多重PCR快速检测乳品中三种病原菌方法研究

摘要

食品安全突发事件频率高是近年来食品安全问题的一个显著特点,在各种食品安全事件中,细菌性食物中毒则是食物中毒的重要因素。目前,国内检测食品中病原菌主要采用传统的培养方法,其操作繁琐,检测时间较长,通常需要3-5天才能完成,且灵敏度较低。因此,急需建立一种快速有效且通量较高的检测方法。
　　 本文选择沙门氏菌的invA基因,金黄色葡萄球菌的nuc基因,小肠结肠炎耶尔森氏菌的ail基因为靶基因,分别设计了三对引物,试验过程中对多重PCR反应体系中退火温度、引物添加量、Mg2+浓度、dNTPs浓度及TaqDNA聚合酶添加量等影响因素进行优化,确定了适宜的多重PCR反应体系和扩增程序。研究了引物的特异性,确定了灵敏度,并探索了从食品中提取三种病原菌模板DNA的方法,检测人工污染样品,确定了检出限,并与传统检测方法进行了比较。
　　 多重PCR反应体系为:10×PCRbuffer2μL,Mg2+(25mmol/L)1μL,dNTPs(25mM)0.8μL,Taq酶(5U/μL)0.3μL,模板各2μL,上下游引物(10μmol/L)各0.8μL,无菌双蒸水补齐至25μL。多重PCR扩增程序为:94℃起始变性5min,94℃变性45s,57℃退火30s,72℃延伸50s,扩增30个循环,最后一个循环于72℃延伸10min。反应产物在2％的琼脂糖凝胶中进行电泳,利用凝胶成像系统观察结果。三对引物分别能扩增出475bp,236bp,127bp的目的条带,并对扩增产物进行了DNA测序,登录Genebank将测序结果进行网上blast比对,从而证实PCR扩增产物确为目的扩增产物。
　　 本研究共检测了18株菌,其中4株沙门氏菌、1株金黄色葡萄球菌、1株小肠结肠炎耶尔森氏菌均为阳性结果;12株其他菌均为阴性结果,试验结果表明引物特异性强。
　　 确定了多重PCR的灵敏度,单独检测沙门氏菌灵敏度为:102CFU/mL、金黄色葡萄球菌灵敏度为:103CFU/mL、小肠结肠炎耶尔森氏菌灵敏度为:103CFU/mL。同时能够检测出三种病原菌的灵敏度沙门氏菌为:103CFU/mL,金黄色葡萄球菌为:103CFU/mL,小肠结肠炎耶尔森氏菌为:103CFU/mL。
　　 本研究比较了6种人工污染灭菌奶中模板DNA提取方法,从6种方法中,选取了一种快捷、有效的、适用的DNA提取方法。
　　 检测人工污染样品确定检出限,多重PCR方法检测人工污染巴氏杀菌奶中的三种致病菌,沙门氏菌检出限为102CFU/mL、金黄色葡萄球菌检出限为102CFU/mL、小肠结肠炎耶尔森氏菌检出限为102CFU/mL。并且检测可以在6h内完成,大大缩短了检测时间。
　　 对实际样品进行检测,建立的多重PCR检测方法对三种致病菌的敏感性均为100%;特异性:沙门氏菌为95.5%、金黄色葡萄球菌为92.6%、小肠结肠炎耶尔森氏菌为97.4%;符合率:沙门氏菌为96.0%、金黄色葡萄球菌为96.0%、小肠结肠炎耶尔森氏菌为98.0%。
　　 本文建立的多重PCR检测食品病原菌的方法,特异性强、灵敏度高、耗时短、可同时检测三种病原菌,具有一定的推广应用价值。