四种病原菌的xMAP液态芯片多重快速检测技术的研究

摘要

小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)是三种重要的食源性致病菌，引起人和动物的食物中毒在我国非常普遍。鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)引起的鼠疫是一种严重危害人类健康的自然疫源性烈性传染病。近年来，这四种病原菌引起人畜不同类型疾病的流行有逐年加重趋势，对人类健康和畜牧业的发展造成严重威胁。鉴于上述四种病原菌对人类健康和公共卫生安全的危害性，世界各国都加强了对该类致病菌检测方法的研究。目前，xMAP液态芯片技术已被广泛应用于各研究领域，但在国内的发展还刚刚起步。本研究即采用该方法对上述4种病原菌开展多重、快速鉴别和定量检测技术的研究，以建立一种多重、快速、特异性好、灵敏度高的病原微生物检测方法。该方法不仅可以为实验室研究及临床检验提供新的方法，同时对有效预防和控制感染性疾病的发生、食品安全控制、食源性疾病的监测、临床诊断及有效治疗也有着很重要的指导意义。 根据GenBank发表的小肠结肠炎耶尔森氏菌、单核细胞增生性李斯特菌、产气荚膜梭菌、鼠疫耶尔森氏菌基因序列，分别针对各病原菌的特异性ail、hly、cpe、3a基因设计多条长片段寡核苷酸引物，通过重叠PCR的方法获得大小分别为555 bp、591 bp、450bp和330 bp的目的片段，将其分别克隆到pGEM-T或pMD18-T载体，然后转化宿主菌DH5α，经PCR鉴定和酶切鉴定筛选出阳性克隆，通过序列测定分析判断目的基因是否正确插入克隆载体。针对已合成的各目的片段，分别设计1对引物和1条探针，利用构建的质粒DNA作为模板，通过单重和多重PCR对4基因进行扩增，并优化PCR反应条件，然后采用xMAP液态芯片技术进行检测。在此基础上，再进行病原菌基因组DNA的xMAP液态芯片单重和多重检测，并验证该方法的特异性和敏感性。 成功构建了4种病原菌的克隆重组质粒，建立4种病原菌待检模板的多重PCR制备方法，并获得4种病原菌的特异性核酸探针。xMAP液态芯片对质粒DNA和病原菌基因组DNA的检测结果与多重PCR结果一致。该方法能在3.5 h内，在单管中通过一次反应，同时完成对4种病原菌的检测，特异性好，敏感性高。在4种病原菌基因组DNA的单重检测中，对鼠疫耶尔森氏菌检测的灵敏度最高为30 CFU/ml：在4种病原菌基因组DNA的多重检测中，对单核细胞增生李斯特菌检测的灵敏度最高达到20CFU/ml。实验通过初步研究，最终获得4种食源性致病菌的诊断微球，成功建立基于特异性核酸探针的多重、快速甄别和定量检测病原微生物的新方法。 本研究所建立的xMAP液态芯片方法在上述4种病原菌的快速甄别和多重检测上是切实可行的，具有较高的应用价值。结果表明，该方法不仅具有多重检测、特异性和灵敏度高、重复性好的优点，同时也具有经济的进行病原诊断、样本所需量小等特点，与传统的检测方法相比具有明显的优势，因此容易被接受并值得在临床诊断中推广。xMAP液态芯片技术为病原微生物的多重快速检测提供了新方法，它也一定会成为今后生物学研究领域中一种重要的分析检测方法，具有很好的应用价值和前景。

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论文说明：缩略词表

声明

第一章食源性致病菌的研究进展

1.1病原的基本特征

1.1.1产气荚膜梭菌

1.1.2鼠疫耶尔森菌

1.1.3小肠结肠炎耶尔森菌

1.1.4单增李斯特菌

1.2流行的历史和危害

1.2.1产气荚膜梭菌

1.2.2鼠疫耶尔森氏菌

1.2.3小肠结肠炎耶尔森菌

1.2.4单增李斯特菌

第二章病原微生物检测方法的研究进展

2.1常规生物学试验

2.1.1传统分离培养法

2.1.2平板计数法和最大可能数法

2.2清学检测技术

2.2.1补体结合试验

2.2.2酶联免疫吸附试验

2.2.3间接血凝试验

2.2.4中和试验

2.3分子生物学检测方法

2.3.1聚合酶链式反应

2.3.2多重PCR

2.3.3实时荧光定量PCR

2.3.4巢式PCR

2.3.5其它PCR衍生技术

2.3.6核酸探针检测技术

2.3.7核苷酸序列分析

2.3.8指纹图谱分析技术

2.3.9生物芯片技术

2.4 xMAP液态芯片技术

2.4.1 xMAP液态芯片基本原理

2.4.2 xMAP液态芯片的技术优势

2.4.3液态芯片技术的应用

2.4.4 xMAP液态芯片技术存在的问题

2.4.5前景和展望

2.5本研究的主要内容及目的意义

第三章4种病原菌特异性基因质粒DNA的构建

3.1材料

3.1.1菌种和载体

3.1.2主要试剂和耗材

3.1.3主要仪器与设备

3.1.4主要试剂及培养基的配制

3.2方法

3.2.1引物的设计与合成

3.2.2重叠PCR扩增

3.2.3 PCR扩增产物的鉴定

3.2.4重叠PCR产物的纯化回收

3.2.5目的片段与载体的连接

3.2.6感受态细胞的制备

3.2.7连接产物的转化

3.2.8菌落PCR鉴定

3.2.9阳性克隆的菌种保存

3.2.10碱裂解法小量提取质粒

3.2.11重组质粒的PCR鉴定

3.2.12重组质粒的酶切鉴定

3.2.13重组质粒的序列测定

3.3结果

3.3.1重叠PCR扩增结果

3.3.2菌落PCR鉴定结果

3.3.3重组质粒的PCR鉴定结果

3.3.4重组质粒的酶切鉴定结果

3.3.5重组质粒的序列分析

3.4讨论

3.5 小结

第四章4种病原菌特异性基因质粒DNA及基因DNA的XMAP液态芯片检测

4.1材料

4.1.1菌株

4.1.2主要仪器设备

4.1.3主要耗材

4.1.4工具酶及主要试剂

4.1.5主要溶液和培养基的配制

4.2方法

4.2.1引物的设计与合成

4.2.2 DNA模板的制备

4.2.3单重PCR扩增

4.2.4多重PCR扩增

4.2.5探针与微球的耦联

4.2.6探针交联效率的验证

4.2.7杂交并检测

4.2.8特异性试验

4.2.9敏感性试验

4.3结果

4.3.1对质粒DNA的单重和多重PCR扩增

4.3.2对4种病原菌基因组DNA的单重和多重PCR扩增

4.3.3 xMAP液态芯片对重组质粒DNA的单重和多重检测结果

4.3.4 xMAP液态芯片对4种病原菌基因组DNA的单重和多重检测结果

4.3.5特异性试验

4.3.6敏感性试验

4.4讨论

4.5 小结

结论

参考文献

致谢

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