一种利用多重PCR检测鸭粪中三种原虫的方法

摘要

本发明涉及PCR检测领域，具体涉及一种利用多重PCR检测鸭粪中三种原虫的方法，其中所述原虫为贝氏隐孢子虫、环孢子虫和菲莱氏温扬球虫。本发明检测方法是根据鸭环孢子虫ITS-1基因，菲莱氏温扬球虫18S rRNA基因和贝氏隐孢子虫ITS-1+片段，分别设计出3对特异性引物，通过多重PCR反应可以快速准确地检测鸭粪中的贝氏隐孢子虫、环孢子虫和菲莱氏温扬球虫卵囊，对鸭的隐孢子虫病、环孢子虫病和球虫病作出鉴别诊断。本发明检测方法可以同时检测三种原虫，敏感性、特异性好，比常规PCR更加快捷经济，可用于鸭肠道原虫病的鉴别诊断和分子流行病学调查或水源性隐孢子病和环孢子虫病爆发的风险评估。

说明书

技术领域

本发明涉及PCR检测领域，具体涉及一种利用多重PCR检测鸭粪中三种原虫的方法。

背景技术

鸭肠道中可蕴藏和感染多种寄生性原虫，这些原虫随粪便排出体外，可以在鸭群中相互传播，甚至有的还可以感染人类，这不仅对其自身的生存和养禽业的发展造成严重的危害，还可以对人类健康构成威胁。其中，菲莱氏温扬球虫是引起鸭球虫病的主要病原体，贝氏隐孢子虫和环孢子虫可导致人兽共患的寄生虫病，它们对养殖业及人类健康构成了严重威胁。

由于鸭肠道寄生虫在临床上都能引起共同的消化道症状，又常呈混合感染，通过临床诊断难以区别。常规的病原诊断方法是病原分离，然后镜检，此法费时费力、敏感性和特异性都较差，且对检测人员专业知识的要求较高，因此，建立特异、敏感的检测方法十分必要。

聚合酶链式反应(PCR)是以两段寡核苷酸为引物，由DNA聚合酶催化扩增位于两段引物之间的DNA片段的一项分子生物学技术。该技术自1983年建立以来，因其高灵敏度、高效率、高特异性的特点，已成为当前生命科学与相关领域中的关键技术。PCR技术广泛应用的同时，又推动自身发展了一系列相关技术，如巢式PCR、实时定量PCR、差异显示PCR、免疫PCR、多重PCR等。

常规PCR技术一次PCR反应只能检测或诊断一种病原体，当临床上出现多种病原体混合感染时，必须进行多次的PCR反应才能确诊。Chamberlain等(1988)最先提出“多重PCR(Multiplex PCR)”这一概念。它是在普通PCR的基础上加以改进，于一个PCR反应体系中加入多对特异性引物，针对多个DNA模板或同一模板的不同区域扩增多个目的片段的PCR技术。由于多重PCR同时扩增多个目的基因，该技术用于病原检测或鉴别诊断时，可一次同时检测几种病原体，具有高特异性、高效率、低成本的优势，尤其可节省珍贵的试验样品，具有很高的临床应用价值。

目前，国内外已有不少关于建立多重PCR方法检测人或畜禽寄生虫病的报道。Verweij等(2004)利用多重Real-time PCR技术检测粪便中的阿米巴、贾第虫和隐孢子虫。Haque等(2007)针对阿米巴、贾第虫和隐孢子虫分别设计一对引物和一个探针，利用多重Real-time PCR技术检测人的粪便，对比金标准诊断方法，多重Real-time PCR技术的敏感性为89％，特异性为99％。Eligio-Garcia等(2008)利用多重PCR检测贾第虫的多个基因型。Hove等(2009)利用多重Real-time PCR技术检测人粪便中的阿米巴、贾第虫、隐孢子虫和类圆线虫，结果显示利用该方法可快速诊断腹泻病人是否感染寄生虫及其所感染的寄生虫种类。但迄今尚无一种多重PCR方法对鸭肠道原虫的混合感染进行检测或诊断。与常规PCR相比，多重PCR不但保持了较高的特异性和敏感性，而且较之更为快捷经济；同时在检测未知病原混合感染上具有无可比拟的优势。如今多重PCR已经成为临床疾病实验室诊断或排查的重要手段，它与传统的经典方法相结合，为疾病的快速诊断展示了广阔的应用前景。因此，鸭三种原虫多重PCR检测方法的建立已成为人们多年来盼望实现的目标。

发明内容

本发明的目的在于根据现有PCR检测畜禽寄生虫病中存在的一次PCR只能检测一种寄生虫的问题，提供一种利用多重PCR技术，同时检测鸭粪中三种原虫的方法。

本发明目的通过以下技术方案予以实现：

一种利用多重PCR检测鸭粪中的贝氏隐孢子虫、环孢子虫和菲莱氏温扬球虫的方法，是根据环孢子虫ITS-1基因，菲莱氏温扬球虫18S rRNA基因和贝氏隐孢子虫ITS-1+片段，分别设计出3对特异性引物，第一对引物的名称为CD1和CD2，第二对引物的名称为WF1和WF2，第三对引物的名称为CB1和CB2，引物序列如SEQ ID NO：1～6所示，通过多重PCR反应可以快速准确地检测鸭粪中的贝氏隐孢子虫、环孢子虫和菲莱氏温扬球虫卵囊，对鸭的隐孢子虫病、环孢子虫病和球虫病作出鉴别诊断。

根据鸭源环孢子虫ITS-1(374bp，如SEQ ID NO：7所示)、菲莱氏温扬球虫18S rRNA(422bp，如SEQ ID NO：8所示)和贝氏隐孢子虫ITS-1+(694bp)序列设计多重PCR引物。

本发明方法包括如下步骤：

(1)采集待检粪样，对样本进行预处理，提取样本中的虫体DNA；

(2)根据环孢子虫ITS-1基因，菲莱氏温扬球虫18S rRNA基因和贝氏隐孢子虫ITS-1+片段，分别设计出3对特异性引物，引物序列如SEQ ID NO：1～6所示；

(3)利用上述引物和提取到的虫体DNA进行多重PCR反应；

(4)若在与阳性对照同一位置出现目的条带，则对应的样本为鸭隐孢子虫、环孢子虫和球虫阳性。

根据多重PCR引物确立了鸭三种原虫多重PCR的反应体系和反应条件：

多重PCR反应的体系为：

10×PCR缓冲液                               2.5μL

dNTPs(2.5mmol/L)                            2.5μL

Mg²⁺(25mmol/L)                              2.0μL

Ex-Taq酶(5U/μL)                            0.2μL

环孢子虫ITS-1引物(25nmol/L)                 各1.6μL

菲莱氏温扬球虫18S rRNA引物(25nmol/L)        各1.8μL

贝氏隐孢子虫ITS-1+引物(25nmol/L)            各1.0μL

3种原虫的DNA模板                            各2.0μL

ddH₂O                                       加至25.0μL。

多重PCR反应的条件为：预变性94℃，5min；变性94℃，30s；退火47.6℃，40s；延伸72℃，1min；终延伸72℃，10min；其中，变性、退火和延伸为35个循环。

作为一种最优选方案，本发明利用多重PCR检测鸭粪中三种原虫的方法包括如下步骤：

(1)样本的预处理：取样本10g，用PBS-0.1％Tween稀释到20mL，旋涡振荡，用100目尼龙筛过滤，滤液2000r/min离心10min，反复用PBS液洗涤三次，离心，取沉淀备用；

(2)样本DNA的提取；

(3)多重PCR扩增：扩增体系如下：

10×PCR缓冲液                            2.5μL

dNTPs(2.5mmol/L)                            2.5μL

Mg²⁺(25mmol/L)                              2.0μL

Ex-Taq酶(5U/μL)                            0.2μL

环孢子虫ITS-1引物(25nmol/L)                 各1.6μL

菲莱氏温扬球虫18S rRNA引物(25nmol/L)        各1.8μL

贝氏隐孢子虫ITS-1+引物(25nmol/L)            各1.0μL

3种原虫的DNA模板                            各2.0μL

ddH₂O                                       加至25.0μL；

扩增条件为预变性94℃，5min；变性94℃，30s；退火47.6℃，40s；延伸72℃，1min；终延伸72℃，10min；其中，变性、退火和延伸为35个循环；

(4)PCR产物观察：取扩增产物加样于琼脂糖凝胶上，电泳后，紫外灯下观察到一条与阳性对照同一位置出现的288bp、402bp和694bp的片段，即为鸭隐孢子虫、环孢子虫和球虫阳性。

本发明建立的多重PCR方法，可用于鸭肠道原虫病的鉴别诊断和分子流行病学调查或水源性隐孢子病和环孢子虫病爆发的风险评估。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明根据鸭环孢子虫ITS-1基因，菲莱氏温扬球虫18S rRNA基因和贝氏隐孢子虫ITS-1+片段，分别设计出3对特异性引物，通过多重PCR反应可以快速准确地检测鸭粪中的贝氏隐孢子虫、环孢子虫和菲莱氏温扬球虫卵囊，可以同时检测三种原虫，敏感性、特异性好，比常规PCR更加快捷经济，具有广阔的应用前景。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。

实验例1单项PCR特异性试验

将抽提的三种原虫的基因组DNA作为单项PCR的扩增模板，同时设多种原虫的DNA对照组。鸭环孢子虫特异PCR扩增时的DNA对照组为：柔嫩艾美耳球虫、贝氏隐孢子虫和菲莱氏温扬球虫，菲莱氏温扬球虫特异PCR扩增时的DNA对照组为：柔嫩艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫和贝氏隐孢子虫，鸭贝氏隐孢子虫特异PCR扩增时的DNA对照组为：微小隐孢子虫、菲莱氏温扬球虫和鸭环孢子虫。以设计的种特异性引物进行PCR扩增，其反应体系及PCR扩增条件如下。

(1)鸭环孢子虫特异PCR

反应体系：

10×buffer                     2.5μL

MgCl₂(25mmol/L)                2.0μL

dNTP(2mmol/L)                  2.0μL

环孢子虫ITS-1引物(25nmol/L)    各0.5μL

DNA模版                        2.0μL

EX-Taq酶(5U/μL)               0.2μL

ddH₂O                          15.3μL

                               25μL

PCR扩增条件：

94℃预变性    5min

72℃终延伸    10min

(2)菲莱氏温扬球虫特异PCR

反应体系：

10×buffer                                  2.5μL

MgCl₂(25mmol/L)                             2.0μL

dNTP(2mmol/L)                               2.0μL

菲莱氏温扬球虫18S rRNA引物(25nmol/L)        各0.5μL

DNA模版                                     2.0μL

EX-Taq酶(5U/μL)                            0.2μL

ddH₂O                                       15.3μL

                                            25μL

PCR扩增条件：

94℃预变性    5min

72℃终延伸    10min

(3)贝氏隐孢子虫特异PCR

反应体系：

10×buffer                              2.5μL

MgCl₂(25mmol/L)                         2.0μL

dNTP(2mmol/L)                           2.0μL

贝氏隐孢子虫ITS-1+引物(25nmol/L)        各0.5μL

DNA模版                                 2.0μL

EX-Taq酶(5U/μL)                        0.2μL

ddH₂O                                   15.3μL

                                        25μL

PCR扩增条件：

94℃预变性    5min

72℃终延伸    10min

通过上述单项PCR特异性试验，三种原虫的基因组DNA均能扩增出相应的目的片段，而对照组均无扩增产物出现。

实验例2三对引物浓度的初探试验

在单项特异PCR反应的基础上，将三种原虫的DNA模板混合，运用3对特异性引物，建立多重PCR检测方法，研究其最佳反应条件。为了解3对引物同时扩增其目的基因时引物内部间的相互影响，预先将引物的最终浓度都定为1μM，按如下反应体系及反应条件同时进行扩增。

(1)多重PCR初探试验反应体系

混合液成分                    体积(单位：μL)

10×PCR Buffer                    2.5

dNTPs(2.5mM)                      2.0

Mg²⁺(25mM)                        2.0

Ex-Taq酶(5U/μL)                  0.2

6条原虫引物(25nmol/L)             各1.0

3种DNA模板                        各2.0

ddH₂O                             加至25.0

(2)多重PCR初探试验反应条件

结果表明3个目的片段均能同时被扩增，无非特异性条带产生；其中引物CB1/CB2扩增的效果较好，CD1/CD2和WF1/WF2扩增效果相对较差，两者扩增效率偏低。

实验例3多重PCR最佳反应条件的确定

引物浓度的优化：

根据3对引物浓度初探试验的结果，在反应体系中，保持引物CB1/CB2浓度不变，分别调整另外2对引物浓度，将其加入量逐渐调高为：1.2μM、1.4μM、1.6μM、1.8μM、2.0μM，进行多重PCR扩增。结果表明：当引物CD1/CD2浓度为1.6μM时，其扩增效果最好；但引物WF1/WF2的扩增效果稍差，需要对引物WF1/WF2浓度进行优化。固定引物CB1/CB2和CD1/CD2浓度为1.0μM和1.6μM不变，渐次提高引物WF1/WF2的浓度，对多重PCR的WF1/WF2引物浓度进行优化。结果表明：当引物WF1/WF2的浓度调高到1.8μM时，其扩增效果明显提高。因此，多重PCR检测体系中3对引物的最佳浓度：CB1/CB2为1.0μM，WF1/WF2为1.8μM，CD1/CD2为1.6μM。

退火温度的优化：

由于3对引物设计时，其适合退火温度均为48℃左右，因此，运用优化后的引物浓度，在温度梯度PCR仪中设置温度为T＝47℃，G＝10℃，选择温度为42.9℃、44.0℃、45.2℃、46.4℃、47.6℃、48.8℃、50.0℃、51.1℃、51.8℃，进行多重PCR扩增。结果表明当多重PCR的退火温度为45.2～48.8℃时，3对引物的扩增效果均较好。综合考虑，将其最适退火温度定为47.6℃。

Mg²⁺浓度的优化：

根据优化后的引物浓度和退火温度，选择Mg²⁺浓度为1.5mM、2.0mM、2.5mM、3.0mM、3.5mM、4.0mM、4.5mM、5.0mM进行多重PCR扩增，以确定Mg²⁺浓度的最佳反应浓度。结果表明：Mg²⁺浓度在2.0mM以上时，多重PCR扩增效果最好，最佳Mg²⁺浓度定为2.0mM，即在25μL反应体系中，加入2.0μL的Mg²⁺(25mM)。

dNTPs浓度的优化：

根据优化后的引物浓度、退火温度及Mg²⁺浓度，选择dNTPs浓度为0.10mM、0.15mM、0.20mM、0.25mM、0.30mM、0.35mM、0.40mM、0.45mM、0.50mM进行多重PCR扩增。结果表明dNTPs浓度在0.25mM以上时，多重PCR扩增效果最好，因此，反应体系中最佳dNTPs浓度定为0.25mM，即在25μL反应体系中加入2.5μL的dNTPs(2.5mM)。

实验例4多重PCR的特异性、敏感性和重复性试验

特异性试验：

以鸭环孢子虫、菲莱氏温扬球虫、贝氏隐孢子虫的DNA为阳性模板，以柔嫩艾美耳球虫、人隐孢子虫及ddH2O为对照模板，以不同的组合加入到上述多重PCR反应体系中进行PCR扩增，检测其反应特异性。结果显示该多重PCR检测方法对鸭环孢子虫、菲莱氏温扬球虫和贝氏隐孢子虫均能同时扩增出3条特异性目的条带；对其中的任何两种原虫均能同时扩增出两条特异性条带；对其中任何一种原虫均能扩增出一条特异性条带；所有阴性对照包括柔嫩艾美耳球虫、微小隐孢子虫和无菌双蒸水均不能扩增出目的条带。结果表明本研究建立的多重PCR检测方法特异性强。

敏感性试验：

使用核酸定量仪测定粪便基因组提取物中的DNA含量，鸭环孢子虫和贝氏隐孢子虫的DNA浓度为28ng/μL，菲莱氏温扬球虫的DNA浓度为50ng/μL；同时参考“细胞计数板”计算原虫数的方法，1μL卵囊液中的卵囊数＝(16中格内的原虫数/16)×16×10，对三种原虫进行计数的结果为：1μL卵囊液中，分别含有3个环孢子虫、6个菲莱氏温扬球虫和26个贝氏隐孢子虫卵囊。进行敏感性试验时，将核酸作10n倍梯度稀释(n≥1，n∈N)，采用优化的多重PCR反应条件分别对三种原虫DNA模板进行PCR扩增，以检测多重PCR的敏感性。结果显示该多重PCR检测方法对三种原虫的DNA检测量分别为：鸭环孢子虫和贝氏隐孢子虫可达5.6pg，菲莱氏温扬球虫可达100fg。结果表明本研究建立的多重PCR检测方法对这三种原虫的检测量均具有较高的敏感性。

重复性试验：

运用优化的最佳反应条件，对鸭环孢子虫、菲莱氏温扬球虫、贝氏隐孢子虫阳性模板，分14批次进行多重PCR扩增，观察多重PCR检测方法的稳定性。结果显示阳性模板均能扩增出特异性目的条带，表明该多重PCR检测方法稳定，重复性良好，具有临床应用价值。

实施例5

材料与方法

样本的采集

使用采集袋，采集了广东省佛山某鸭场的100份新鲜鸭粪，一份一袋，编号，放入4℃冰箱待检。

方法

(一)常规检测方法

每个粪样取10g，加5倍自来水搅匀，60目铜筛过滤，将滤液以2500r/min离心10min，弃上清，按粪便量的10倍体积加入Sheather’S蔗糖漂浮液，搅匀后以1800r/min离心15min，然后用小铁丝环蘸取漂浮液表层涂片，以10×40倍镜下检查。

(二)多重PCR检测

1.样本的预处理

参照Kostrzynska等(1999)的方法进行。每个粪样用PBS-0.1％Tween稀释到20mL，旋涡振荡，用100目尼龙筛过滤，滤液2000r/min离心10min，反复用PBS液洗涤三次，离心，取沉淀备用。

2.粪样DNA的抽提

按照OMEGA公司粪样DNA提取试剂盒的说明书进行(一些步骤适当给予改进)，步骤如下：

(1)取预处理的样本，放入含有200mg玻璃珠的2mL离心管中，并放在冰上；

(2)加入300μL的SLX Buffer，随后加10μL的Proteinase K solution用力振荡30min以上，直到卵囊壁完全破裂为止；

(3)70℃消化过夜，消化开始过程中漩涡振荡离心管两次；

(4)冰浴2min；

(5)加100μL的Buffer SP2，充分地旋涡振荡离心管30sec；

(6)冰浴5min；

(7)用微量离心机以20,000r/min离心，使粪样沉积成小颗粒；

(8)小心将上清液吸到另一个新的1.5mL离心管，切勿混入管底沉淀物；

(9)加入200μL的HTR Reagent，漩涡振荡10sec，混匀样品；

(10)室温2min；

(11)20,000r/min离心2min，使HTR Reagent沉淀；

(12)将250μL的上清液转移到另一个新的2.0mL离心管；

(13)加入250μL的BL Buffer，再加入250μL的无水乙醇，漩涡振荡10s，充分混匀；

(14)将步骤13中形成的全部样品，转移到配有一个2mL离心管的HiBindDNA过滤柱中。室温下20,000r/min离心1min，弃去液体，留下过滤柱；

(15)将过滤柱转移到另一个新的2mL离心管，加入500μL的HB Buffer清洗过滤柱，20,000r/min离心1min，弃去滤液，留下过滤柱；

(16)将过滤柱放到一个新的离心管，向过滤柱中加入750μL的DNA Wash Buffer，20,000r/min离心1min。倒去液体，再将过滤柱放到空的离心管中；

(17)室温下20,000r/min离心2min以干燥过滤柱中的DNA。

(18)将过滤柱放到一个1.5mL的离心管中，加50μL的Elution Buffer(10mM Tris buffer，pH 8.5)到HiBind matrix上(Elution Buffer提前60～70℃预热)，室温放置2min后，20,000r/min离心1min洗脱DNA。

提取纯化后的卵囊基因组DNA，置于-20℃冰箱备用。

3.多重PCR扩增反应

使用多重PCR最佳反应条件，对每份样品进行PCR扩增。

多重PCR反应体系：

多重PCR反应条件：

4.PCR扩增产物的检测

用0.5×TBE缓冲液配制10g/L的琼脂糖凝胶，加入溴化乙锭至终浓度为0.2μg/mL。电泳时，取5μL PCR产物与1μL电泳上样缓冲液混合均匀，小心加到胶孔中，以DL-2000DNAMaker作对照，120V恒定电压电泳。当加载染料到达一定位置后(约电泳30min)，停止电泳，取凝胶在紫外透射仪下观察并记录结果。若在与阳性对照同一位置出现条带，则对应的样本为阳性。

结果

100份待检样本中，采用多重PCR方法同时检出鸭源环孢子虫和贝氏隐孢子虫的样品有2份；同时检出菲莱氏温扬球虫和贝氏隐孢子虫的样品有5份；单一检出鸭源环孢子虫、菲莱氏温扬球虫和贝氏隐孢子虫的样品分别有16份、12份和21份。多重PCR方法和饱和蔗糖漂浮法对100份鸭粪检测结果的比较见表1，可见本发明建立的多重PCR检测方法较常规检测方法敏感，其对鸭源环孢子虫和贝氏隐孢子虫的检出率更高。

表1.多重PCR检测方法与常规检测方法检测结果的比较

本发明采用饱和蔗糖漂浮法镜检100份样品，同时采用多重PCR检测，结果发现：镜检环孢子虫阳性的样品有17份，而多重PCR检测阳性的样品有18份，其中第66号样品镜检为阴性，PCR检测为阳性；镜检发现菲莱氏温扬球虫的样品有17份，而多重PCR检测到的样品也是17份，两种方法检测的结果完全相符；镜检发现贝氏隐孢子虫的样品有25份，而多重PCR检测阳性的有28份，其中第65、70、97号样品镜检为阴性，而PCR检测为阳性。多重PCR方法对环孢子虫和隐孢子虫的检出率明显提高，这是因为鸭环孢子虫和贝氏隐孢子虫的卵囊较小，缺乏典型的形态学特征，容易漏检；而菲莱氏温扬球虫卵囊较大，形态特征容易辨认。

本发明通过临床镜检和多重PCR检测发现：在单一粪样中鸭环孢子虫与贝氏隐孢子虫、菲莱氏温扬球虫与贝氏隐孢子虫都曾被同时检测到，但鸭环孢子虫与菲莱氏温扬球虫未能同时被检测到。分析其原因可能有两点：一是这两种原虫临床上可以同时感染，由于本次检测的粪样较少，检测结果未能反映出这一客观事实；二是这两种原虫临床上不能同时感染或较少同时感染，由于这两种原虫寄生于鸭肠道的相同部位，根据球虫的占位原理，它们存在竞争性抑制关系，检测结果符合客观事实。

通过临床100份样本多重PCR和饱和蔗糖漂浮法两种方法检测结果的对比，进一步表明本发明建立的多重PCR检测方法具有特异性强、敏感度高、稳定性好的优势。另外，本发明建立的多重PCR检测方法，只需对病原进行简单的浓缩处理，提取DNA后进行PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳分析即可，无需再进行漂浮、染色、孢子化等步骤，与传统方法相比，该检测方法能有效避免因镜检原因造成的漏检；因粪样中菌类等杂质污染造成的错检，其检测结果更为可靠；适用于鸭常见三种重要原虫的临床检测，对于环孢子虫病的鉴别诊断和分子流行病学调查以及人畜隐孢子虫病爆发风险的评估具有重要的应用价值。