利用乳酸链球菌素发酵废液作部分氮源发酵生产凝乳酶的方法

摘要

利用乳酸链球菌素发酵废液作部分氮源发酵生产凝乳酶的方法，它涉及一种微生物发酵生产凝乳酶的方法。本发明解决了目前微生物发酵生产凝乳酶的成本高，乳酸链球菌素的发酵废液直接排放污染环境的问题。本方法：一、培养基的配制；二、米黑根毛霉种子液的制备；三、将米黑根毛霉种子液接种到三角瓶中；四、于37～38℃条件下培养96h，即得到凝乳酶。本发明做到了废物利用，减少了乳酸链球菌素发酵废液直接排放对环境造成的污染，降低了发酵生产凝乳酶的成本。应用于微生物发酵领域。

说明书

技术领域

本发明涉及一种微生物发酵生产凝乳酶的方法。

背景技术

凝乳酶属于酸性蛋白酶，又称天冬氨酸蛋白酶，是生产干酪不可缺少的制剂。凝乳酶的传统来源是哺乳期期小牛的皱胃，动物凝乳酶及其凝乳活力与蛋白水解能力的高比值成为制作奶酪的首选酶，但是动物生长缓慢且价格昂贵，容易增加企业成本，并且从动物中提取酶液程序和工艺较复杂。木瓜、无花果、菠萝、难关、合欢树、银杏等植物中都含有能使乳凝固的蛋白酶，但植物来源的凝乳酶因有太高的蛋白水解活力或本身有毒，因此很多植物性凝乳酶没有得到大规模商业化应用。

微生物凝乳酶来源广泛，目前发现有40余种微生物可发酵生产凝乳酶，这些微生物主要是放线菌、细菌和真菌等，由于微生物发酵的方法控制容易，成本低，且安全无毒，而被广泛使用。目前微生物发酵生产凝乳酶的氮源主要来自大豆组织蛋白和玉米粉，生产成本较高。

乳酸链球菌素的发酵废液中含有丰富的氮源。将乳酸链球菌素的发酵废液直接排放会对环境造成污染，排入污水处理池也会增加处理的难度。

发明内容

本发明是为了解决目前微生物发酵生产凝乳酶的成本高，乳酸链球菌素的发酵废液直接排放污染环境的问题，提供一种利用乳酸链球菌素发酵废液作部分氮源发酵生产凝乳酶的方法。

本发明利用乳酸链球菌素发酵废液作部分氮源发酵生产凝乳酶的方法，按以下步骤进行：一、培养基的配制：将NaH₂PO₄、Na₂HPO₄、葡萄糖、高温淀粉酶、吐温80、玉米粉、玉米淀粉、乳酸链球菌素发酵废液和大豆组织蛋白溶解于水中配制培养基，其中NaH₂PO₄：3.25g/L，Na₂HPO₄：3.11g/L，葡萄糖：2.14g/L，高温淀粉酶：20g/L，吐温80：0.13g/L，玉米粉：30～80g/L，玉米淀粉：0～30g/L，乳酸链球菌素发酵废液：150～700g/L，大豆组织蛋白：0～20g/L；用质量浓度为5％～6％的氢氧化钠调pH至6.7～6.8，在0.14MPa压力下灭菌30min；二、米黑根毛霉种子液的制备：将米黑根毛霉按体积比4％的接种量接种到种子培养基中，于37～38℃条件下摇床培养20～24h，摇床的转速为260rpm；三、接种：将步骤一中配制好的培养基装入250ml的三角瓶中，将米黑根毛霉种子液按体积比2.5％的接种量接种到三角瓶中；四、培养：将三角瓶于37～38℃条件下放在摇床上培养，摇床的转速为260～280rpm，培养96小时，即得到凝乳酶；步骤一中玉米粉的含氮量为1.075％(质量)，乳酸链球菌素发酵废液的含氮量为0.24％(质量)，大豆组织蛋白的含氮量为8％(质量)；步骤二中制得的米黑根毛霉种子液的霉菌数为2～6×10⁶cfu/ml；步骤三中培养基的装入量为三角瓶体积的20％。

本发明利用乳酸链球菌素发酵废液作部分氮源来生产凝乳酶，做到了废物利用，减少了乳酸链球菌素发酵废液直接排放对环境造成的污染，降低了发酵生产凝乳酶的成本。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式利用乳酸链球菌素发酵废液作部分氮源发酵生产凝乳酶的方法，按以下步骤进行：一、培养基的配制：将NaH₂PO₄、Na₂HPO₄、葡萄糖、高温淀粉酶、吐温80、玉米粉、玉米淀粉、乳酸链球菌素发酵废液和大豆组织蛋白溶解于水中配制培养基，其中NaH₂PO₄：3.25g/L，Na₂HPO₄：3.11g/L，葡萄糖：2.14g/L，高温淀粉酶：20g/L，吐温80：0.13g/L，玉米粉：30～80g/L，玉米淀粉：0～30g/L，乳酸链球菌素发酵废液：150～700g/L，大豆组织蛋白：0～20g/L；用质量浓度为5％～6％的氢氧化钠调pH至6.7～6.8，在0.14MPa压力下灭菌30min；二、米黑根毛霉种子液的制备：将米黑根毛霉按体积比4％的接种量接种到种子培养基中，于37～38℃条件下摇床培养20～24h，摇床的转速为260rpm；三、接种：将步骤一中配制好的培养基装入250ml的三角瓶中，将米黑根毛霉种子液按体积比2.5％的接种量接种到三角瓶中；四、培养：将三角瓶于37～38℃条件下放在摇床上培养，摇床的转速为260～280rpm，培养96小时，即得到凝乳酶；步骤一中玉米粉的含氮量为1.075％(质量)，乳酸链球菌素发酵废液的含氮量为0.24％(质量)，大豆组织蛋白的含氮量为8％(质量)；步骤二中制得的米黑根毛霉种子液的霉菌数为2～6×10⁶cfu/ml；步骤三中培养基的装入量为三角瓶体积的20％。

本实施方式步骤二中的种子培养基由NaH₂PO₄、Na₂HPO₄、葡萄糖、高温淀粉酶、吐温80、玉米粉、大豆组织蛋白和水组成；其中NaH₂PO₄：3.25g/L，Na₂HPO₄：3.11g/L，葡萄糖：2.14g/L，高温淀粉酶：20g/L，吐温80：0.13g/L，玉米粉：70g/L，大豆组织蛋白：18g/L；用质量浓度为5％～6％的氢氧化钠调pH至6.7～6.8，在0.14MPa压力下灭菌30min。

本实施方式步骤二中的米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏编号为AS 3.4960。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中加入的玉米粉浓度为35～70g/L。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：步骤一中加入的玉米粉浓度为50～60g/L。其它与具体实施方式一或二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤一中加入的玉米淀粉浓度为5～25g/L。其它与具体实施方式一至三之一相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：步骤一中加入的玉米淀粉浓度为10～20g/L。其它与具体实施方式一至四之一相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤一中加入的玉米淀粉浓度为26.25g/L。其它与具体实施方式一至五之一相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是：步骤一中加入的乳酸链球菌素发酵废液浓度为200～600g/L。其它与具体实施方式一至六之一相同。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是：步骤一中加入的乳酸链球菌素发酵废液浓度为300～500g/L。其它与具体实施方式一至七之一相同。

具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至八之一不同的是：步骤一中加入的乳酸链球菌素发酵废液浓度为160g/L。其它与具体实施方式一至八之一相同。

具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一至九之一不同的是：步骤一中加入的乳酸链球菌素发酵废液浓度为480g/L。其它与具体实施方式一至九之一相同。

具体实施方式十一：本实施方式与具体实施方式一至十之一不同的是：步骤一中加入的大豆组织蛋白浓度为5～15g/L。其它与具体实施方式一至十之一相同。

具体实施方式十二：本实施方式与具体实施方式一至十一之一不同的是：步骤一中加入的大豆组织蛋白浓度为10g/L。其它与具体实施方式一至十一之一相同。

具体实施方式十三：本实施方式与具体实施方式一至十二之一不同的是：步骤一中加入的大豆组织蛋白浓度为3.6g/L。其它与具体实施方式一至十二之一相同。

具体实施方式十四：本实施方式与具体实施方式一至十三之一不同的是：步骤一中加入的大豆组织蛋白浓度为9g/L。其它与具体实施方式一至十三之一相同。

具体实施方式十五：本实施方式与具体实施方式一至十四之一不同的是：步骤一中加入的大豆组织蛋白浓度为18g/L。其它与具体实施方式一至十四之一相同。

具体实施方式十六：本实施方式与具体实施方式一至十五之一不同的是：步骤四中摇床的转速为270rpm。其它与具体实施方式一至十五之一相同。

具体实施方式十七：本实施方式利用乳酸链球菌素发酵废液作部分氮源发酵生产凝乳酶的方法，按以下步骤进行：一、培养基的配制：将NaH₂PO₄、Na₂HPO₄、葡萄糖、高温淀粉酶、吐温80、玉米粉和乳酸链球菌素发酵废液溶解于水中配制培养基，其中NaH₂PO₄：3.25g/L，Na₂HPO₄：3.11g/L，葡萄糖：2.14g/L，高温淀粉酶：20g/L，吐温80：0.13g/L，玉米粉：70g/L，乳酸链球菌素发酵废液：600g/L；用质量浓度为5％～6％的氢氧化钠调pH至6.7～6.8，在0.14MPa压力下灭菌30min；二、米黑根毛霉种子液的制备：将米黑根毛霉按体积比4％的接种量接种到种子培养基中，于37～38℃条件下摇床培养20～24h，摇床的转速为260rpm；三、接种：将步骤一中配制好的培养基装入250ml的三角瓶中，将米黑根毛霉种子液按体积比2.5％的接种量接种到三角瓶中；四、培养：将三角瓶于37～38℃条件下放在摇床上培养，摇床的转速为260rpm，培养96小时，即得到凝乳酶；步骤一中玉米粉的含氮量为1.075％(质量)，乳酸链球菌素发酵废液的含氮量为0.24％(质量)，大豆组织蛋白的含氮量为8％(质量)；步骤二中制得的米黑根毛霉种子液的霉菌数为2～6×10⁶cfu/ml；步骤三中培养基的装入量为三角瓶体积的20％。

本实施方式制备的凝乳酶经检测活力为53IMCU/ml。

具体实施方式十八：本实施方式利用乳酸链球菌素发酵废液作部分氮源发酵生产凝乳酶的方法，按以下步骤进行：一、培养基的配制：将NaH₂PO₄、Na₂HPO₄、葡萄糖、高温淀粉酶、吐温80、玉米粉、乳酸链球菌素发酵废液和大豆组织蛋白溶解于水中配制培养基，其中NaH₂PO₄：3.25g/L，Na₂HPO₄：3.11g/L，葡萄糖：2.14g/L，高温淀粉酶：20g/L，吐温80：0.13g/L，玉米粉：70g/L，乳酸链球菌素发酵废液：480g/L，大豆组织蛋白：3.6g/L；用质量浓度为5％～6％的氢氧化钠调pH至6.7～6.8，在0.14MPa压力下灭菌30min；二、米黑根毛霉种子液的制备：将米黑根毛霉按体积比4％的接种量接种到种子培养基中，于37～38℃条件下摇床培养20～24h，摇床的转速为260rpm；三、接种：将步骤一中配制好的培养基装入250ml的三角瓶中，将米黑根毛霉种子液按体积比2.5％的接种量接种到三角瓶中；四、培养：将三角瓶于37～38℃条件下放在摇床上培养，摇床的转速为270rpm，培养96小时，即得到凝乳酶；步骤一中玉米粉的含氮量为1.075％(质量)，乳酸链球菌素发酵废液的含氮量为0.24％(质量)，大豆组织蛋白的含氮量为8％(质量)；步骤二中制得的米黑根毛霉种子液的霉菌数为2～6×10⁶cfu/ml；步骤三中培养基的装入量为三角瓶体积的20％。

本实施方式制备的凝乳酶经检测活力为75IMCU/ml。

具体实施方式十九：本实施方式利用乳酸链球菌素发酵废液作部分氮源发酵生产凝乳酶的方法，按以下步骤进行：一、培养基的配制：将NaH₂PO₄、Na₂HPO₄、葡萄糖、高温淀粉酶、吐温80、玉米粉、乳酸链球菌素发酵废液和大豆组织蛋白溶解于水中配制培养基，其中NaH₂PO₄：3.25g/L，Na₂HPO₄：3.11g/L，葡萄糖：2.14g/L，高温淀粉酶：20g/L，吐温80：0.13g/L，玉米粉：70g/L，乳酸链球菌素发酵废液：300g/L，大豆组织蛋白：9g/L；用质量浓度为5％～6％的氢氧化钠调pH至6.7～6.8，在0.14MPa压力下灭菌30min；二、米黑根毛霉种子液的制备：将米黑根毛霉按体积比4％的接种量接种到种子培养基中，于37～38℃条件下摇床培养20～24h，摇床的转速为260rpm；三、接种：将步骤一中配制好的培养基装入250ml的三角瓶中，将米黑根毛霉种子液按体积比2.5％的接种量接种到三角瓶中；四、培养：将三角瓶于37～38℃条件下放在摇床上培养，摇床的转速为260rpm，培养96小时，即得到凝乳酶；步骤一中玉米粉的含氮量为1.075％(质量)，乳酸链球菌素发酵废液的含氮量为0.24％(质量)，大豆组织蛋白的含氮量为8％(质量)；步骤二中制得的米黑根毛霉种子液的霉菌数为2～6×10⁶cfu/ml；步骤三中培养基的装入量为三角瓶体积的20％。

本实施方式制备的凝乳酶经检测活力为93IMCU/ml。

具体实施方式二十：本实施方式利用乳酸链球菌素发酵废液作部分氮源发酵生产凝乳酶的方法，按以下步骤进行：一、培养基的配制：将NaH₂PO₄、Na₂HPO₄、葡萄糖、高温淀粉酶、吐温80、玉米粉、玉米淀粉、乳酸链球菌素发酵废液和大豆组织蛋白溶解于水中配制培养基，其中NaH₂PO₄：3.25g/L，Na₂HPO₄：3.11g/L，葡萄糖：2.14g/L，高温淀粉酶：20g/L，吐温80：0.13g/L，玉米粉：35g/L，玉米淀粉：26.25g/L，乳酸链球菌素发酵废液：160g/L，大豆组织蛋白：18g/L；用质量浓度为5％～6％的氢氧化钠调pH至6.7～6.8，在0.14MPa压力下灭菌30min；二、米黑根毛霉种子液的制备：将米黑根毛霉按体积比4％的接种量接种到种子培养基中，于37～38℃条件下摇床培养20～24h，摇床的转速为260rpm；三、接种：将步骤一中配制好的培养基装入250ml的三角瓶中，将米黑根毛霉种子液按体积比2.5％的接种量接种到三角瓶中；四、培养：将三角瓶于37～38℃条件下放在摇床上培养，摇床的转速为280rpm，培养96小时，即得到凝乳酶；步骤一中玉米粉的含氮量为1.075％(质量)，乳酸链球菌素发酵废液的含氮量为0.24％(质量)，大豆组织蛋白的含氮量为8％(质量)；步骤二中制得的米黑根毛霉种子液的霉菌数为2～6×10⁶cfu/ml；步骤三中培养基的装入量为三角瓶体积的20％。

本实施方式制备的凝乳酶经检测活力为97.5IMCU/ml。