感觉支与运动支的关系。因此，三叉神经根形态学方面的研究，尤其是三叉神经运动根在三叉神经节内的走行对三叉神经痛的病因及治疗具有一定的理论及实践意义。

对成人三叉神经根的形态及三叉神经运动根的走行已受到许多国内外学者的关注，并对此进行了一系列的研究。Young等人在研究成人三叉神经运动限时发现运动根内含有一定数量的无髓神经纤维，这些无髓神经纤维在三叉神经根的作用不可知，但有间接证据表明，这些无髓神经纤维有潜在的感觉功能这可能与三叉神经感觉根选择性切断术后感觉残留及痛觉缓解失败有关。Ezure等研究发现三叉神经根内轴突的面积和周长比感觉根的大，轴突分布范围比感觉根广，感觉根中无粗大的a纤维。孙尔玉等利用成人尸头作为标本，运用外科显微镜对三叉神经颅内段做了细致的解剖学研究，讨论了运动根与感觉根的位置关系，认为运动根与感觉根之间存在吻合支。但从发育学的观点来看，至今国内外尚未见人胚胎三叉神经根及运动根走行相关研究报道。

发明内容

针对目前还没有人胚胎三叉神经根及运动根走行相关研究报道。本发明基于人胚胎三叉神经利用组织切片染色实现了三维重建，得到了较好的应用效果。

本发明提供一种基于人胚胎三叉神经利用组织切片染色进行三维重建方法。通过选择人胚胎新鲜标本，特别是非疾病死亡的引产胎儿，20周以上的胎龄人胚胎新鲜标本的三叉神经节，根及神经分支，经HE常规染色，利用光境透射电镜观察，采用计算机实现三维重建。

本发明通过对标本的三叉神经根、节及分支HE常规染色，利用光镜、电镜观察，三维重建，方法通过对人胚胎三叉神经的形态及运动根的走行进行的研究，是人类历史上第一次将人胚胎三叉神经的三维立体结构展现出来，既丰富了人类三叉神经形态学研究的内容，同时为临床三叉神经痛的病理生理及治疗提供形态学依据。

本发明具体提供一种基于人胚胎三叉神经利用组织切片染色进行三维重建方法步骤如下：

1.标本固定

在获取标本后1-4h内，先用生理盐水心脏冲洗后，再以10％福尔马林溶液1000-1500mL经主动脉灌注固定，干燥处避光保存。

2.肉眼观察

待标本完全固定后，取胎头，打开颅盖骨，暴露端脑，摘取一侧大脑半球及间脑，在外科显微镜下去掉部分中脑，确定左侧三叉神经根、节及三大分支进行巨细解剖与观察，进行实物拍照。

3.电镜观察

将获得的标本在外科显微镜下完整取出右侧三叉神经根、三叉神经节及三大分支，修整组织后，肉眼能区分三叉神经运动根，剥离三叉神经运动根；将取好的组织分别标记好置于装有2.5％戊二醛溶液的容器中，固定时间为72小时；将固定标记好的组织取出，移入1/15M磷酸缓冲液在PH7.4中漂洗3次，每次各15分钟；将漂洗后组织入1％饿酸固定液中后固定1小时后，按如上步骤漂洗后进入脱水；在进入50％酒精、70％酒精、80％酒精、90％酒精、100％酒精各脱水15分钟后，后置于100％酒精中脱水；以v/v计，采用丙酮和环氧树脂按照1∶1液中浸透1小时，丙酮和环氧树脂1∶3液中浸透3小时，纯环氧树脂中浸透12小时后；采用纯环氧树脂包埋，37℃12小时，45℃12小时，60℃24小时；采用超薄切片机切片，选其中1-2张切片，甲苯胺蓝染色后在光学显微镜下观察，根据甲苯胺蓝染色结果提供的依据，选择神经元较多的部位再进行超薄切片；选用醋酸双氧铀及柠檬酸铅双染色方法对切片进行染色；将切片置于透射电镜观察，采集图片。

4.HE染色

将每个标本均以滤纸包裹，外以细纱布包裹水中浸泡12小时后，入75％酒精脱水4小时，85％酒精脱水4小时，90％酒精过夜，后置于95％酒精脱水4小时，100％酒精脱水4小时后再用100％酒精过夜；入二甲苯I之中30分钟，入二甲苯II中至透明为止；入电烤炉液体蜡I中透蜡1小时，液体蜡II中透蜡30分钟；取出标本放入包埋框中蜡油待其固定后放入自来水中冷却，待蜡块成形后，将蜡块修好标记，置于冰箱中冷藏，切片时使用；选用切片机，按冠状切面作连续切片，切片厚度为6μm；将裱好的切片置于染色架上，放入60℃烤箱中30分钟。取出后入二甲苯I、II、III液中各2分钟，入100％酒精I，II、95％酒精、85％酒精各1-2分钟，分别用自来水、蒸馏水冲洗片刻。苏大素浸染5分钟，自来水冲洗片刻入1％盐酸酒精分化3-5秒，自来水冲洗片刻。氨水片刻，自来水冲洗片刻，入0.5％伊红溶液浸染5分钟，水洗片刻后入75％酒精、85％酒精、95％酒精I，II、100％酒精I，II各1-2分钟脱水，再入二甲苯I、II中透明各1-2分钟。中性树胶封固切片标本，再将每张切片标记排序；将切片置于光镜下观察，采集图片。

5.三维重建

利用HE染色结果，在光镜下于40倍视野采集图像，用自动成像技术组成每张切片的原图；采用类似Adobe photoshop工具给每一张切片的细胞、神经根、各分支及运动根等用不同的颜色画出边界线；将采用类似Adobe photoshop工具画好的每一张切片按从下往上的顺序排序，将每一张切片按照细胞、三大分支、运动根的位置对好，然后在组织旁边画一个三角，这个三角从第一张到最后一张切片的位置必须一致，它作为一个标准轴，用psd形式保存；将psd形式保存的每一张图像大小2446×2669，像素72，536KB，改为562×629，像素100，52.2KB，修改后的图像用jpg形式保存。将jpg形式保存的每张图像按顺序输入计算机，选择重建的切片厚度。

本发明所用组织材料采用冠状切面连续切片，层厚6μm，由于间隔三张选取图片，因此实际重建的层厚为18μm，然后用TRI for Win 95/NT Version：3.10软件完成三维立体图像重建。

通过本发明重建的三维立体图像能清楚地显示出人胚胎三叉神经根、节及其分支的分布，将人胚胎三叉神经根、节及分支HE染色的切片结构重建出来，更好地显示出了三者之间的对应关系。从三维重建的图片中可以看出人胚胎的三叉神经运动根与感觉根伴行，位于感觉根的内下方，并逐渐向三叉神经半月节中下面1/3处深面直行，之后并行于下颌神经的前内缘深面，略被掩盖。三叉神经节细胞突起组成的三大分支由内上向外下分别为眼神经、上颌神经及下颌神经。

通过实施本发明具体的内容，可以达到以下有益效果。

1、本发明重建的三维立体图像能清楚地显示出人胚胎三叉神经根、节及其分支的分布，三叉神经运动根集中通过三叉神经感觉根的内侧、神经节下1/3处，从根到下颌神经是一个连续的结构，最后并入下颌神经的内下方。从而表明本发明利用组织切片的标本进行三维重建的方法是具体可行的。

2、传统的三维重建有不同种方法，非计算机专业的相关人员很难独立完成三维重建，本发明方法简单实用，一般实验员，非专业计算机工作人员能完成复杂的组织切片三维重建，而且方法具体可行，可以独立完成。

3、本发明通过三维立体图像重建，能清楚的看到三叉神经根，节及分支三维立体结构，尤其是从标本的背侧也能看到三叉神经运动纤维在三叉神经根，节及下颌神经之内的位置走行，这对三叉神经痛的外科治疗，提供了有关解剖、组织学等方面的形态学依据，并对该外科手术具有一定的理论和实践意义。

附图说明

图1显示为人胚胎三叉神经根、节及三个分支的位置图，图中，V为三叉神经根；V1为眼神经；V2为上颌神经；V3为下颌神经；GN为三叉神经节；II为视神经；III为动眼神经；P为脑桥；C为小脑；M为中脑；T为端脑。

图2显示为三叉神经根、节及分支在光镜下的形态图，在HE染色4×10倍条件下，图中，Vr为三叉神经根；V1为眼神经；V2为上颌神经；V3为下颌神经；GN为三叉神经节；mr为运动神经根。

具体实施方式

以下将结合附图对本发明的结构组成及其工作模式与原理作进一步说明，但是，本发明并不限于下述的实施例。另外，在下述的说明中，如无特别说明，％皆指V/V体积百分比。

本发明中设备和材料有：

收集非疾病终止妊娠而引产的健康胎儿，性别不限，胎龄为20周以上，胎龄根据孕妇末次月经，由B超检查结合标本的体检获得。本发明所有标本均来自乌鲁木齐市区医院，胎儿引产后即刻取送实验室，先用生理盐水冲洗后，再以10％福尔马林溶液1000-1500mL经主动脉灌注固定。为了避免标本死亡时间过长，组织变性，影响试验结果，本发明将标本引产后至灌流固定的时间控制在4小时之内。

外科显微镜：新疆医科大学第一附属医院提供、显微手术器械：曹工牌，山东淄博善航医学工程研究所制造、常规手术器械：新疆医科大学人体解剖教研室提供、荧光显微镜：厦门Motic BA400型、尸体解剖台：新疆医科大学人体解剖教研室提供、数码照相机：日本Nikon 4500数码照相机(微距2cm)、石蜡切片机：德国莱卡2135型、透射电镜：日本JEM-1230型、超薄切片机：瑞典LKB-2188型、全自动显微镜：厦门Motic BA600型、电冰箱：青岛海尔、电子分析天平：梅特勒-托利多仪器有限公司、MLS-3750型实验室用高压灭菌器：三洋电机国际贸易有限公司、三维重建计算机：日本医科大学第二解剖学教室

本发明中涉及到的试剂及工作液的配制：

化学试剂：Dil：FMP FM003282，日本医科大学提供、PBS粉剂：福州迈新生物技术开发有限公司、甲醛溶液分析纯：西安化学试剂厂、无水乙醇：西安化学试剂厂、二甲苯、伊红、苏木素、氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾等为国产分析纯、蒸馏水、2.5％戊二醛、10％福尔马林溶液等为新疆医科大学人体解剖教研室及电镜室提供。

本发明中选用的所有试剂和仪器都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。

实施例一：基于人胚胎三叉神经利用组织切片染色进行三维重建方法

1.标本固定

在获取标本后1-4h内，用钳子夹住胎儿脐带，打开胸前壁，暴露心包，切开心包，充分暴露心脏，将7号输液针头插入升主动脉根部，用剪刀在右心房处剪一小切口，用50ml注射器连续推注0.9％生理盐水500ml行心脏冲洗后，再推注10％福尔马林溶液1500ml，让固定液沿体循环途径行灌流固定，观察标本的固定效果，见有固定液从标本的口、鼻等处流出，标本腹部膨隆，肢体变硬示标本固定效果好，将灌注好的标本继续浸泡于新鲜配置的10％福尔马林溶液中进行后固定，干燥处避光保存。

2.肉眼观察

待4例标本完全固定后，取胎头，打开颅盖骨，暴露端脑，摘取一侧大脑半球及间脑，在外科显微镜下去掉部分中脑，确定左侧三叉神经根、节及三大分支进行巨细解剖与观察，进行实物拍照，参见附图1、2。

3.电镜观察

(1)取材：上述4例标本在外科显微镜下完整取出右侧三叉神经根、三叉神经节及三大分支，修整组织后，肉眼能区分三叉神经运动根，剥离三叉神经运动根，走行于三叉神经节段的运动神经根。

(2)前固定：将取好的组织分别标记好置于装有2.5％戊二醛溶液的容器中，固定时间为72小时。

(3)漂洗：将固定标记好的组织取出，移入1/15M磷酸缓冲液在PH7.4中漂洗3次，每次各15分钟。

(4)后固定：将漂洗后组织入1％饿酸固定液中后固定1小时。

(5)漂洗：操作步骤同(3)。

(6)脱水：入50％酒精、70％酒精、80％酒精、90％酒精、100％酒精I各脱水15分钟，后置于100％酒精II中。

(7)浸透：按照体积比，丙酮和环氧树脂1∶1液中浸透1小时，丙酮和环氧树脂1∶3液中浸透3小时，纯环氧树脂中浸透12小时。

(8)包埋：纯环氧树脂包埋，37℃12小时，45℃12小时，60℃24小时。

(9)切片：用瑞典LKB-2188型超薄切片机切片，选其中1-2张切片，甲苯胺蓝染色后在光学显微镜下观察，根据甲苯胺蓝染色结果提供的依据，选择神经元较多的部位再进行超薄切片。

(10)染色：选用醋酸双氧铀及柠檬酸铅双染色方法对切片进行染色。

(11)观察：将切片置于日本JEM-1230型透射电镜观察，采集图片。

4.HE染色三维重建

(1)取材：4例标本，待完全固定后，取胎头，PBS漂洗干净后，沿颧弓上缘1cm平面环形去掉头皮，取下颅盖，再沿同一平面剪去颅盖部的硬脑膜，平上丘上缘横断脑干，切除双侧端脑和间脑，小心的割除小脑幕和三叉神经节上方的硬脑膜，将连同脑干的颅底，三叉神经根、节、支的位置没有任何变动，置于外科显微镜下，2例标本确定左侧三叉神经根、三叉神经节及三大分支眼神经、上颌神经、下颌神经的位置，另外2例标本确定右侧三叉神经根、三叉神经节及三大分支眼神经、上颌神经、下颌神经的位置，分别在眶上裂处切断眼神经、圆孔处切断上颌神经、卵圆孔处切断下颌神经、脑桥基底部切断三叉神经根，小心完整剥离三叉神经根、三叉神经节及三大分支，修整组织后，放置于新鲜配置的10％福尔马林溶液中。

(2)包埋：每个标本均以滤纸包裹，外以细纱布包裹水中浸泡12小时后，入75％酒精脱水4小时，85％酒精脱水4小时，90％酒精过夜，后置于95％酒精脱水4小时，100％酒精I脱水4小时，100％酒精II过夜；入二甲苯I之中30分钟，入二甲苯II中至透明为止；入电烤炉液体蜡I中透蜡1小时，液体蜡II中透蜡30分钟；取出标本放入包埋框中蜡油待其固定后放入自来水中冷却，待蜡块成形后，将蜡块修好标记，置于冰箱中冷藏，切片时使用。

(3)切片：用切片中心德国莱卡2135型切片机，按冠状切面作连续切片，切片厚度为6μm。4例标本中每例三叉神经根、神经节标本均有130张左右的连续切片。

(4)染色：将裱好的切片置于染色架上，放入60℃烤箱中30分钟。取出后入二甲苯I、II、III液中各2分钟，入100％酒精I，II、95％酒精、85％酒精各1-2分钟，分别用自来水、蒸馏水冲洗片刻。苏木素浸染5分钟，自来水冲洗片刻入1％盐酸酒精分化3-5秒，自来水冲洗片刻。氨水片刻，自来水冲洗片刻，入0.5％伊红溶液浸染5分钟，水洗片刻后入75％酒精、85％酒精、95％酒精I，II、100％酒精I，II各1-2分钟脱水，再入二甲苯I、II中透明各1-2分钟。中性树胶封固切片标本，再将每张切片标记排序。

(5)观察：将切片置于光镜下观察，采集图片。

5.三维重建

(1)HE染色结果，在光镜下于40倍视野采集图像，用自动成像技术组成每张切片的原图，共136张。

(2)用Adobe photoshop 7.0给每一张切片的细胞、神经根、各分支及运动根等用不同的颜色画出边界线。

(3)用Adobe photoshop 7.0画好的每一张切片按从下往上的顺序排序，将每一张切片的位置对好，如细胞、三大分支、运动根等，然后在组织旁边画一个三角，这个三角从第一张到最后一张切片的位置必须一致，它作为一个标准轴，用psd形式保存。

(4)每一张图片原大小2446×2669，像素72，536KB，改为562×629，像素100，52.2KB，必须用jpg形式保存。

(5)用TRI for Win 95/NT Version：3.10完成三维立体图像。

实施例二：标本固定

在获取标本后1-4h内，用钳子夹住胎儿脐带，打开胸前壁，暴露心包，切开心包，充分暴露心脏，将7号输液针头插入升主动脉根部，用剪刀在右心房处剪一小切口，用50ml注射器连续推注0.9％生理盐水500ml行心脏冲洗后，再推注10％福尔马林溶液1500ml，让固定液沿体循环途径行灌流固定，观察标本的固定效果，见有固定液从标本的口、鼻等处流出，标本腹部膨隆，肢体变硬示标本固定效果好，将灌注好的标本继续浸泡于新鲜配置的10％福尔马林溶液中进行后固定，干燥处避光保存。

实施例三：光镜、透射电镜观察

(1)取材：上述实施例标本在外科显微镜下完整取出右侧三叉神经根、三叉神经节及三大分支，修整组织后，肉眼能区分三叉神经运动根，剥离三叉神经运动根，走行于三叉神经节段的运动神经根，参见附图1、2。

(2)前固定：将取好的组织分别标记好置于装有2.5％戊二醛溶液的容器中，固定时间为72小时。

(3)漂洗：将固定标记好的组织取出，移入1/15M磷酸缓冲液在PH7.4中漂洗3次，每次各15分钟。

(4)后固定：将漂洗后组织入1％饿酸固定液中后固定1小时。

(5)漂洗：操作步骤同(3)。

(6)脱水：入50％酒精、70％酒精、80％酒精、90％酒精、100％酒精I各脱水15分钟，后置于100％酒精II中。

(7)浸透：按照体积比，丙酮和环氧树脂1∶1液中浸透1小时，丙酮和环氧树脂1∶3液中浸透3小时，纯环氧树脂中浸透12小时。

(8)包埋：纯环氧树脂包埋，37℃12小时，45℃12小时，60℃24小时。

(9)切片：用瑞典LKB-2188型超薄切片机切片，选其中1-2张切片，甲苯胺蓝染色后在光学显微镜下观察，根据甲苯胺蓝染色结果提供的依据，选择神经元较多的部位再进行超薄切片。

(10)染色：选用醋酸双氧铀及柠檬酸铅双染色方法对切片进行染色。

(11)观察：将切片置于日本JEM-1230型透射电镜观察，采集图片。

实施例四：HE染色

(1)取材：4例标本，待完全固定后，取胎头，PBS漂洗干净后，沿颧弓上缘1cm平面环形去掉头皮，取下颅盖，再沿同一平面剪去颅盖部的硬脑膜，平上丘上缘横断脑干，切除双侧端脑和间脑，小心的割除小脑幕和三叉神经节上方的硬脑膜，将连同脑干的颅底，三叉神经根、节、支的位置没有任何变动，置于外科显微镜下，2例标本确定左侧三叉神经根、三叉神经节及三大分支眼神经、上颌神经、下颌神经的位置，另外2例标本确定右侧三叉神经根、三叉神经节及三大分支眼神经、上颌神经、下颌神经的位置，分别在眶上裂处切断眼神经、圆孔处切断上颌神经、卵圆孔处切断下颌神经、脑桥基底部切断三叉神经根，小心完整剥离三叉神经根、三叉神经节及三大分支，修整组织后，放置于新鲜配置的10％福尔马林溶液中。

(2)包埋：每个标本均以滤纸包裹，外以细纱布包裹水中浸泡12小时后，入75％酒精脱水4小时，85％酒精脱水4小时，90％酒精过夜，后置于95％酒精脱水4小时，100％酒精I脱水4小时，100％酒精II过夜；入二甲苯I之中30分钟，入二甲苯II中至透明为止；入电烤炉液体蜡I中透蜡1小时，液体蜡II中透蜡30分钟；取出标本放入包埋框中蜡油待其固定后放入自来水中冷却，待蜡块成形后，将蜡块修好标记，置于冰箱中冷藏，切片时使用。

(3)切片：用切片中心德国莱卡2135型切片机，按冠状切面作连续切片，切片厚度为6μm。4例标本中每例三叉神经根、神经节标本均有130张左右的连续切片。

(4)染色：将裱好的切片置于染色架上，放入60℃烤箱中30分钟。取出后入二甲苯I、II、III液中各2分钟，入100％酒精I、100％酒精II、95％酒精、85％酒精各1-2分钟，分别用自来水、蒸馏水冲洗片刻。苏木素浸染5分钟，自来水冲洗片刻入1％盐酸酒精分化3-5秒，自来水冲洗片刻。氨水片刻，自来水冲洗片刻，入0.5％伊红溶液浸染5分钟，水洗片刻后入75％酒精、85％酒精、95％酒精I，95％酒精II、100％酒精I，II各1-2分钟脱水，再入二甲苯I、II中透明各1-2分钟。中性树胶封固切片标本，再将每张切片标记排序。

(5)观察：将切片置于光镜下观察，采集图片。

实施例五：三维重建

(1)HE染色结果，在光镜下于40倍视野采集图像，用自动成像技术组成每张切片的原图，共136张。

(2)用Adobe photoshop 7.0给每一张切片的细胞、神经根、各分支及运动根等用不同的颜色画处边界线。

(3)用Adobe photoshop 7.0画好的每一张切片按从下往上的顺序排序，将每一张切片的位置对好，如细胞、三大分支、运动根等，然后在组织旁边画一个三角，这个三角从第一张到最后一张切片的位置必须一致，它作为一个标准轴，用psd形式保存。

(4)每一张图片原大小2446×2669，像素72，536KB，改为562×629，像素100，52.2KB，必须用jpg形式保存。

(5)用TRI for Win 95/NT Version：3.10完成三维立体图像。